本申请是2006年2月8日提交的共同未决美国临时申请 No.60/771，510的部分继续申请。
技术领域
本发明涉及用于捕获和提取核糖核酸(特别是来自生物来源材料的 核糖核酸)的简化方法的材料。
背景技术
应用到临床研究、临床诊断测试和药物开发中的现代分子生物学方 法越来越多地利用了核糖核酸(RNA)的研究。RNA以信使RNA (mRNA)、转运RNA(tRNA)和核糖体RNA(rRNA)的形式存在。 一些现代分子生物学技术例如Northern印迹、核糖核酸酶保护测定和 RT-PCR需要在分析之前分离纯的未降解的RNA。对特定mRNA序列 的存在性以及mRNA表达水平的研究已经大量应用。分析mRNA(尤 其是使用微阵列)是分子生物学研究中的有力工具。通过测定样品中 mRNA序列的水平可以确定单个基因的上调或下调。mRNA水平可以 作为外部刺激或疾病状态的函数而被评估。例如，p53 mRNA水平的变 化与多种细胞类型的癌症正相关。
另外，许多对人类健康有重大影响的病毒(包括HIV、HCV、西尼 罗河病毒、马脑炎病毒和埃博拉病毒)具有RNA基因组。从体液或组 织中快速且清洁地提取病毒RNA的能力对于病毒学研究和传染病诊断 及治疗是重要的。
当前提取RNA的方法从多种方法之一开始，以破坏或裂解细胞、 释放RNA进入溶液以及防止RNA被内源RNA酶降解。裂解将RNA 与DNA和蛋白质一道释放出来，然后必须再从中分离RNA。之后，处 理所述RNA以将其溶解或沉淀。Chirgwin等，Biochem，18，5294-5299 (1979)公开了使用离液胍盐以同时裂解细胞、溶解RNA和抑制RNA 酶。另一些方法通过在低pH下用苯酚/氯仿提取将溶解的RNA与蛋白 质和DNA相分离(D.M.Wallace，Meth.Enzym.，15，33-41(1987))。 常用的一步法RNA分离包括依次用4M胍盐、醋酸钠(pH4)、苯酚和 氯仿/异戊醇处理细胞。将样品离心，通过加入乙醇将RNA从上层中沉 淀出来(P.Chomczynski，Anal.Biochem.，162，156-159(1987))。美 国专利4,843,155描述了一种方法，其中将酸性pH下的苯酚和胍盐稳 定混合物加入到细胞。在使用氯仿进行相分离之后，通过用乙醇沉淀回 收水相中的RNA。
另一些方法包括将热苯酚加入到细胞混悬液中，然后进行乙醇沉淀 (T.Maniatis等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(1982))；使用阴离子或非离子表面活性剂 以裂解细胞并释放细胞质RNA；以及使用RNA酶抑制剂例如氧钒核糖 核苷复合物(vanadyl riboside complex)和焦碳酸二乙酯(L.G.Davis 等，“Guanidine Isothiocyanate Preparation of Total RNA”和“RNA preparation：Mini Method”in Basic Methods in Molecular Biology， Elsevier，New York，pp.130-138(1991))。
美国专利5,234,809(Boom等)中公开了通过结合于玻璃或其它固 相之上从生物来源中同时分离DNA和RNA的技术。通过暴露于含 EDTA和表面活性剂Triton X-100的Tris HCl(pH8.0)中的强(>5M) 硫氰酸胍溶液来裂解生物来源(例如血清或尿)中的细胞。通过与硅藻 土或二氧化硅颗粒(其与DNA和RNA形成可逆的复合物)一起孵育从 生物材料中纯化DNA和RNA。
Gillespie的美国专利5,155,018提供了从生物来源中分离和纯化生 物活性RNA的方法，所述生物来源还可以包括DNA、蛋白质、碳水化 合物和其它细胞物质。通过在包含浓的酸性离液盐的结合溶液存在下使 生物来源接触玻璃细粉或硅藻土来分离RNA。在这些条件下，其声称 RNA选择性地结合颗粒化的硅材料，但是还公开了用乙醇盐溶液处理 固体物质以除去DNA。其它研究人员后来的工作证实了确实有DNA污 染。结合到所述颗粒的RNA很容易与样本中所含的其它生物物质相分 离。优选地，清洗与颗粒结合的RNA以除去非特异性吸附的物质。通 过用稀的盐缓冲液洗脱来释放结合的RNA，从而回收基本纯的生物活 性RNA。还公开了加入核酸酶以除去洗脱液中的DNA，这带来了对选 择性结合RNA的权利要求的进一步质疑。Kuroita等的US 5,990,302 给出了Gillespie方法的变型，其通过将样品、离液剂、锂盐、酸溶液和 核酸载体合并来分离RNA。Ekenberg的US 6,218,531提供了另一种改 进，其中将含有RNA和杂质的溶液与稀释缓冲液混合以形成澄清的裂 解液，然后将RNA与二氧化硅固相结合。通过沉淀DNA和蛋白质使之 澄清。所述稀释缓冲液可以是水，但更优选是具有中性pH的缓冲液例 如SSC，其中含有盐并且更优选含有去污剂例如SDS。
美国专利5,010,183和5,985,572描述了带一价电荷的单体阳离子表 面活性剂裂解细胞并将RNA和DNA从溶液中同时沉淀下来的能力。在 这些专利中，首先使RNA为不可溶的。在’183专利的方法中，季铵表 面活性剂和40％尿素以及其它添加剂的溶液被加入到细胞混悬液中，将 混合物离心。沉淀重悬于乙醇中，通过加入盐使核酸从其中沉淀下来。
Michelsen等的U.S.6,355,792公开了以下分离核酸的方法，即用pH 小于6.5的缓冲液酸化液体样品，将所酸化的溶液与带羟基的无机氧化 物材料接触，将结合有核酸的固相材料与液体分离，以及用pH在7.5 至11(优选8-8.5)的碱性溶液洗脱。酸性溶液不含离子型去污剂，离 液剂和任何离子<0.2M。已经完成的实例反映出，所述方法的使用具有 下述前提，即核酸在被捕获之前已经释放到溶液中。
WO00/66783和EP1206571B1公开了分离样品中游离的细胞外核酸 的方法，即通过使怀疑含有核酸的样品在pH小于7的条件下接触水溶 性的弱碱性聚合物使得弱碱性聚合物与样品中所有核酸形成水不溶性 沉淀，将水不溶性沉淀与样品分离，以及将所述沉淀与碱接触以提高溶 液的pH至高于7，由此从弱碱性聚合物中释放核酸。所述聚合物含有 在酸性pH下质子化但是通过升高pH可被中和的氨基。
