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1、(10)申请公布号 CN 102558295 A (43)申请公布日 2012.07.11 CN 102558295 A *CN102558295A* (21)申请号 201010609806.2 (22)申请日 2010.12.28 C07K 1/36(2006.01) (71)申请人 同路生物制药有限公司 地址 230022 安徽省合肥市绩溪路 230 号 (72)发明人 魏舒 (74)专利代理机构 北京双收知识产权代理有限 公司 11241 代理人 王菊珍 (54) 发明名称 生产 1 抗胰蛋白酶的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种生产 1 抗胰蛋白酶的方 法， 包括 ： 血浆稀释，。
2、 pH7.0 7.5， 加入乙醇， 温 度-1-3， 离子强度0.100.14， 搅拌， 离心， 得到上清 I 和沉淀 I ； 上清 I pH6.4 7.0， 加入 乙醇 18 25， 温度为 -3 -5， 离子强度 0.08 0.10， 搅拌， 离心， 得到上清 II+III 和沉 淀 II+III ； 上清 II+III pH5.0 5.4， 调节乙醇 浓度为 16 19， 温度为 -3 -5， 离子强度 0.06 0.09， 搅拌， 离心， 得到上清 IV-1 和沉淀 IV-1 ； 沉淀IV-1溶解， 温度-23， 调整乙醇浓 度至 8 12， 搅拌， 离心， 过滤取上清 A ； 上清 。
3、A 加入磷酸三丁酯和吐温 -80， 24 26， 孵育 ； 然后加入 PEG4000， pH5.0 5.5 离心， 取上清 B ； 上清 B 加入 PEG4000， pH6.2 6.8， 离心， 取沉淀 ； 沉淀溶解， 进行弱阴离子交换层析， 洗脱液超滤， 巴氏灭活， 除菌过滤， 冻干， 干热灭活， 得到 1 抗 胰蛋白酶粉末。本发明的生产 1 抗胰蛋白酶的 方法生产的 1 抗胰蛋白酶产率高、 纯度高。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 1/1 页 2 1. 生产 1 抗胰。
4、蛋白酶的方法， 包括如下步骤 ： 血浆加入生理盐水进行稀释， 调整 pH 7.0 7.5， 加入乙醇至乙醇浓度为 8 10， 维持温度 -1 -3， 离子强度 0.10 0.14， 搅拌， 离心， 得到上清 I 和沉淀 I ； 上清I调整pH6.47.0， 加入乙醇至乙醇浓度为1825， 维持温度为-3-5， 离子强度 0.08 0.10， 搅拌， 离心， 得到上清 II+III 和沉淀 II+III ； 上清 II+III 调整 pH5.0 5.4， 调整乙醇浓度为 16 19， 维持温度为 -3 -5， 离子强度 0.06 0.09， 搅拌， 离心， 得到上清 IV-1 和沉淀 IV-1 。
5、； 沉淀 IV-1 用缓冲液溶解， 温度 -2 3， 加入冷乙醇至乙醇浓度为 8 12， 搅拌， 离心， 过滤取上清 A ； 上清 A 加入磷酸三丁酯和吐温 -80， 磷酸三丁酯浓度为 0.3， 吐温 -80 浓度为 1， 24 26， 孵育 ； 然后加入 PEG4000 至其浓度为 10 15， 调整 pH5.0 5.5 离心， 取上 清 B ； 上清 B 加入 PEG4000 至其浓度为 25 30， 调整 pH6.2 6.8， 离心， 取沉淀 ； 沉淀用磷酸盐缓冲液溶解， 进行弱阴离子交换层析， 用 0.01 0.04M pH6.2 6.8 磷 酸盐缓冲液洗涤， 再用0.10.3M pH。
