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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510489164.X (22)申请日 2015.08.11 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105175547 A (43)申请公布日 2015.12.23 (73)专利权人 广州白云山南方抗肿瘤生物制品 股份有限公司 地址 511495 广东省广州市番禺区钟村街 万宝北街1号办公楼自编105室(仅限 办公用途) (72)发明人 李明松 (74)专利代理机构 北京中济纬天专利代理有限 公司 11429 代理人 张晓霞 (51)Int.Cl. C07K 19。
2、/00(2006.01) C12N 15/62(2006.01) A61K 39/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 35/02(2006.01) (56)对比文件 Pollicino T 等.HBsAg protein Hepatitis B virus. GenBank Database .2006,GenBank： ABF71056.1. 王文敬 等.利用重叠PCR实现乙肝表面抗原 CTL表位的替换. 第三军医大学学报 .2009,第 31卷(第7期),第589-591页. Haigh O 等.Multiple copies of a tumor e。
3、pitope in a recombinant hepatitis B surface antigen (HBsAg) vaccine enhance CTL responses, but not tumor protection. Virology .2007,第368卷(第2期),第365页表 1. 王文敬 等.GPC-3 CTL表位表达载体构建. 南方医科大学学报 .2009,第29卷(第8期),摘 要， 第1549页第1.2-1.5节. 王文敬 等.GPC-3 CTL表位表达载体构建. 南方医科大学学报 .2009,第29卷(第8期),摘 要， 第1549页第1.2-1.5节. 审查员。
4、 余璨 (54)发明名称 替换IPQ表位的重组蛋白及其编码核苷酸 (57)摘要 本发明属于医药生物领域， 具体涉及GPC3- HBsAg重组蛋白及其肿瘤疫苗中的应用。 所述重 组蛋白为重组的乙肝表面抗原(HBsAg)， 具体是 HBsAg内源性CTL表位被其他外源CTL表位替换的 重组蛋白； 所述其他外源CTL表位为GPC3的CTL表 位。 权利要求书1页 说明书8页 序列表32页 CN 105175547 B 2018.12.28 CN 105175547 B 1.一种GPC3-HBsAg重组蛋白， 其以重组的乙肝表面抗原(HBsAg)为分子骨架， 利用外源 CTL表位替换HBsAg内源性C。
5、TL表位； 所述外源CTL表位为GPC3的CTL表位； 所述重组的乙肝表面抗原(HBsAg)的氨基酸序列如SEQ ID NO： 1所示； 所述重组蛋白序列如SEQID NO： 2所示， 其为采用GPC3 CTL表位EYILSLEEL替换HBsAg内 源性CTL表位28-39位氨基酸、 97-105位氨基酸和207-216位氨基酸 得到的重组蛋白。 2.一种编码权利要求1所述GPC3-HBsAg重组蛋白的核苷酸。 3.权利要求1所述GPC3-HBsAg重组蛋白在制备肿瘤疫苗中的应用。 4.权利要求1所述GPC3-HBsAg重组蛋白在制备治疗/预防肿瘤药物中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 C。