Backus等的US5,582,988和EP 0707077B1公开了提供了来自裂解 物的核酸的方法，其包括以下步骤：在小于7的pH条件下，使怀疑含 有核酸的裂解物与足量的水溶性弱碱性聚合物接触使得所述弱碱性聚 合物与所述裂解物中的核酸形成水不溶性沉淀，从所述裂解物中分离所 述水不溶性沉淀，将所述沉淀与碱接触以提高溶液pH至大于7，由此 从所述弱碱性聚合物中释放所述核酸。
Heath的US 5,973,137公开了从生物样品中分离基本未降解的RNA 的方法，即使用由阴离子去污剂、螯合剂和pH小于6的缓冲溶液组成 的细胞裂解试剂处理样品。所述阴离子去污剂的作用据信是裂解细胞和 /或溶解蛋白质和脂类以及使蛋白质变性。当用于从全血中分离RNA时， 首先用含NH4Cl、NaHCO3和EDTA的试剂裂解红细胞，分离白细胞以 及在蛋白质-DNA沉淀试剂存在下独立地裂解白细胞。所述沉淀试剂通 常是高浓度的钠盐或钾盐(例如醋酸盐或盐酸盐)。最后的步骤是通过 加入低级醇使含RNA的上清沉淀。从酵母和革兰氏阳性菌中分离RNA 需要另外使用裂解酶、甘油和氯化钙以消化制备物中的细胞从而释放核 酸。
Collis的US 5,973,138公开了用于使核酸与酸性溶液中顺磁颗粒混 悬液可逆性结合。此方法中所公开的颗粒是裸露的铁氧化物、铁硫化物 或铁氯化物。所述酸性溶液被认为增强所述颗粒铁部分的正电性，由此 促进核酸的负电磷酸基团的结合。相关美国专利6,433,160公开了相似 的方法，其中所述酸性溶液含有盐酸甘氨酸。
Bhikhabhai的U.S.6,410,274公开了通过在不溶性基质上进行分离 来纯化质粒DNA的方法，其包括a)裂解细胞；b)用二价金属离子沉 淀大多数DNA和RNA；c)除去所述沉淀；d)用阴离子交换树脂纯化 所述裂解液(使用pH4-6的酸性缓冲液，然后使用更为碱性的缓冲液)； 和e)进一步用第二离子交换树脂纯化所述质粒。
Cros等的US 6,737,235公开了使用包含或包被了含阳离子基团的亲 水交联聚丙烯酰胺聚合物的颗粒来分离核酸的方法。通过所述聚合物上 胺基在低pH下的质子化形成阳离子基团。在低离子强度缓冲液中低pH 条件下结合核酸，在更高离子强度缓冲液中释放。所述聚合物必须具有 25-45℃的较低临界溶解温度。碱性pH和较高温度也促进解吸附。
Simms的U.S.6,875,857公开了从植物材料中分离RNA的方法和试 剂，其使用了包含非离子表面活性剂IGEPAL、EDTA、阴离子表面活 性剂SDS和高浓度2-巯基乙醇的试剂组合物。
Sprenger-Haussels的US 7,005,266公开了用于从含核酸加工酶抑制 剂的样品(例如粪便)中纯化、稳定或分离核酸的方法，其通过匀浆样 品，然后用pH2-7、盐浓度>100mM并且含苯酚中和物质(例如聚乙烯 吡咯烷酮)并任选地含有去污剂和螯合剂的溶液处理所匀浆样品以形成 裂解物。然后在基于二氧化硅的常规固相材料上处理所述裂解物。
例如US 6,270,970、6,310,199、US5,652,348、US 5,945,520、 WO96/09116、WO99/029703、EP1234832A3、EP1036082B1、U.S.专利 申请公开2001/0018513、2003/0008320和2003/0054395等的一些专利 和申请公开了将核酸可逆地捕获到结合材料上，其是由结合和洗脱缓冲 液之间pH变化改变结合材料上胺基的质子化状态来介导的。类似的， Bayer等的US 6,447,764公开了从含水系统中分离阴离子有机物质(包 括核酸)的方法，这是通过可逆地结合阳离子质子化形式的非交联聚合 物纳米颗粒，将它们从介质中分离以及提高pH使所述颗粒去质子化以 释放所述阴离子有机物质来实现的。
Kausch等的U.S.5,665,582公开了可逆地将生物材料锚定到固体支 持物上的方法，其包括将可逆聚合物置于固体支持物上，将可逆接头连 接到所述聚合物，以及使用结合组合物将生物材料连接到可逆接头，所 述结合组合物包含核酸、抗体、抗独特型抗体或蛋白A，以使得所述生 物材料可逆地锚定到固体支持物上，其中所述生物材料可以是核酸。
Burgoyne的US 5,756,126公开了用于保存遗传材料样品的干燥固 体介质，所述介质包含固体基质和吸附到所述基质的组合物，所述组合 物包含弱碱、螯合剂和阴离子去污剂。
Fomovskaia等的US6,746,841公开了纯化核酸的方法，其中一部分 包括提供了包含由用于细胞裂解的阴离子表面活性剂所包被的固体基 质的干燥基底，将样品施加到所述基底以及捕获核酸。捕获RNA的用 途并未具体公开或举例说明。
等的US 20040014703公开了在酸性pH下用含季铵或季 鏻盐化合物和质子供体(例如有机羧酸、硫酸铵或磷酸盐)的组合物稳 定RNA。
GB2419594A1公开了用氨基表面活性剂以及任选地用非离子表面 活性剂稳定核酸。
Augello的美国专利6,602,718、6,617,170和6,821,789和美国专利 申请公开2005/0153292公开了通过抑制或阻断基因诱导或核酸降解来 保存生物样品(例如全血)和保存RNA和/或DNA的方法。所述基因 诱导阻断剂可包含稳定剂和酸性物质。阳离子去污剂是优选的稳定剂。 后者裂解细胞并造成核酸作为与所述去污剂的复合物而沉淀。
US 6,916,608B2公开了稳定核酸的方法和组合物，其包含与二甲亚 砜相混合的醇和/或酮。
美国专利6,204,375和6,528,641公开了稳定细胞RNA成分的方法， 其通过将例如pH4-8的硫酸铵盐溶液加入到细胞来进行。所述盐溶液使 细胞透化，造成RNA与细胞蛋白质一起沉淀，使得RNA不能接近可能 会使其降解的核酸酶。
分离RNA的上述方法麻烦的多步骤特征使得RNA在临床实践中的 应用复杂化。方法必须克服在RNA被核酸酶(例如RNA酶)降解之前 将RNA与细胞中的蛋白质和DNA分离开来的困难。这些核酸酶存在于 血液中，其量足以快速破坏未保护的RNA。因此，从细胞分离RNA的 成功方法必须能够阻止RNA酶的降解。本领域中仍然需要快速简便地 从生物样品中提取RNA的方法。这些方法将使RNA的水解和降解最小 化，使得其可用于多种分析和下游过程。