6、6.26.8磷酸盐缓冲液洗脱， 洗脱液超滤， 巴氏灭活， 除菌过滤， 冻干， 干热灭活， 得到 1 抗胰蛋白酶粉末。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 所述缓冲液为 pH8.0 8.6Tris 缓冲液。 权 利 要 求 书 CN 102558295 A 2 1/4 页 3 生产 1 抗胰蛋白酶的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种生产 1 抗胰蛋白酶的方法。 背景技术 0002 1抗胰蛋白酶是一种大约分子量为52000-55000道尔顿(Da)的糖蛋白。 此蛋白 是由几个寡核苷酸共价连接的单链蛋白， 它是一种内源性蛋白酶抑制剂， 例如胰蛋白酶、 糜 蛋白酶、 胰弹性蛋白。
7、酶、 血管紧张肽原酶、 皮肤胶原蛋白酶、 脲激酶和分叶核淋巴细胞蛋白 酶。 0003 近来应用1抗胰蛋白酶治疗由于1抗胰蛋白酶缺陷引起的遗传性疾病和后天 获得性 1 抗胰蛋白酶缺陷性疾病。给予 1 抗胰蛋白酶能有效地抑制肺中淋巴细胞弹性 蛋白酶。淋巴细胞弹性蛋白酶能破坏肺的外源蛋白。当 1 抗胰蛋白酶缺失时， 不能很好 地调节弹性蛋白酶的活性， 使弹性蛋白酶就破坏肺组织导致肺组织损伤引起肺气肿， 1 抗 胰蛋白酶能成功的用于治疗肺气肿、 慢性气管炎和气管炎等。由于用于治疗的 1 抗胰蛋 白酶基本上是来源人血浆， 原料来源有限， 为了最大地满足临床病人的需求， 应最大可能地 提高血浆来源的 1 。
8、抗胰蛋白酶产率， 同时也要严格要求纯度。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种 1 抗胰蛋白酶产率高、 纯度高的生产 1 抗胰蛋白酶 的方法。 0005 本发明所提供的生产 1 抗胰蛋白酶的方法， 包括如下步骤 ： 0006 血浆加入生理盐水进行稀释， 调整 pH7.0 7.5， 加入乙醇至乙醇浓度为 8 10， 维持温度 -1 -3， 离子强度 0.10 0.14， 搅拌， 离心， 得到上清 I 和沉淀 I ； 0007 上清 I 调整 pH6.4 7.0， 加入乙醇至乙醇浓度为 18 25， 维持温度 为 -3 -5， 离子强度 0.08 0.10， 搅拌， 离心， 得到上清 II+。
9、III 和沉淀 II+III ； 0008 上 清 II+III 调 整 pH5.0 5.4， 调 整 乙 醇 浓 度 为 16 19 ， 维 持 温 度 为 -3 -5， 离子强度 0.06 0.09， 搅拌， 离心， 得到上清 IV-1 和沉淀 IV-1 ； 0009 沉淀IV-1用缓冲液溶解， 温度-23， 加入冷乙醇至乙醇浓度为812， 搅 拌， 离心， 过滤取上清 A ； 0010 上清 A 加入磷酸三丁酯和吐温 -80， 磷酸三丁酯浓度为 0.3， 吐温 -80 浓度为 1， 24 26， 孵育 ； 然后加入 PEG4000 至其浓度为 10 15， 调整 pH5.0 5.5 离心。
10、， 取上清 B ； 0011 上清 B 加入 PEG4000 至其浓度为 25 30， 调整 pH6.2 6.8， 离心， 取沉淀 ； 0012 沉淀用磷酸盐缓冲液溶解， 进行 DEAE Sepharose fast flow 弱阴离子交换层析， 用 0.01 0.04M pH6.2 6.8 磷酸盐缓冲液洗涤， 再用 0.1 0.3M pH6.2 6.8 磷酸盐 缓冲液洗脱， 洗脱液超滤， 巴氏灭活， 除菌过滤， 冻干， 干热灭活， 得到 1 抗胰蛋白酶粉末。 0013 本发明的生产1抗胰蛋白酶的方法， 其中 ： 所述缓冲液为pH8.08.6Tris缓冲 说 明 书 CN 102558295 。