6、N 105175547 B 2 替换IPQ表位的重组蛋白及其编码核苷酸 技术领域 0001 本发明属于医药生物领域， 具体涉及GPC3-HBsAg重组蛋白及其编码核苷酸和应 用。 背景技术 0002 磷脂酰肌醇蛋白聚糖(glypican)家族是存在于细胞表面上的硫酸乙酰肝素蛋白 多糖的新家族。 迄今已报告有五种磷脂酰肌醇蛋白聚糖(磷脂酰肌醇蛋白聚糖1， 磷脂酰肌 醇蛋白聚糖2， 磷脂酰肌醇蛋白聚糖3， 磷脂酰肌醇蛋白聚糖4， 和磷脂酰肌醇蛋白聚糖5)是 磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族的成员。 该家族的成员有大小均一(约60kDa)的核心蛋白， 共有特 异、 高度保守的半胱氨酸序列， 并通过糖基磷脂酰肌。
7、醇(GPI)锚定结合到细胞膜上。 0003 Motomura等人发现GPC3在小鼠体内可诱导出GPC3特异性的抗肿瘤免疫， 但GPC3不 会在小鼠体内导致自身免疫疾病的发生。 同时发现， 具有GPC3特异性的杀伤性T细胞(CTL) 可以向表达GPC3的肿瘤组织发生定向迁移， 而不引起自身免疫性的破坏。 因此， GPC3诱导的 特异性CTL定向移动发挥抗肿瘤免疫作用可以作为治疗HCC及黑色瘤的一种可能手段。 并通 过实验证实CTL表位可在小鼠体内被CTL所识别并诱导特异性的细胞免疫， 该发现对以GPC3 为靶点的肿瘤免疫治疗有重要的意义。 0004 HBsAg疫苗与传统的疫苗相比具有如下优点： 。
8、1.无需免疫佐剂， 即能诱导出高效而 特异的细胞免疫和体液免疫； 2.HBsAg本身不能复制， 也无感染性； 3.HBsAg在体外能被大量 扩增， 并易于浓缩和纯化。 上述特点表明， HBsAg具有减毒活病毒疫苗的免疫原性， 但无其缺 点。 以特异性的外源抗原(基因)插入HBsAg或以外源CTL表位替代HBsAg上特异性的内源CTL 表位能否在体内诱导出高效而特异的细胞免疫， 越来越成为疫苗研究的热点。 现已证明， 在 保留其有效的包装蛋白表位基础上， 在HBsAg基因开放性阅读框架(open reading frame， ORF)上定位突变掉内源性CTL表位并建立核酸内切酶酶切位点， 构建好。
9、的重组质粒允许插 入一个或多个外源表位， 在保留HBsAg部分生物学和免疫学特性的基础上， 还能保证外源性 表位具有免疫活性。 0005 非专利文献王文敬等， GPC-3 CTL表位表达载体构建， 南方医科大学学报， 2009， 29 (8)， 1548-1550； 公开了一种构建编码GPC3-HBsAg重组蛋白表达载体， 其采用GPC3的CTL表 位分别替换HBsAg中的FLG、 LLD和SIL表位而获得表达载体， 并具有一定免疫原性。 但是， 本 领域中HBsAg存在多个CTL表位， 替换的表位不同， 免疫原性相差较大， 因此选择合适的 HBsAg的CTL表位用于替换， 对获得的重组蛋白的。
10、免疫原性具有决定性的影响。 发明内容 0006 本发明的第一方面是提供一种GPC3-HBsAg重组蛋白， 其以重组的乙肝表面抗原 (HBsAg)为分子骨架， 利用外源CTL表位替换HBsAg内源性CTL表位； 所述其他外源CTL表位为 GPC3的CTL表位。 0007 在本发明的一个优选实施方案中， 在所述重组的乙肝表面抗原(HBsAg)中， 一个、 说明书 1/8 页 3 CN 105175547 B 3 二个、 三个或更多个HBsAg内源性CTL表位被一个、 二个、 三个或更多个GPC3的CTL表位所替 换。 0008 在本发明的另一个实施方案中， 所述重组的乙肝表面抗原(HBsAg)的氨。
11、基酸序列 如SEQ ID NO： 1所示； 在所述SEQ ID NO： 1序列中， HBsAg内源性CTL表位相应地被GPC3 CTL 表位所替换。 0009 在本发明的另一个实施方案中， 所述编码HBsAg内源性CTL表位选自下表中的一 个、 二个、 三个或更多个表位， 具体如表1所示： 0010 表1 HBsAg蛋白中内源性CTL表位 0011 0012 在本发明的一个优选的实施方案中， 所述HBsAg内源性CTL表位选自包含IPQ表位 的一个或更多个表位， 进一步地所述HBsAg内源性CTL表位选自IPQ以及FLL、 LLC、 LLD、 LLV、 SIL和/或LLP表位中的一个、 二个、。