共同拥有的美国专利申请公开2005/0106576、2005/0106577、 2005/0106589、2005/0106602、2005/0136477和2006/0234251公开了用 于从生物材料中提取核酸(包括RNA)的材料和方法。所述方法依赖 于用于破坏细胞或病毒的独特类型的固体材料，并且不需要进行化学裂 解处理。
发明内容
在一个方面，本发明提供了快速简便地从生物样品中提取和分离 RNA的新方法，其包括使用酸性溶液和固相结合材料。实施本发明中 所用的固相结合材料具有在不首先进行任何预裂解以破坏细胞或病毒 的情况下从生物样品中释放核酸的能力。所述固相结合材料可以包含季 铵基团、季鏻基团或叔锍基团。
在另一个方面，本发明提供了从生物样品中提取和/或纯化RNA的 方法，其包括使用酸性溶液和具有基质部分和鎓基并且另外还包含连接 基质部分和鎓基的可切割接头的固相结合材料，所述鎓基选自季铵基团、 季鏻基团或叔锍基团。
发明详述
定义
烷基：含有1-20个碳的支链、直链或者环状的烃基，所述烃基可以 被1个或更多个除氢之外的取代基所取代。本文中所使用的低级烷基指 含有可多达8个碳的烷基。
芳烷基：用芳基取代的烷基。
芳基：含有1-5个碳环芳香环的含芳香环基团，其可被1个或更多 个除氢之外的取代基所取代。
生物材料：包括全血、抗凝全血、血浆、血清、组织、细胞、细胞 成分和病毒。
细胞材料：完整细胞或包含动物、植物或细菌来源的完整细胞的材 料(包括组织)。细胞可以是完整的活性代谢细胞、凋亡细胞或死细胞。
细胞核酸成分：指细胞材料内的核酸，其可以是基因组DNA和RNA 以及其它核酸，例如来自传染性物质(例如病毒和质粒)的核酸。
磁性颗粒：对外部磁场有响应的颗粒、微颗粒或珠子。所述颗粒自 身可以具有磁性、顺磁性或超顺磁性。当使用超顺磁或铁磁材料时它可 被外部磁体或施加的磁场所吸引。颗粒可以具有固体核心部分，所述核 心部分是磁响应的并且被一个或多个非磁响应层所包围。作为替代，所 述磁响应部分可以是围绕于非磁响应核心的层或者可以是安置于非磁 响应核心之中的颗粒。
核酸：多核苷酸可以是DNA、RNA或合成的DNA类似物例如PNA。 这三种链类型中任何类型的单链化合物和双链杂合物也包含在此术语 的范围内。
释放、洗脱：通过与溶液或组合物相接触以移除绝大部分结合在固 相材料表面或孔的材料。
RNA：包括但不限于信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)和 核糖体RNA(rRNA)。
样品：含有或者怀疑含有核酸的液体。可用于本发明方法的典型样 品包括体液，例如血液(其可以是如通常在收集血液样品中发现的抗凝 血)、血浆、血清、尿、精液、唾液、细胞培养物、组织提取物等。其 它类型的样品包括溶剂、海水、工业水样、食物样品和环境样品(例如 土壤或水)、植物材料、真核生物、细菌、质粒和病毒、真菌、以及来 自原核生物的细胞。
固相材料：具有可吸引核酸分子之表面的材料。材料的形式可以是 颗粒、微颗粒、纳米颗粒、纤维、珠子、膜、滤器(filter)和其它支持 物(例如试管和微孔)。
取代：指基团上的至少一个氢原子被非氢基团所替代。应注意，关 于取代基，除非另有明确指出，其意为可以存在多点取代。
本发明涉及用于从生物样品中快速简便地获得RNA的方法。所述 方法使用了固相结合材料和酸性溶液，RNA从样品中所含核酸来源释 放出来而进入所述酸性溶液中。选择具有在不首先实施任何预裂解以破 坏细胞或病毒的情况下直接从生物样品释放RNA能力的所述固相结合 材料。通过固相作用直接释放RNA进入酸性环境和随后在酸性条件下 将释放的RNA捕获至所述固相使得降解最小化。另外，申请人发现有 可能从具有RNA酶活性的样品中回收核糖核酸而不需要依靠加入RNA 酶失活化合物或蛋白质，例如胍盐、高浓度离液剂或RNA酶抑制蛋白 和抗体。
实际上所述方法可用于从蛋白质-RNA复合物、完整细胞和病毒中 捕获和提取RNA。可以根据本发明的方法从任何含有核酸的生物样品 (特别是完整细胞和病毒)中提取RNA。这些材料的常见来源包括但 不限于细菌培养物或沉淀、血液、尿、细胞、体液(例如尿、痰、精液、 CSF、血液、血浆和血清)或者来自组织匀浆物。本发明的方法可以在 不需要使它们经受其它预先步骤的情况下应用到包括下列的样品：活 的、死的或凋亡的完整细胞和组织，或者培养的细菌、植物或动物细胞 系。特别地，完全不需要使用任何预破坏或裂解。从混悬液(即来自生 物流体或细胞培养物)中的细胞里提取RNA可以从例如低速离心沉淀 细胞和弃去培养基开始。使用本领域公知的组织破坏法可以从完整组织 或器官中提取RNA，所述方法例如通过使用手动匀浆器或自动匀浆器 (例如Waring搅拌器)或其它组织匀浆器进行匀浆。所述匀浆物可以 通过粗滤器(例如粗棉布)以除去大块物质或者可在低速下离心制备物 以分离颗粒材料。
本发明方法是快速的，通常仅需要数分钟就可完成。重要的是，本 方法所得的RNA具有足够的纯度使得它可用于临床或其它下游应用， 例如用于逆转录酶自身或接着进行聚合酶链式反应扩增(RT-PCR)， RNA印迹分析和体外翻译。有利地，在使用本方法之前不需要分离细 胞，仅仅需要简单的设备以实施本方法。在根据本发明方法处理样品之 前不需要预先的裂解或乙醇沉淀步骤。不需要也不使用用于裂解细胞或 病毒的去污剂或离液物质。
在本发明的一个实施方案中，含有RNA的所选生物样品(例如含 细胞和/或病毒的液体)与酸性溶液简单混合以形成混合物。所述样品 和混合物仅仅需要在混合物中相接触短短数秒钟。不需要进行其它的处 理。在所述混合物形成的同时或之后，所述混合物与固相结合材料合并， 选择这样的固相结合材料，其具有在不首先实施任何预裂解以破坏细胞 或病毒的情况下直接从生物样品释放RNA的能力。通过所述颗粒的作 用直接释放RNA进入酸性环境和随后在酸性条件下将释放的RNA快速 捕获至这些颗粒使得降解最小化。除去上清，以及任选地用一种或多种 清洗缓冲液清洗含有核酸的固相。如果需要，可接着洗脱所述固相以从 固相解离RNA。在一个实施方案中，使用碱性溶液从所述固相或颗粒 洗脱RNA。通常，用于此目的的碱的理想浓度是至少10-4M，优选约 1mM至约1M。
