技术领域
本发明属于DNA分子标记技术领域，涉及InDel标记技术，具体涉及一种矮秆波兰小麦的InDel标记及鉴定方法和应用。
背景技术
株高是影响植物倒伏、收获指数以及产量的重要农艺性状。在小麦中，至今发现25个矮化基因(30个等位位点)，其中9个来源于四倍体小麦。来源于我国新疆吐鲁番的矮秆波兰小麦(Dwarf Polish Wheat,2n＝4x＝28,AABB,Triticum polonicum L.)携带一个隐性矮化基因Rht-dp。该基因位于4BS染色体，与4BS上已有的矮化基因Rht-B1非等位，前人将该基因初定位在4BS染色体上，但其遗传距离较大，不利于该基因的图位克隆。
小麦植株高矮是决定小麦产量的重要因素之一，在小麦的育种过程中，不断发现和利用矮秆基因使得世界小麦产量得到了进一步增加。因此，矮秆基因的不断探索、挖掘、鉴定、研究和利用，对小麦高产育种意义重大。
发明内容
本发明的目的是提供一种矮秆波兰小麦的InDel标记及鉴定方法和应用，该标记能够在苗期就快速区分波兰小麦的植株高矮，为小麦株高改良的育种工作提供了指导。
为了达到上述目的，本发明提供了一种矮秆波兰小麦的InDel标记，该InDel标记是对矮秆波兰小麦基因组核苷酸序列中第109位到第116位核苷酸之间的核苷酸序列-ATGCACTG-进行标记。
本发明还提供了一种矮秆波兰小麦InDel标记的核苷酸序列，该核苷酸序列处于矮秆波兰小麦基因组核苷酸序列中第109位到第116位核苷酸之间，其包含：序列-ATGCACTG-。
本发明还提供了核苷酸序列在鉴定波兰小麦株高的应用，所述的核苷酸序列包含：序列-ATGCACTG-，通过InDel标记该核苷酸序列以鉴定波兰小麦的株高。
优选地，在所述的InDel标记中，PCR扩增采用的上游引物包含如SED ID NO.1所示的核苷酸序列，采用的下游引物包含如SED ID NO.2所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种InDel标记的上下游引物，上游引物包含如SED ID NO.1所示的核苷酸序列，下游引物包含如SED ID NO.2所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种InDel标记核苷酸序列鉴定波兰小麦株高的方法，该方法包含：
(1)提取波兰小麦DNA；
(2)PCR扩增：采用的上游引物包含如SED ID NO.1所示的核苷酸序列，采用的下游引物包含如SED ID NO.2所示的核苷酸序列；
(3)扩增DNA片段检测分析：当扩增产物含有大小为110bp的片段时，小麦为矮秆波兰小麦；当扩增产物含有大小为102bp的片段时，小麦为高秆波兰小麦；当扩增产物为杂合带型时，小麦为高秆波兰小麦。
其中，所述的矮秆波兰小麦基因中含有核苷酸序列-ATGCACTG-。
优选地，在步骤(1)中，采用CTAB法提取基因组DNA。
优选地，在所述的步骤(3)中，采用扩增DNA片段检测分析变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染进行检测分析。
本发明还提供了一种鉴定波兰小麦株高的试剂盒，该试剂盒包含：具有如SED ID NO.1所示的核苷酸序列的上游引物，和具有如SED ID NO.2所示的核苷酸序列的下游引物。
本发明的矮秆波兰小麦的InDel标记及鉴定方法和应用，具有以下优点：
(1)本发明的通过InDel标记小麦核苷酸序列-ATGCACTG-，鉴定标记的扩增条带特性，判断出植株的表型是高秆和矮秆，通过田间统计的株高数据，对于高矮秆植株株高的临界值(106cm)进行划分，用于指导小麦株高改良的育种工作；
(2)本发明的分子标记不仅在苗期就能区分植株高矮秆，而且对于目标基因的定位有很大的帮助，极大的降低了劳动成本、节约了时间并且不受环境及人为因素的影响。
附图说明
图1为本发明实验例3InDel标记在矮秆波兰小麦×高秆波兰小麦F7代重组自交系中的分型结果。
图2为本发明实验例3InDel标记在矮秆波兰小麦×高秆波兰小麦F2代重组自交系中的分型结果。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。