12、 三个或更多个表位。 0013 所述GPC3 CTL表位选自下表中一个、 二个、 三个或更多个表位， 具体如表2所示： 0014 表2 GPC3 CTL表位 0015 表位氨基酸序列位置 SFFQRLQPGL40-49 FFQRLQPGL41-49 RLQPGLKWV44-52 FLIIQNAAV102-110 说明书 2/8 页 4 CN 105175547 B 4 MFKNNYPSL129-137 FVGEFFTDV144-152 FTDVSLYIL148-157 YILGSDINV155-163 ELFDSLFPV169-177 KFSKDCGRML247-256 RMLTRMWYC25。
13、4-262 WYCSYCQGL260-268 VMQGCMAGV281-289 KYWREYILSL294-303 EYILSLEEL298-306 IYDMENVLL313-321 TIHDSIQYV326-334 AYYPEDLFI360-368 FYSALPGYI401-409 RFLAELAYDL521-530 FLAELAYDL522-530 0016 在本发明的又一个优选的实施方案中， 所述GPC3 CTL表位选自EYILSLEEL、 FFQRLQPGL、 FYSALPGYI和/或IYDMENVLL中一个或多个表位。 0017 在本发明的又一个优选的实施方案中， 所述重组蛋白序列如。
14、SEQ ID NO： 2所示， 其 为采用GPC3 CTL表位EYILSLEEL替换HBsAg内源性CLT表位IPQ、 LLD和SIL得到的重组蛋白。 0018 在本发明的又一个优选的实施方案中， 所述重组蛋白序列如SEQ ID NO： 3所示， 其 为采用GPC3 CTL表位EYILSLEEL替换HBsAg内源性CLT表位IPQ和LLD得到的重组蛋白。 0019 在本发明的又一个优选的实施方案中， 所述重组蛋白序列如SEQ ID NO： 4所示， 其 为采用GPC3 CTL表位EYILSLEEL替换HBsAg内源性CLT表位IPQ和SIL得到的重组蛋白。 0020 在本发明的又一个优选的实施。
15、方案中， 所述重组蛋白序列如SEQ ID NO： 5所示， 其 为采用GPC3 CTL表位EYILSLEEL替换HBsAg内源性CLT表位IPQ得到的重组蛋白。 0021 本发明的第二方面是提供编码上述重组蛋白的核苷酸序列。 在本领域中， 根据上 述重组蛋白的氨基酸序列而获得编码核苷酸序列是本领域技术人员已知的， 例如， 根据密 码子规则获得编码上述重组蛋白的RNA或DNA序列， 例如， 编码SEQ ID NO： 1氨基酸序列的核 苷酸序列如SEQ ID NO： 6所示。 0022 本发明的第三方面是所述重组蛋白在制备肿瘤疫苗中的应用。 0023 本发明的第四方面是所述重组蛋白在制备治疗/预防。
16、肿瘤药物中的应用。 0024 本发明中所述肿瘤的种类没有特别限定， 优选为表达GPC3的肿瘤， 具体选自， 包括 但不限于食道癌、 乳癌、 甲状腺癌、 直肠癌、 胰腺癌、 恶性黑色素瘤(黑素瘤)、 恶性淋巴瘤、 骨 肉瘤、 成嗜铬细胞瘤、 头颈癌、 子宫癌、 卵巢癌、 脑瘤、 慢性骨髓性白血病、 急性骨髓性白血 病、 肾癌、 前列腺癌、 肺癌、 胃癌、 肝癌、 胆囊癌、 睾丸癌、 甲状腺癌、 膀胱癌或肉瘤等。 具体实施方式 说明书 3/8 页 5 CN 105175547 B 5 0025 下面将举例说明本发明。 需要指出的是， 以下说明仅仅是对本发明要求保护的技 术方案的举例说明， 并非对这。
17、些技术方案的任何限制。 本发明的保护范围以所附权利要求 书记载的内容为准。 0026 下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法， 通常按照常规条件， 分子克隆实 验指南(Sambrook J， et al.2008.Molecular Cloning： A Laboratory Manual， 3rd Ed.)中 所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件来进行。 0027 实施例1重组HBsAg载体质粒的构建 0028 根据基因工程技术， 采用PCR定位突变技术对HBsAg基因进行改造， 从而获得一段 改良的HBsAg基因片段， 其序列如SEQ ID NO： 6所示， 其编码的蛋白氨基酸序列如。