在另一个实施方案中，如果需要，本发明的方法可通过任选地使用 RNA酶抑制剂(例如金精三羧酸(aurin tricarboxylic acid)、DTT或 DEPC)来实施。本领域技术人员可选择其它的RNA酶抑制剂来用于 此目的。
所有的所述步骤可在单个容器中或单个支持物上快速连续进行，而 不需要专门的设备(例如离心机)。所述方法可改造用于以串行或并行 方式处理大量样品的自动平台。所有结合和清洗步骤优选在短时间内完 成，优选不超过1分钟。清洗步骤可优选在10秒钟内进行。洗脱优选 在不超过1分钟内进行。在一个示例性方案中，含有RNA来源的100 微升样品在1.5毫升微量离心管中与100微升酸性溶液混合，通过涡旋 短暂混合。然后加入在酸性溶液中的磁性结合微颗粒，将混合物涡旋混 匀30秒。在磁力台上将上清与所述颗粒分离。用200微升酸性溶液清 洗颗粒两次，用200微升水清洗两次。将清洗后的颗粒在碱性洗脱液中 涡旋混匀1分钟，以洗脱RNA。
固相材料
在一个实施方案中，本发明的RNA提取方法使用固相结合材料以 快速结合RNA，由此允许RNA与其它样品成分相分离。选择具有在不 首先实施任何预裂解以破坏细胞或病毒的情况下直接从生物样品释放 核酸的能力的固相结合材料。在本发明方法中用于结合核酸的材料包含 确定其尺寸、形状、孔隙率和机械性能的基质。所述基质的形式可以是颗 粒、微颗粒、纤维、珠子、膜和其它支持物(例如试管和微孔)。多种具 体材料和其制备描述于申请人的共同未决美国专利申请公开 2005/0106576、2005/0106577、2005/0106589、2005/0106602、2005/0136477 和2006/0234251。
在一个实施方案中，所述材料还包含处于表面或其附近的共价连接的 核酸结合部分，其允许捕获和结合不同长度的核酸分子。表面不仅仅指固 相材料的外周，还指固相材料内任何可接近孔洞区的表面。
在另一个实施方案中，所述材料还包含处于表面或其附近的非共价连 接的核酸结合部分，其允许捕获和结合不同长度的核酸分子。所述非共价 连接的核酸结合部分通过与表面上带相反电荷残基的静电引力与所述固 体基质相连，或者通过疏水引力与所述表面相连。
这些带有共价或非共价连接之核酸结合基团的材料的基质可以是任何 适宜的物质。优选的基质材料选自：二氧化硅、玻璃、不溶性合成聚合物、 不溶性多糖和金属材料以及用二氧化硅、玻璃、合成聚合物或不溶性多糖 包被的磁响应材料，所述金属材料选自金属、金属氧化物和金属硫化物。 示例性材料包括由共价相连的表面官能团包被或官能化的基于二氧化硅 的材料，所述官能团用于破坏细胞和吸引核酸。还可以包括合适的表面官 能化的基于碳水化合物的材料和具有此表面官能性的聚合物材料。用作核 酸结合基团的表面官能团包括能够破坏细胞结构完整性以及使核酸吸引 到固体支持物的任何基团。这样的基团包括但不限于下文描述的羟基、硅 烷醇基、羧基、氨基、铵、季铵和季鏻盐和叔锍盐类型的材料。其中，具 有季铵、季鏻或叔锍盐基团的材料是优选的。
对于许多应用来说，优选所述固体材料是颗粒的形式。优选地，所 述颗粒尺寸小于约50微米，更优选小于约10微米。小颗粒更易于分散 在溶液中，具有更高的表面积/体积比。较大的颗粒和珠子也可用于使 用重力沉淀或离心的方法中。两种或多种不同尺寸颗粒的混合物在一些 应用中可以是优选的。
优选地所述固相还可包含磁响应部分，其通常是顺磁或超顺磁微颗 粒的形式。所述磁响应部分允许借助磁场吸引和操纵。这样的磁性微颗 粒通常包含磁性金属氧化物或金属硫化物核心，所述核心通常被吸附或 共价结合的层所围绕以保护磁性成分。核酸结合基团可以与此层共价结 合，由此包被所述表面。所述磁性金属氧化物核心优选是铁氧化物或铁 硫化物，其中铁是Fe2+或Fe3+或二者皆有。包裹在有机聚合物层内的磁 性颗粒已经公开，例如见美国专利4,654,267、5,411,730和5,091,206中 和出版物(Tetrahedron Lett.，40(1999)，8137-8140)中。具有多种不 同类型壳的包被磁性颗粒有商业供应。如美国专利申请公开 2005/0106576、2005/0106577、2005/0106589、2005/0106602、 2005/0136477和2006/0234251中所教导的，所述壳可以被官能化。
商品磁性二氧化硅或磁性聚合物颗粒可用作制备可用于本发明的 磁性固相结合材料的起始材料。合适类型的具有表面羧基的聚合物颗粒 已知有商品名为SeraMagTM(Seradyn)和BioMagTM(Polysciences and Bangs Laboratories)。合适类型的二氧化硅磁性颗粒已知有商品名为 MagneSilTM(Promega)。Chemicell GmbH(Berlin)提供表面具有羧 基或氨基的二氧化硅磁性颗粒。
在一个末端含有三烷氧基硅烷基团的接头基团可以连接到金属材 料或者包被的金属材料的表面，所述包的被金属材料例如是包被二氧化 硅或玻璃的磁性颗粒。优选的三烷氧基硅烷化合物具有下式 R1-Si(OR)3，其中R是低级烷基，R1是选自直链、支链和环的有机基团 并包含1-100个原子。所述原子优选地选自C、H、B、N、O、S、Si、 P、卤素和碱金属。代表性R1基团是3-氨基丙基、2-氰乙基和2-羧乙基 以及如下文更充分描述的含有可切割部分的基团。在一个优选实施方案 中，三烷氧硅烷基化合物包含可切割中央部分和活性基团末端部分，其 中所述反应性基团可以通过与叔胺、叔膦或有机硫的反应而一步转变为 季鎓盐或叔鎓盐。
已发现可以在使用氟离子的过程中将这样的接头基团安置在金属 颗粒以及包被玻璃或二氧化硅的金属颗粒的表面。所述反应可以在有机 溶剂中进行，所述溶剂包括低级醇和芳香族溶剂(包括甲苯)。合适的 氟来源在这些有机溶剂中有较好的溶解性，所述氟来源包括氟化铯和氟 化四烷基铵盐。