11、A 3 2/4 页 4 液。 0014 本发明的生产 1 抗胰蛋白酶的方法生产的 1 抗胰蛋白酶平均收率达到 27、 纯度达到 90。 具体实施方式 0015 下述实施例中的百分含量如无特殊说明均为质量百分含量。 0016 实施例 1、 0017 血浆加入 1 倍生理盐水进行稀释， 用 pH4.0 的醋酸 - 醋酸钠缓冲液调整 pH7.2， 搅 拌条件下加入乙醇至乙醇浓度为8， 维持温度为-1， 离子强度0.14， 持续搅拌2小时， 离 心， 得到上清 I 和沉淀 I ； 0018 上清I用pH4.0的醋酸-醋酸钠缓冲液调整pH6.7， 搅拌条件下加入乙醇至乙醇浓 度为25维持温度为-5， 离。
12、子强度0.09， 持续搅拌2小时， 离心， 得到上清II+III和沉淀 II+III ； 0019 上清 II+III 用 pH4.0 的醋酸 - 醋酸钠缓冲液调整 pH5.2， 搅拌条件下加入生理盐 水调整乙醇浓度为18， 维持温度为-4， 离子强度0.09， 持续搅拌2小时， 离心， 得到上清 IV-1 和沉淀 IV-1 ； 0020 沉淀 IV-1 用 pH8.0Tris 缓冲液溶解， 温度 -2， 加入冷乙醇至乙醇浓度为 12， 离心， 过滤取上清 A ； 0021 上清 A 加入磷酸三丁酯和吐温 -80， 磷酸三丁酯的终浓度为 0.3， 吐温 -80 的终 浓度为1， 2426， 孵。
13、育6小时 ； 然后加入PEG4000至其浓度为12， 调整pH5.1， 离心， 取上清 B ； 0022 上清 B 加入 PEG4000 至其浓度为 28， 调整 pH6.5， 离心， 取沉淀 ； 0023 沉淀用磷酸盐缓冲液溶解， 进行 DEAE Sepharose fast flow 弱阴离子交换层析， 用0.02MpH6.2磷酸盐缓冲液洗涤， 再用0.1M pH62磷酸盐缓冲液洗脱， 洗脱液超滤， 巴氏灭 活， 除菌过滤， 冻干， 干热灭活， 得到 1 抗胰蛋白酶粉末。 0024 纯化路线各步骤收集物经过SDS-PAGE电泳， 用AlphaEaseFC软件对其进行纯度分 析， 纯度可达到。
14、 90。 0025 蛋白含量采用凯氏定氮法测定含有目的蛋白的蛋白浓度， 并计算蛋白回收率， 结 果如下表 ： 0026 批次 Cohn FIV-1 沉淀 QSFF 层析样品 回收率 0027 (mg) (mg) 0028 1 50.1 13.0 25.9 0029 2 50.2 13.2 26.3 0030 3 50.1 13.4 26.7 0031 实施例 2、 0032 血浆加入 1 倍生理盐水进行稀释， 用 pH4.0 的醋酸 - 醋酸钠缓冲液调整 pH7.0， 搅 拌条件下加入乙醇至乙醇浓度为9， 维持温度为-2， 离子强度0.14， 持续搅拌2小时， 离 心， 得到上清 I 和沉淀 。
15、I ； 0033 上清I用pH4.0的醋酸-醋酸钠缓冲液调整pH6.5， 搅拌条件下加入乙醇至乙醇浓 说 明 书 CN 102558295 A 4 3/4 页 5 度为21维持温度为-3， 离子强度0.08， 持续搅拌2小时， 离心， 得到上清II+III和沉淀 II+III ； 0034 上清 II+III 用 pH4.0 的醋酸 - 醋酸钠缓冲液调整 pH5.0， 搅拌条件下加入生理盐 水调整乙醇浓度为16， 维持温度为-3， 离子强度0.08， 持续搅拌2小时， 离心， 得到上清 IV-1 和沉淀 IV-1 ； 0035 沉淀 IV-1 用 pH8.2Tris 缓冲液溶解， 温度 -1，。
16、 加入冷乙醇至乙醇浓度为 10， 离心， 过滤取上清 A ； 0036 上清 A 加入磷酸三丁酯和吐温 -80， 磷酸三丁酯的终浓度为 0.3， 吐温 -80 的终 浓度为1， 2426， 孵育6小时 ； 然后加入PEG4000至其浓度为11， 调整pH5.3， 离心， 取上清 B ； 0037 上清 B 加入 PEG4000 至其浓度为 26， 调整 pH6.2 离心， 取沉淀 ； 0038 沉淀用磷酸盐缓冲液溶解， 进行 DEAE Sepharose fast flow 弱阴离子交换层析， 用 0.03MpH6.5 磷酸盐缓冲液洗涤， 再用 0.2M pH6.5 磷酸盐缓冲液洗脱， 洗脱液。