一种矮秆波兰小麦的InDel标记，该InDel标记是对矮秆波兰小麦基因组核苷酸序列中第109位到第116位核苷酸之间的核苷酸序列-ATGCACTG-进行标记。核苷酸序列-ATGCACTG-(名称：4BS-PMT2)作为InDel标记基，用于鉴定波兰小麦株高，当扩增产物含有SED ID NO.1时，该矮秆波兰小麦；当扩增产物不含SED ID NO.1时，小麦为高秆波兰小麦。具体地，当扩增产物的大小为110bp时，小麦为矮秆波兰小麦；当扩增产物的大小为102bp时，小麦为高秆波兰小麦；当扩增产物为杂合带型时，小麦为高秆波兰小麦。
进一步地，在InDel标记中，PCR扩增采用的上游引物包含如SED ID NO.1所示的核苷酸序列，采用的下游引物包含如SED ID NO.2所示的核苷酸序列。
一种鉴定波兰小麦株高的试剂盒，该试剂盒包含：具有如SED ID NO.1所示的核苷酸序列的上游引物，和具有如SED ID NO.2所示的核苷酸序列的下游引物，以对波兰小麦株高进行鉴定。
本发明的InDel标记核苷酸序列鉴定波兰小麦株高的方法，具体如下：
实验例1基因组DNA提取
在幼苗期时，对矮秆波兰小麦×高秆波兰小麦重组自交系(F2和F7代)群体各单株挂牌标明株号并取其嫩叶，F2代编号1-26，F7代编号1-26，放入液氮中迅速冷冻，再放入-70℃超低温冰箱备用。
对上述自交系群体F2和F7代分别提取总基因DNA，具体操作参照Doyle等(1987)的2×CTAB法(CTAB,hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，2×CTAB提取液的组成(1000mL)如下表1：
表1 2×CTAB提取液的组成表
注：EDTA为Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，即乙二胺四乙酸；Tris-HCl为三(羟甲基)氨基甲烷。
基因组DNA提取的步骤，具体如下：
(1)取1～2g幼嫩小麦叶片加液氮并迅速研磨成细粉，置入2mL离心管中加入预热至65℃的等体积2×CTAB缓冲液，加入β-疏基乙醇1μL，轻摇混匀；
(2)65℃水浴1～2h，其间10～15min轻摇混匀一次；
(3)冷却至室温后，加等体积的氯仿-异戊醇(体积比为24:1)，轻轻上下颠倒混匀至上清液呈牛奶状，12000rpm/min离心10min；
(4)取上清液，加入等体积冰冷的异丙醇以沉淀(可提前放置于冰箱或制冰机中)，挑出DNA；
(5)用70％酒精洗，无水乙醇洗，空气中干燥；
(6)按照上表1中的Tris-HCl和EDTA的量配制1×TE(pH 8.0)缓冲液，将步骤(5)干燥的DNA溶于适量的1×TE(pH 8.0)缓冲液以备用；
(7)用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测或用紫外分光光度计检测DNA的浓度和纯度。
实验例2SSR(Simple sequence repeat，简单序列重复)反应
PCR反应的组分和用量，具体如下表2：
表2 PCR反应的组分和用量表
注：2×Taq MasterMix for PAGE购自Vazyme公司。
上下游引物，具体如下表3：
表3上下游引物序列表
PCR反应程序，具体如下表4：
实验例3变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染
(1)药品配制
8％聚丙烯酰胺PA：尿素420.42g、Acr(acrylamide，丙烯酰胺)80g、Bis(bisacrylamide，双丙烯酰胺)4.212g、10*TBE(Tris硼酸)100mL。
10×TBE(2L)：Tris-base 216g，硼酸110g，EDTA-Na 214.88g，加超纯水定容至1L。
Binding(亲和硅烷)：无水乙醇2mL，Binding原液8μL，冰醋酸8μL。
Repel(剥离硅烷)：三氯甲烷100mL，Repel 2mL。
银染液：蒸馏水1500mL，无水乙醇150mL，硝酸银溶液(1g/mL)1500uL。
显影液：蒸馏水1500mL，氢氧化钠30g，甲醛6mL，硫代硫酸(10mg/mL)300μL。
(2)洗板和擦板