在可用于本发明方法的一些固相结合材料中所含的核酸结合 (nucleic acid binding，NAB)基团可用作双重目的。NAB基团吸引和 结合具有各种长度以及碱基组成或序列的核酸、多核苷酸和寡核苷酸。 它们还可具有一定的从细胞包膜中释放核酸的能力。核酸结合基团包 括：例如，羧基、胺和季鎓或叔鎓基团或者多于一种这些基团的混合物。 胺基可以是NH2、烷基胺和二烷基胺。优选的核酸结合基团是季鎓或叔 鎓基团(-QR2+或-QR3+)，其包括三烷基季铵基团(-NR3+)、季鏻基 (-PR3+)，其包括三烷基鏻或三芳基鏻或者混合烷基芳基鏻基团，以及 叔锍基(-SR2+)。所述固相可含有多于一种的本文所述核酸结合基团。 可使用多于一种尺寸的颗粒的混合物。还可以使用上述固相结合材料与 多种其它具有或不具有NAB基团的固相结合材料的混合物。也可使用 含有季鎓或叔鎓基团(-QR2+或-QR3+)的固相材料，其中R基是至少4 个碳原子的烷基，其尤其可有效结合核酸，但是也可使用少至一个碳原 子的烷基以及芳基。这些固相材料以很高强度保持结合的核酸，在现有 技术已知的大多数洗脱条件下抵抗对所述核酸的移除或洗脱。低离子强 度和高离子强度的大多数已知洗脱条件对于移除所结合的核酸是无效 的。与含DEAE和PEI基团的常规阴离子交换树脂不同，不论反应介 质的pH如何，季鎓或叔鎓固相材料都保持带正电。
优选实施方案使用这样的固相结合材料，其中所述核酸结合基团通 过可选择性切割的连接键与所述基质相连。切断所述连接键有效地将任 何结合核酸与固相“断开”。可以通过任何化学、酶、光化学或其它特 异性切断可切割接头中的键但是不破坏目的核酸的方法切断所述连接 键。这些可切割固相材料包含固体支持物部分，其包含如上所述的基质。 用于吸引和结合核酸的核酸结合(NAB)部分通过可切割接头部分与所 述固体支持物的表面相连。美国专利申请公开2005/0106576、 2005/0106577、2005/0106602、2005/0136477和2006/0234251描述了具 有可切割连接键的合适材料，其中公开内容通过参考并入本文。
可切割的接头部分优选是选自直链、支链和环的有机基团，并包含 1-100个原子。所述原子优选选自C、H、B、N、O、S、Si、P、卤素 和碱金属。示例性接头基团是可水解切割的基团。实例包括羧酸酯和酸 酐、硫酯、碳酸酯、硫代碳酸酯、氨基甲酸酯、酰亚胺、磺酰胺、磺酰 亚胺和磺酸酯。在一个优选实施方案中，用碱性水溶液处理所述可切割 连接键。另一种示例性接头基团类型是经受还原性切割的基团，例如被 包括膦和硫醇(例如乙硫醇、巯基乙醇和DTT)在内的多种试剂切割 的二硫键(S-S)。另一种代表性的基团是含有过氧键(O-O)的有机基 团。过氧键可以被硫醇、胺和膦切割。另一种代表性的可切割基团是可 酶促切割的接头基团。示例性基团包括酯(其可被酯酶和水解酶所切 割)、酰胺和肽(其可被蛋白酶和肽酶所切割)、糖苷基(其可被糖苷酶 所切割)。另一种代表性可切割基团是可切割的1，2-二氧环丁烷 (dioxetane)部分。这些材料含有二氧环丁烷部分，其可以被热分解或 者被化学或酶试剂引发而片段化。除去保护基团产生氧阴离子促进了二 氧环丁烷环的分解。通过根据公知方法切割过氧O-O键和C-C键发生 片段化。在多个专利和出版物中描述了可切割的二氧环丁烷类。代表性 实例包括美国专利4,952,707、5,707,559、5,578,253、6,036,892、6,228,653 和6,461,876。
另一种可切割的接头基团是富含电子的C-C双键，其可被转变成不 稳定的1，2二氧环丁烷部分。双键上的至少一个取代基通过O、S或N 原子连接到所述双键。富电子双键与单线态氧(singlet oxygen)反应产 生不稳定的1，2二氧环丁烷环基团，其在常温下快速片段化产生两个羰 基片段。
具有可切割接头基团的另一类固相材料具有烯酮二硫缩醛(ketene dithioacetal)作为可切割部分，如美国专利6,858,733和6,872,828所公 开的。通过过氧化物酶和过氧化氢的酶促氧化，烯酮二硫缩醛经历双键 的氧化性切割。
所述可切割部分可以具有所示结构，包括在吖啶(acridan)环上具 有取代的类似物，其中Ra、Rb和Rc都是有机基团，其各自含有1至约 50个选自C、N、O、S、P、Si和卤素的非氢原子，其中Ra和Rb可以 相连接形成环。多种其它可切割基团对于本领域技术人员来说是显而易 见的。另一组具有可切割接头基团的固相材料具有可光切割的接头基 团，例如硝基取代的芳香醚和酯。根据公知反应，邻硝基苄酯被紫外光 切割。
酸性溶液
用于本发明方法的酸性溶液一般包括具有低于中性pH的任何水溶液， 优选所述溶液具有1-5范围内的pH，更优选约2-4。所述酸可以是有机或 无机酸。可以使用无机酸例如盐酸、硫酸和高氯酸。可使用包括单羧酸、 二羧酸、三羧酸和氨基酸的有机酸，以及所述酸的盐。代表性酸包括甲酸、 乙酸、三氟乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸以及柠檬酸、甘 氨酸和丙氨酸。盐可以具有任何水溶性反离子，优选碱金属或碱土金属离 子。包含过渡金属盐的酸性溶液也可用于实施本发明。优选的过渡金属包 括Fe、Mn、Co、Cu和Zn盐。
不像通过化学裂解提取RNA的其它方法，本方法中所用的酸性溶 液不含去污剂或化学裂解剂例如离液物质(如胍盐)。没有使用用于任 意这些功用的有机溶剂，例如DMF或DMSO。在不存在其它可溶性添 加剂的情况下，所述酸性介质和所述固相结合材料的组合足以允许从样 品中提取完整的RNA，甚至是含有RNA酶的样品也是如此。
可以将所述样品和所述酸性溶液相混合，同时通过在该酸性溶液中 提供固相而将混合物与所述固相合并。作为替代，所述样品可以首先与 所述酸性溶液混合以形成混合物，然后将所述混合物与所述固相合并。
清洗溶液
如果使用的话，可用于实施本发明的清洗溶液可以有助于从结合 RNA中除去其它成分。在一个实施方案中，清洗溶液可包含与结合步 骤所用相同或相似的酸性溶液。已经发现用酸性溶液清洗是有利的，这 可能是为了除去残余的RNA酶活性。使用中性pH的水或缓冲液进一 步清洗可用于在洗脱之前中和所述酸。应制备或处理水和缓冲液以确保 它们不具有RNA酶活性。