18、SEQ ID NO： 1所示。 然后， 将上述HBsAg基因片段插入pcDNA3.1+质粒中， 从而获得重组HBsAg载体质 粒。 0029 上述HBsAg基因片段也可以通过合成获得， 并通过PCR技术进行大量扩增。 0030 实施例2编码重组蛋白的DNA分子及表达载体的构建 0031 (1)SOEing PCR扩增 0032 按照非专利文献王文敬等， GPC-3 CTL表位表达载体构建， 南方医科大学学报， 2009， 29(8)， 1548-1550公开的方法； 以构建好的重组HBsAg质粒为模板， 进行SOEing PCR扩 增。 0033 PCR反应体系： ddH2O 21 l， 5P。
19、CR Buffer 8 l， dNTPs(10mmol/L)1 l， 模板DNA 1 l(100ng)， 引物组(每个引物对的浓度为10 mol/L)4 l， Elongase 1 l。 反应条件： 945s 预变性， 9410s， 5520s循环扩增25次， 7230s延长。 0034 从而获得表位替换的重组DNA分子。 0035 (2)将重组GPC3/HBsAg的DNA分子克隆至pBSSK+载体 0036 将重组DNA分子用酚/氯仿法抽提1次， 用乙醇/醋酸钠沉淀。 纯化的DNA用T4连接 酶， 按常规方法连至pBSSK+载体。 具体操作参照pBSSK+Vector说明书。 转化DH5 感。
20、受态细 胞， 蓝白斑筛选， 挑取单克隆培养， 抽提质粒， 进行PCR鉴定， EcoR I、 BamH I双酶切鉴定。 鉴 定正确的克隆pBSSK/GPC3用Plasmid midi法抽提质粒后， 送测序。 测序结果显示HBsAg基因 中内源性表位序列位置已被GPC3 CTL表位序列替换， 且原序列中无错配碱基。 0037 本实施例中， 编码HBsAg内源性表位和GPC3 CTL表位的核苷酸序列如下： 0038 表3 HBsAg蛋白中内源性CTL表位及编码表位的DNA序列 说明书 4/8 页 6 CN 105175547 B 6 0039 0040 0041 表4 GPC3 CTL表位及编码表位。
21、的DNA序列 0042 表位氨基酸序列编码表位的DNA序列 SFFQRLQPGLTCCTTCTTCCAGAGACTGCAGCCCGGACTC FFQRLQPGLTTCTTCCAGAGACTGCAGCCCGGACTC RLQPGLKWVAGACTGCAGCCCGGACTCAAGTGGGTG FLIIQNAAVTTCTTAATTATTCAGAATGCTGCGGTT MFKNNYPSLATGTTCAAGAACAACTACCCAAGCCTG FVGEFFTDVTTTGTGGGTGAATTTTTCACAGATGTG FTDVSLYILTTTTTCACAGATGTGTCTCTCTACATCTTG YILG。
22、SDINVTACATCTTGGGTTCTGACATCAATGTA ELFDSLFPVGAATTGTTTGACAGCCTGTTTCCAGTC KFSKDCGRMLAAGTTCAGTAAGGACTGTGGCCGAATGCTC RMLTRMWYCCGAATGCTCACCAGAATGTGGTACTGC WYCSYCQGLTGGTACTGCTCTTACTGCCAGGGACTG VMQGCMAGVGTCATGCAAGGCTGTATGGCAGGTGTG KYWREYILSLAAGTACTGGAGAGAATACATTCTGTCCCTT EYILSLEELGAGTACATCCTGAGCCTGGAGGAGCTG 。
23、IYDMENVLLATCTATGACATGGAGAACGTACTGCTT 说明书 5/8 页 7 CN 105175547 B 7 TIHDSIQYVACAATCCATGATTCTATCCAGTATGTC AYYPEDLFIGCTTATTATCCTGAAGATCTCTTTATT FYSALPGYITTCTATAGTGCTTTGCCTGGCTACATC RFLAELAYDLCGCTTCCTTGCAGAACTGGCCTATGATCTG FLAELAYDLTTCCTTGCAGAACTGGCCTATGATCTG 0043 获得的重组DNA分子以及其编码的氨基酸序列如下表所示： 0044 0045 实施。