电泳槽板先用无水乙醇擦一遍，5min后用配制的剥离硅烷(repel，4度保存，使电泳槽与胶分离)溶液涂抹均匀，放置15～30min。
将玻板先用抹布蘸少许洗洁精在自来水下洗净，再用无水乙醇擦一遍，5分钟后用新鲜配制的溶液涂抹均匀，放置15～30min；如为用过的玻板，则先用NaOH溶液(1瓶加约25L水，可反复使用)浸泡1-2天，直至废胶脱落，再进行上述清洗。
(3)装板
玻板在下，电泳槽板在上，中间放两根压条(涂抹repel和binding的面相互靠近)，对齐后用三对夹子将波板与电泳槽板夹紧。
(4)灌胶
用针筒吸取凝胶混合液，缓慢均匀的从灌胶口将胶灌入，灌好后取下靠近灌胶口的夹子，倒插入梳子，注意不要起汽泡，插好后，再夹上夹子；凝胶需要1～2(30min)个小时；
(5)预电泳(主要是使凝胶的温度达到一定高度)
取下夹子，拔出倒插的梳子，在自来水下将灌胶口冲洗干净，放入电泳槽，卡紧，灌入缓冲液，上下槽各300mL左右，上下槽用一样的缓冲液(即1×TBE)注意用夹子夹紧上槽排放缓冲液的胶管；80W衡功率电泳半小时。
(6)点样
用吸管吹干净灌胶口的废胶，将梳子顺插入灌胶口，再用吸管将每个梳孔吹干净，开始点样，注意不要串样，梳齿不要将胶面弄坏。
(7)电泳
80W衡功率电泳1h左右(电压可能达到1100V-2000V，若太高则有可能配错，将功率调低，以免温度过高，玻璃板裂开)。
(8)银染
将板子置于银染液15min。
(9)水洗
用蒸馏水洗3到4s(主要是冲去银离子，免得遇光变黑，需5～8s)。
(10)显影
将板子置于显影液中10～15min，直至条带清晰。
(11)水洗
自来水冲水洗银染板，将NaOH洗掉(若不冲去NaOH，它会使凝胶氧化变黑)。
结果统计：
如图1所示，为本发明实验例3InDel标记在矮秆波兰小麦×高秆波兰小麦F7代重组自交系中的分型结果，如图2所示，为本发明实验例3InDel标记在矮秆波兰小麦×高秆波兰小麦F2代重组自交系中的分型结果，其中，Marker为pUC19DNA/Msp I(HpaII)Marker(购自thermo-金蓉诚，品牌/型号Thermo Fermentas-金蓉诚/SM0222)。标记4BS-PMT2，扩增产物中能扩增出102bp片段，说明该植株为高秆波兰小麦，如果能扩增出110bp片段，说明该植株为矮秆波兰小麦，如果扩增出杂合带型，说明该植株为高秆波兰小麦，进行统计对F2和F7分型和实际生长情况进行统计，如下表5所示，为本发明的F2代编号1-26的株高统计表，如下表6所示，为本发明的F7代编号1-26的株高统计表，将检测结果和株高进行对应，发现一致，表明本发明的方法的鉴别率为100％。
表5本发明的F2代编号1-26的株高统计表
表6本发明的F7代编号1-26的株高统计表
F7代编号 株高(cm) 1 142.73 2 120.83 3 124.53 4 121.00 5 79.30 6 82.60 7 129.73 8 82.97 9 134.87 10 135.13 11 87.67 12 72.53 13 87.50 14 84.20 15 134.37 16 79.67 17 133.80 18 134.97 19 129.87 20 86.27 21 96.03 22 91.50 23 134.67 24 123.20 25 130.60 26 134.50
综上所述，本发明的矮秆波兰小麦的InDel标记及鉴定方法和应用，该InDel标记不仅在苗期就能区分植株高矮秆，而且对于目标基因的定位有很大的帮助，极大的降低了劳动成本、节约了时间并且不受环境及人为因素的影响。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
序列表
<110> 四川农业大学小麦研究所
<120> 一种矮秆波兰小麦的InDel标记及鉴定方法和应用
<141> 2018-07-13
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 1
tgaaatataa tggtgagtga 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 2
gatctcactg ctacactc 18