洗脱试剂
在一个实施方案中，通过将所述固相材料与释放所结合RNA进入 溶液的试剂相接触来从所述固相中洗脱所结合RNA。所述溶液应溶解 并足以保存释放的RNA。洗脱在释放溶液中的RNA应与下游分子生物 学过程相容。在另一个实施方案中，用于从固相结合材料上释放核酸的 试剂是通过切割固相结合材料中存在的可切割接头基团来起作用。一种 优选试剂是至少10-4M的强碱性水溶液。浓度为至少10-4M的碱金属氢 氧化物、氢氧化铵、四烷基氢氧化铵、碱金属碳酸盐和碱金属氧化物的 溶液可有效地从所切割固相上快速切割和洗脱RNA。当所述可切割基 团是二硫(S-S)基团时，洗脱/切割试剂将含有二硫键还原剂，例如硫 醇(如乙硫醇、巯基乙醇或DTT)。当所述可切割基团是过氧(O-O) 键时，洗脱/切割试剂将含有还原剂，例如硫醇、胺或膦。当所述可切 割基团可酶促切割时，洗脱/切割试剂将含有合适的酶。酯需要酯酶或 水解酶；酰胺或肽键需要蛋白酶或肽酶；糖苷基团需要糖苷酶。当所述 可切割基团是1，2-二氧环丁烷部分时，可以热切割所述二氧环丁烷，洗 脱试剂可以是上述的碱性溶液。当所述可切割基团是可诱发的1，2-二氧 环丁烷部分时，洗脱/切割试剂将含有化学或酶试剂以通过去除保护基 团产生不稳定氧阴离子来诱导所述基团的切割。当所述可切割基团是可 转变成不稳定1，2-二氧环丁烷的富电子C-C双键时，洗脱/切割试剂将 含有单线态氧来源(例如光敏染料)。本领域已知与可见光和分子氧反 应产生氧单线态激发态的这些染料，包括例如孟加拉玫瑰红(Rose Bengal)、伊红Y(Eosin Y)、茜素红S(Alizarin Red S)、刚果红(Congo Red)和橙G(Orange G)、荧光素染料、罗丹明染料、赤藓红B、叶 绿酸三钠盐、氯高铁血红素盐、血卟啉、亚甲基蓝、结晶紫、孔雀石绿 (Malachite Green)和富勒烯。
在另一个实施方案中，用于从固相结合材料释放RNA的包含季鎓 NAB基团的试剂选自申请人的共同未决美国专利申请公开 2005/0106589中公开的组合物。
所述释放步骤可以在室温下实施，但是可使用任何适宜的温度。洗 脱温度对于本发明的分离核酸方法的成功似乎不是关键的。优选室温， 但是在一些情况下升高温度可以增加洗脱速率。
本发明的试剂盒
在另一个实施方案中，提供用于实施本发明方法的试剂盒。根据本 发明从样品中分离核糖核酸的试剂盒包含至少一种固相结合材料以及 酸性溶液，所选的固相结合材料被选择成具有在不首先进行任何预裂解 的情况下从生物样品中直接释放核酸的能力。所述固相结合材料包含基 质，其可以是颗粒、微颗粒、磁性颗粒、纤维、珠子、膜以及其它支持 物(例如试管和微孔)的形式。所述基质与核酸结合部分共价或非共价 连接，任选地通过可切割接头。
所述核酸结合部分包含至少一种类型的基团，其选自羧基、NH2、 烷基胺、二烷基胺基、季铵基(包括三烷基铵基)、季鏻基(包括三烷 基鏻、三芳基鏻或者混合烷基芳基鏻基)以及叔锍基。
作为本发明试剂盒中一种要素的所述酸性溶液一般地包括pH低于 中性的任何水溶液。优选地，所述溶液具有1-5范围内的pH，更优选 约2-4。所述酸可以是有机或无机酸。无机酸例如盐酸、硫酸和高氯酸 是可用的。可使用包括单羧酸、二羧酸、三羧酸和氨基酸的有机酸，以 及所述酸的盐。代表性酸包括甲酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、草酸、丙 二酸、琥珀酸、戊二酸以及柠檬酸、甘氨酸和丙氨酸。盐可以具有任何 水溶性反离子，优选碱金属或碱土金属离子。包含过渡金属盐的酸性溶 液在实施本发明中也是可用的。优选的过渡金属包括Fe、Mn、Co、Cu 和Zn盐。
试剂盒还可以包含洗脱试剂，以及一种或多种任选的清洗缓冲液和 其它试剂盒常规组分，例如使用手册、实验方案、缓冲液和稀释剂。洗 脱试剂可以选自强碱性水溶液，例如浓度至少为10-4M(优选约1mM 至约1M)的碱金属氢氧化物或氢氧化铵溶液；二硫键还原剂，例如硫 醇(包括乙硫醇、巯基乙醇或DTT)；过氧化物还原剂(例如硫醇、胺 或膦)以及酶(例如酯酶、水解酶、蛋白酶、肽酶、糖苷酶或过氧化物 酶)。在一个实施方案中，其中固相结合材料含有可切割接头，例如可 通过与单线态氧来源反应而被切割的富电子烯基，所述试剂盒可包含如 上所述的光敏染料。
实施例
实施例1.用于分离RNA的固相材料。合成由三丁基鏻NAB基团 和可切割芳基硫酯连接键官能化的磁性颗粒。
a)制备磁铁。在1小时中将气氩吹入5升瓶中的3升I型水中。在 氩气下加入浓NH4OH(28％，180毫升)。通过滴液漏斗在约1小时里 加入50毫升在1M HCl中的2M FeCl2和200毫升在1M HCl中的1M FeCl3的混合物。通过下述步骤将固体收集在两个烧瓶中，每次以 500-600毫升份倒入带有外部盘状磁体的烧瓶中，并倒出上清。通过用 超声分散在500-600毫升I型水中然后吸引到磁体并倒出上清来清洗所 述固体。重复所述过程直至上清的pH大约为8.5。合并两个瓶中的内 容物使得所述磁铁以约500毫升的总体积保存。
b)将3-甲基氨丙基三甲氧基硅烷(149.8克)加入到500毫升烧瓶 中，通入氩气。将所述烧瓶置于冰浴中之后，用注射器缓慢加入丙烯酰 氧基三甲基硅烷(119.6克)。搅拌所述反应5分钟，除去冰浴，继续搅 拌2个小时。不经进一步纯化即使用产物。
c)磁铁包被。用I型水将来自步骤a)的含有5.0克磁铁的一定量 磁铁浆稀释至140毫升，对混合物超声。15分钟后加入乙醇(1.25升)。 30-45分钟后加入浓NH4OH(28％，170毫升)。将来自步骤b)的1.5 克甲硅烷酯的溶液和13.5克Si(OEt)4的乙醇溶液在90分钟时间内分三 份加入到反应中。然后加入20-30毫升乙醇中3.75克甲硅烷酯化合物的 溶液，搅拌混合物并再超声90分钟。搅拌过夜。将混合物以每份500 毫升转移进两个1升烧瓶中，依靠磁性分离所述颗粒。依次用4×250 毫升甲醇、2×250毫升I型水、1×250毫升pH1的稀释于I型水中的 HCl(在将混合物放回磁体上之前保持10分钟)、4×250毫升I型水、 4×250毫升甲醇以及2×250毫升丙酮清洗所述固体。过夜风干固体。 在此步骤过程中，甲硅烷酯发生水解导致产生羧酸基团。