24、例3重组DNA分子的蛋白表达 0046 (1)将实施例2制备的重组DNA分子克隆入分泌型表达载体pPICZ A， 构建GPC3- HBsAg表达质粒pPICZ A-GPC3-HBsAg。 0047 (2)表达质粒pPICZ A-GPC3-HBsAg传入毕赤酵母GS115中， 用不同浓度G418筛选出 不同拷贝重组质粒的毕赤酵母GS115， 筛选出表达量最高的一株 0048 (3)含高效分泌表达质粒pPICZ A-GPC3-HBsAg的毕赤酵母GS115高密度发酵， 上罐 发酵表达达到200mg/L。 0049 (4)GPC3-HBsAg重组蛋白分离及纯化。 浓缩， 硫酸铵分级沉淀， pheny。
25、l疏水层析和Q 离子交换， 得到高纯度的GPC3-HBsAg重组蛋白。 SDS-PAGE检测纯度大于95。 氨基酸测序表 明GPC3-HBsAg重组蛋白序列如SEQ ID NO： 2-5和16-20所示。 0050 实施例4重组蛋白的体外免疫活性试验 0051 取HLA-A2.1/Kb转基因小鼠， 随机分组， 分别免疫实施例5制备的重组蛋白， 免疫方 法如下： 第一次用重组蛋白(20mg/只)； 腹腔注射小鼠； 1周后(第8天)用重组蛋白(20mg/只) 腹部皮下多点注射小鼠， 2周后(第15天)用重组蛋白(20mg/只)皮下多点注射免疫； 3周后 (第22天)用重组蛋白(10mg/只)尾静脉。
26、注射加强免疫一次； 对照组给予生理盐水， 免疫方法 同上。 具体如下： 0052 最后一次免疫后第7天， 以淋巴细胞分离液分离脾细胞， 以免疫后小鼠的脾细胞为 说明书 6/8 页 8 CN 105175547 B 8 杀伤细胞， 表达GPC3的肿瘤细胞为靶细胞， 进行细胞毒试验， 大致方法如下： 将靶细胞置96 孔板， 加入3H-TdR(37kBq/孔)于37、 5CO2培养24h； 加入杀伤细胞， 使杀伤细胞和靶细 胞比例为50 1， 于37、 5CO2培养24h； 分别收集每孔细胞， 以液闪计数仪(1205Betaplate TM liquid scintillation counter)。
27、检测每分钟计数(CPM)。 0053 效应细胞对靶细胞的杀伤率表达为： 杀伤率(细胞毒实验前靶细胞cpm-细胞毒 实验后活靶细胞cpm)/细胞毒实验前靶细胞cpm100 0054 结果如下： 0055 0056 附注： Huh7、 HepG2及WM35肿瘤细胞均表达GPC3， LOVO及HOS8603细胞均不表达 GPC3。 0057 另外， 处死小鼠前， 分别测定小鼠体重、 肝脏及肾脏重量， 计算小鼠肝脏指数和肾 脏指数， 结果表明， 本发明的重组蛋白与对照组小鼠相比， 小鼠肝脏指数和肾脏指数无明显 变化。 0058 实施例5重组蛋白的体内抗肿瘤试验 0059 收集对数生长期的HepG2细胞。
28、， 制成单细胞悬液， 调整细胞浓度为5107/ml， 经检 疫观察1周的HLA-A2.1/Kb转基因小鼠于右侧背部碘伏消毒， 在每只皮下接种1107细胞悬 液， 以皮下结节直径超过0.5cm为成瘤标准。 皮下接种1周后均成瘤， 成瘤率100。 然后尾静 脉注射重组蛋白的生理盐水(5mg/kg)溶液， 5天后以相同剂量在注射一次重组蛋白， 模型组 给予等量的生理盐水， 末次给药14天后， 处死小鼠， 测定裸鼠肿瘤体积和肿瘤重量， 具体结 果如下： 0060 分组肿瘤体积(cm3)肿瘤重量(g) 模型组1.190.160.980.14 说明书 7/8 页 9 CN 105175547 B 9 SE。
29、Q ID NO： 20.370.110.290.09 SEQ ID NO： 30.590.130.510.08 SEQ ID NO： 40.620.140.530.12 SEQ ID NO： 50.690.160.610.13 SEQ ID NO： 160.640.130.590.11 SEQ ID NO： 170.780.140.710.09 SEQ ID NO： 180.850.120.810.13 SEQ ID NO： 190.940.190.880.14 SEQ ID NO： 200.870.130.810.11 0061 另外， 经BALB/c小鼠的毒理学实验显示， 本发明制备的GP。