17、超滤， 巴氏 灭活， 除菌过滤， 冻干， 干热灭活， 得到 1 抗胰蛋白酶粉末。 0039 纯化路线各步骤收集物经过SDS-PAGE电泳， 用AlphaEaseFC软件对其进行纯度分 析， 纯度可达到 91。 0040 蛋白含量采用凯氏定氮法测定含有目的蛋白的蛋白浓度， 并计算蛋白回收率， 结 果如下表 ： 0041 批次 Cohn FIV-1 沉淀 QSFF 层析样品 回收率 0042 (mg) (mg) 0043 1 60.3 17.0 28.2 0044 2 60.5 16.8 27.8 0045 3 60.1 17.1 28.5 0046 实施例 3、 0047 血浆加入 1 倍生理盐。
18、水进行稀释， 用 pH4.0 的醋酸 - 醋酸钠缓冲液调整 pH7.4， 搅 拌条件下加入乙醇至乙醇浓度为 10， 维持温度为 -3， 离子强度 0.12， 持续搅拌 2 小时， 离心， 得到上清 I 和沉淀 I ； 0048 上清I用pH4.0的醋酸-醋酸钠缓冲液调整pH6.9， 搅拌条件下加入乙醇至乙醇浓 度为20维持温度为-4， 离子强度0.10， 持续搅拌2小时， 离心， 得到上清II+III和沉淀 II+III ； 0049 上清 II+III 用 pH4.0 的醋酸 - 醋酸钠缓冲液调整 pH5.4， 搅拌条件下加入生理盐 水调整乙醇浓度为19， 维持温度为-5， 离子强度0.07。
19、， 持续搅拌2小时， 离心， 得到上清 IV-1 和沉淀 IV-1 ； 0050 沉淀 IV-1 用 pH8.4Tris 缓冲液溶解， 温度 0， 加入冷乙醇至乙醇浓度为 8， 离 心， 过滤取上清 A ； 0051 上清 A 加入磷酸三丁酯和吐温 -80， 磷酸三丁酯的终浓度为 0.3， 吐温 -80 的终 浓度为1， 2426， 孵育6小时 ； 然后加入PEG4000至其浓度为10， 调整pH5.4， 离心， 取上清 B ； 0052 上清 B 加入 PEG4000 至其浓度为 25， 调整 pH6.7， 离心， 取沉淀 ； 说 明 书 CN 102558295 A 5 4/4 页 6 0。
20、053 沉淀用磷酸盐缓冲液溶解， 进行 DEAE Sepharose fast flow 弱阴离子交换层析， 用 0.01MpH6.7 磷酸盐缓冲液洗涤， 再用 0.3M pH6.6 磷酸盐缓冲液洗脱， 洗脱液超滤， 巴氏 灭活， 除菌过滤， 冻干， 干热灭活， 得到 1 抗胰蛋白酶粉末。 0054 纯化路线各步骤收集物经过SDS-PAGE电泳， 用AlphaEaseFC软件对其进行纯度分 析， 纯度达 89。 0055 蛋白含量采用凯氏定氮法测定含有目的蛋白的蛋白浓度， 并计算蛋白回收率， 结 果如下表 ： 0056 批次 Cohn FIV-1 沉淀 QSFF 层析样品 回收率 0057 (mg) (mg) 0058 1 52 13.8 26.5 0059 2 53 14.2 26.8 0060 3 52.6 14.4 27.3 0061 以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述， 并非对本发明的范围进 行限定， 在不脱离本发明设计精神的前提下， 本领域普通工程技术人员对本发明的技术方 案作出的各种变形和改进， 均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。 说 明 书 CN 102558295 A 6 。