d)将来自前一步骤的磁性羧酸官能化颗粒(1.0克)置于30毫升 亚硫酰氯中，回流4小时。过量亚硫酰氯从磁性固体中倒出。用CH2Cl2清洗所述颗粒数次，继续下一步骤。
e)用0.22克1，4-苯二硫酚和0.52毫升二异丙基乙基胺处理悬于50 毫升CH2Cl2中的酰氯官能化颗粒。对混合物超声5分钟，用轨道摇床 搅拌过夜。利用磁性分离依次用CH2Cl2、1∶1CH2Cl2/CH3OH、CH3OH、 1∶1CH2Cl2/CH3OH和CH2Cl2清洗所述固体。将固体风干过夜。
f)用0.81克三丁基膦处理前一步骤颗粒(约0.9克)和25毫升CH2Cl2的混合物。对所述混合物超声5分钟，用轨道摇床搅拌过夜。利用磁性 分离依次用CH2Cl2、1∶1CH2Cl2/CH3OH、CH3OH、1∶1CH2Cl2/CH3OH 和CH2Cl2清洗所述固体。将固体风干过夜。
g)用0.25克4-氯甲基苯甲酰氯和0.52毫升二异丙基乙胺处理前一 步骤颗粒(约0.8克)和25毫升CH2Cl2的混合物。对所述混合物超声 5分钟，用轨道摇床搅拌过夜。利用磁性分离依次用CH2Cl2、1∶1 CH2Cl2/CH3OH、CH3OH、1∶1CH2Cl2/CH3OH和CH2Cl2清洗所述固体。 收集固体并干燥过夜。
h)用0.41克三丁基膦处理前一步骤颗粒(约0.7克)和25毫升 CH2Cl2的混合物。对所述混合物超声5分钟，用轨道摇床搅拌共7天。 利用磁性分离依次用1∶1CH2Cl2/CH3OH和CH3OH清洗所述固体。收 集并干燥固体。
实施例2.较大颗粒尺寸的固相材料。合成三丁基鏻NAB基团和可 切割芳基硫酯连接键官能化的磁性颗粒。
a)将3-甲基氨丙基三甲氧基硅烷(149.8克)加入到500毫升烧瓶， 充入氩气。将所述烧瓶置于冰浴中之后，用注射器缓慢加入丙烯酰氧基 三甲基硅烷(119.6克)。搅拌所述反应5分钟，除去冰浴，继续搅拌2 个小时。不经进一步纯化即使用产物。
b)用140毫升I型水和1.25升乙醇稀释5.0克商品磁铁(Strem目 录号93-2616，1-5微米)。30-45分钟后加入浓NH4OH(28％，170毫 升)。将来自步骤b)的1.5克甲硅烷酯和13.5克Si(OEt)4的乙醇溶液 在90分钟时间内分三部分加入到反应中。然后加入20-30毫升乙醇中 的3.75克甲硅烷酯化合物溶液，搅拌混合物并再超声90分钟。过夜搅 拌。将混合物以每份500毫升转移进两个1升的烧瓶中，依靠磁性分离 所述颗粒。依次用4×250毫升甲醇、2×250毫升I型水、1×250毫升 pH 1的稀释于I型水中的HCl(在将混合物放回磁体上之前保持10分 钟)、4×250毫升I型水、4×250毫升甲醇以及2×250毫升丙酮清洗 所述固体。过夜风干固体。在此步骤过程中，甲硅烷酯发生水解而导致 产生羧酸基团。
d)将来自前一步骤的磁性羧酸官能化颗粒(1.0克)置于30毫升 亚硫酰氯中，回流4小时。过量亚硫酰氯从磁性固体中倒出。用CH2Cl2清洗所述颗粒数次，继续下一步骤。
e)用0.22克1，4-苯二硫酚和0.52毫升二异丙基乙基胺处理悬于50 毫升CH2Cl2中的酰氯官能化颗粒。对混合物超声5分钟，用轨道摇床 搅拌过夜。利用磁性分离依次用CH2Cl2、1∶1的CH2Cl2/CH3OH、 CH3OH、1∶1的CH2Cl2/CH3OH和CH2Cl2清洗所述固体。将固体风干 过夜。
f)用0.81克三丁基膦处理前一步骤颗粒(约0.9克)和25毫升CH2Cl2的混合物。对所述混合物超声5分钟，用轨道摇床搅拌过夜。利用磁性 分离依次用CH2Cl2、1∶1CH2Cl2/CH3OH、CH3OH、1∶1CH2Cl2/CH3OH 和CH2Cl2清洗所述固体。将固体风干过夜。
g)用0.25克4-氯甲基苯甲酰氯和0.52毫升的二异丙基乙胺处理前 一步骤颗粒(约0.8克)和25毫升CH2Cl2的混合物。对所述混合物超 声5分钟，用轨道摇床搅拌过夜。利用磁性分离依次用1∶1 CH2Cl2/CH3OH和CH3OH清洗所述固体。收集固体并干燥过夜。
h)用0.41克三丁基膦处理前一步骤颗粒(约0.7克)和25毫升 CH2Cl2的混合物。对所述混合物超声5分钟，用轨道摇床搅拌共7天。 利用磁性分离依次用CH2Cl2、1∶1CH2Cl2/CH3OH、CH3OH、1∶1 CH2Cl2/CH3OH和CH2Cl2清洗所述固体。收集并干燥固体。
实施例3.合成官能化磁性聚合物
通过磁力的帮助将含有25毫克固体的珠子(Dynal磁性COOH珠， 批号G36710)等分试样倒出。然后用3×1毫升水和3×1毫升CH3CN 清洗珠子，之后干燥4小时。所述珠子悬于加入了28.8毫克EDC的1mL CH2Cl2中，振摇30分钟。将1，4-苯二硫酚(30毫克)溶液加入到混合 物。对管子超声1分钟，振摇过夜。除去上清，依靠磁力用4×1毫升 的CH2Cl2、1毫升1∶1甲醇：CH2Cl2、4×1毫升甲醇和4×1毫升CH2Cl2清洗所述珠子。
将所述珠子悬于1毫升加入了140微升三丁基膦的CH2Cl2中。将 反应混合物涡旋1分钟，总共振摇3天。通过保持在磁体上倒出溶剂。 依靠磁力用4×1毫升CH2Cl2、1毫升1∶1甲醇：CH2Cl2、4×1毫升甲 醇、1毫升1∶1甲醇：CH2Cl2和4×1毫升CH2Cl2清洗所述珠子。
用2毫克4-氯甲基苯甲酰氯和52微升二异丙基乙胺处理1毫升 CH2Cl2中前一步骤颗粒(约25毫克)的混合物。对所述混合物涡旋10 秒，超声5分钟，用轨道摇床搅拌过夜。利用磁力分离依次用4×1毫 升CH2Cl2、1毫升1∶1甲醇：CH2Cl2、4×1毫升甲醇、1毫升1∶1甲 醇：CH2Cl2和4×1毫升CH2Cl2清洗所述固体。
用30毫克三丁基膦处理1毫升CH2Cl2和前一步骤颗粒(25毫克) 的混合物。对所述混合物超声2分钟，用轨道摇床搅拌共6天。利用磁 力分离依次用4×1毫升CH2Cl2、3×1毫升甲醇、2×1毫升水清洗所 述固体。通过加入1毫升水制成珠子贮备溶液(25毫克/毫升)。
实施例4.合成官能化磁性聚合物