30、C3-HBsAg重组蛋白对其 生长、 发育、 生殖及重要器官的结构和功能均无不良影响。 0062 此外， 本发明采用实施例2-5类似的方法， 对重组蛋白进行了研究， 区别仅在于采 用的GPC3 CTL表位不同； 具体为采用FFQRLQPGL、 FYSALPGYI或IYDMENVLL等GPC3 CTL表位来 替换HBsAg内源性表位， 获得的重组蛋白活性与实施例4和5的结果类似， 替换IPQ表位的重 组蛋白的活性明显优于其他表位替换的重组蛋白， 结果存在统计学差异。 0063 本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案， 其中一个或更多个技 术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个。
31、技术方案相组合， 这些经组合而得到 的技术方案也在本申请保护范围内， 就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开 内容中具体记载一样。 说明书 8/8 页 10 CN 105175547 B 10 0001 序列表 1/32 页 11 CN 105175547 B 11 0002 序列表 2/32 页 12 CN 105175547 B 12 0003 序列表 3/32 页 13 CN 105175547 B 13 0004 序列表 4/32 页 14 CN 105175547 B 14 0005 序列表 5/32 页 15 CN 105175547 B 15 0006 序列表 6/32 。
32、页 16 CN 105175547 B 16 0007 序列表 7/32 页 17 CN 105175547 B 17 0008 序列表 8/32 页 18 CN 105175547 B 18 0009 序列表 9/32 页 19 CN 105175547 B 19 0010 序列表 10/32 页 20 CN 105175547 B 20 0011 序列表 11/32 页 21 CN 105175547 B 21 0012 序列表 12/32 页 22 CN 105175547 B 22 0013 序列表 13/32 页 23 CN 105175547 B 23 0014 序列表 14/32。
33、 页 24 CN 105175547 B 24 0015 序列表 15/32 页 25 CN 105175547 B 25 0016 序列表 16/32 页 26 CN 105175547 B 26 0017 序列表 17/32 页 27 CN 105175547 B 27 0018 序列表 18/32 页 28 CN 105175547 B 28 0019 序列表 19/32 页 29 CN 105175547 B 29 0020 序列表 20/32 页 30 CN 105175547 B 30 0021 序列表 21/32 页 31 CN 105175547 B 31 0022 序列表 2。
34、2/32 页 32 CN 105175547 B 32 0023 序列表 23/32 页 33 CN 105175547 B 33 0024 序列表 24/32 页 34 CN 105175547 B 34 0025 序列表 25/32 页 35 CN 105175547 B 35 0026 序列表 26/32 页 36 CN 105175547 B 36 0027 序列表 27/32 页 37 CN 105175547 B 37 0028 序列表 28/32 页 38 CN 105175547 B 38 0029 序列表 29/32 页 39 CN 105175547 B 39 0030 序列表 30/32 页 40 CN 105175547 B 40 0031 序列表 31/32 页 41 CN 105175547 B 41 0032 序列表 32/32 页 42 CN 105175547 B 42 。