用磁力收集来自2×0.535毫升Sera-MagTM磁性羧酸酯修饰微颗粒 悬液(Seradyn)(其含有共50毫克颗粒)的磁性颗粒，将上清倒出。 然后用3×1毫升水、3×1毫升CH3CN和3×1毫升CH2Cl2清洗珠子。 所述珠子悬于加入了60毫克EDC的3.6毫升CH2Cl2中，振摇30分钟。
制备接头：将1，4-苯二硫酚(11.97克)溶解于300毫升。将所述溶 液冷却至-78℃。在1个小时中逐滴加入100毫升CH2Cl2中8.86克4- 氯甲基苯甲酰氯和3.8毫升吡啶的溶液。使反应溶液升温至室温，维持 过夜。完成后用任一种清洗液清洗1克的不纯固体产物得到200毫克纯 产物。通过色谱法可以从滤出液中分离更多的量。
将400微升DMF中的接头(60毫克)溶液加到所述混合物中。对 所述管超声1分钟，振摇过夜。将所述珠子分为两份各25毫克的部分， 分别进行处理。除去上清，利用磁力分离依次用4×1毫升CH2Cl2、1 毫升1∶1甲醇：CH2Cl2、4×1毫升甲醇、1毫升1∶1甲醇：CH2Cl2和4×1 毫升CH2Cl2清洗所述珠子。
在添加了75微升三丁基膦的10毫升CH2Cl2中悬浮所述颗粒。将 所述反应混合物涡旋1分钟，振摇共7天。将所述珠子分为两份各25 毫克的部分，分别进行处理。通过保持在磁体上倒出溶剂。利用磁力分 离依次用3×1毫升CH2Cl2、1毫升1∶1甲醇：CH2Cl2、4×1毫升甲醇和 2×1毫升水清洗珠子。通过加入1毫升水制得珠子贮备溶液(25毫克/ 毫升)。
实施例5.用于提取RNA的酸性溶液。应用简单的测试系统来证 明本发明方法在回收RNA上的效用以及评价多种条件和试剂的相对效 率。制备100微升测试溶液和100微升胎牛血清(FBS)的混合物。加 入2微升1微克/微升的萤光素酶RNA，将混合物涡旋混匀1分钟。将 混合物与100微升测试溶液中2毫克实施例1颗粒的悬液合并，涡旋混 匀30秒。在磁力台上将液体从颗粒中除去，依次用2×200微升测试溶 液和2×200微升0.1％DEPC处理水清洗所述颗粒。依次通过下列步骤 提取RNA，将50微升50mM NaOH与所述颗粒合并，涡旋混匀1分 钟并移除洗脱液。在乙锭染色凝胶上分析初始结合反应的上清，通过荧 光染色确定从溶液中除去并结合至所述颗粒的RNA的量。在乙锭染色 凝胶上分析洗脱液，通过荧光染色确定由所述方法提取的RNA的量和 品质。使用下述溶液导致RNA的定量结合，洗脱绝大部分所结合的 RNA。
测试溶液 pH 测试溶液 pH
柠檬酸钠 0.3M 4.0 甘氨酸0.3M 3.0
柠檬酸钠 0.3M 3.5 甘氨酸0.3M 2.5
柠檬酸钠 0.3M 3.0 甘氨酸0.05M 2.5
柠檬酸钠 0.05M 3.0 戊二酸钠0.3M 4.0
醋酸钾 0.3M 4.0 戊二酸钠0.3M 3.2
醋酸钾 0.05M 4.0 琥珀酸钠0.3M 4.0
醋酸钾 0.3M 3.7 琥珀酸钠0.3M 3.8
醋酸钠 0.3M 4.0
实施例6.从大肠杆菌培养物提取RNA。使用简单的测试系统以 证明本发明方法在从培养物中培养的大肠杆菌里回收RNA的效用，以 及用于评价多种条件和试剂的相对效率。
沉淀200微升份的大肠杆菌培养物，并除去培养基。将所述沉淀 与200微升测试溶液和2毫克实施例1的颗粒合并，涡旋混匀30秒。 在磁力台上从颗粒中除去液体，然后依次用2×200微升清洗溶液和2 ×200微升0.1％DEPC处理水清洗所述颗粒。通过下列步骤分离RNA， 将50微升50mM NaOH和20mM tris pH8.8的溶液与所述颗粒合并， 涡旋混匀1分钟并移除洗脱液。在乙锭染色凝胶上分析初始结合反应的 上清，通过荧光染色确定已经从溶液中除去并结合至所述颗粒的RNA 的量。在乙锭染色凝胶上分析洗脱液，通过荧光染色确定由所述方法提 取的RNA的量和品质。使用下述溶液导致回收到绝大部分量的完整 RNA。相比之下，在0.1％DEPC处理水中结合沉淀和清洗颗粒仅仅产 生降解的RNA。
测试溶液 清洗溶液
醋酸 0.05M 柠檬酸钠 0.3M pH3
醋酸 0.1M 柠檬酸钠 0.3M pH3
醋酸 0.2M 柠檬酸钠 0.3M pH3
三氟醋酸 0.05M 三氟醋酸 0.05M
三氟醋酸 0.1M 三氟醋酸 0.1M
三氟醋酸 0.2M 三氟醋酸 0.2M
实施例7.从大肠杆菌培养物中提取RNA的其它条件。根据实施 例6的方法使用下述测试酸性溶液进行大肠杆菌的分离，如电泳凝胶中 条带图样所示也产生完整RNA。
测试溶液
醋酸锌0.05M+0.1M醋酸铵 pH4.0
甲基三丁基鏻硫酸甲酯0.1M-1M
琥珀酸钠0.05M pH3
实施例8.从Armored RNA中提取RNA。Armored (Ambion Diagnostics，Austin，TX)是蛋白质包裹的ssRNA，其表现 为假病毒颗粒。一种HIV-B序列的Armored RNA包含来自gag区的片 段和病毒衣壳蛋白，其用于测试本发明用于从复杂样品中分离RNA的 方法。
在血浆中从Armored RNA提取RNA的典型步骤如下。100微升 EDTA抗凝血浆(Equitech-Bio，Inc.，Kerrville，TX)与5微升Armored RNA(含有50,000个拷贝)组成的105微升溶液与100微升测试溶液 (例如50mM KOAc，pH4.0)合并，短暂涡旋混匀所述混合物。1分 钟后，将所述混合物与100微升50mM KOAc(pH4.0)中的2毫克实 施例1颗粒合并，对所得浆液涡旋混匀30秒。在磁力台上分离所述颗 粒，然后依次用2×200微升50mM KOAc(pH4.0)和2×200微升0.1％ DEPC处理水清洗。通过与50微升50mM NaOH涡旋混合1分钟并移 除除去溶液来洗脱RNA。与对照进行比较，在对照中105微升血浆 /Armored RNA与2毫克颗粒和代替测试溶液的200微升0.1％DEPC 处理水合并。
使用引物对对含有RNA的洗脱液进行RT-PCR扩增以扩增gag 基因片段。使用iScriptTM一步法RT-PCR试剂盒和SYBRGreen (Bio-Rad)利用iCycler设备(Bio-Rad)进行扩增反应以进行扩增和 检测。
下述测试溶液允许回收可扩增的RNA，如CT值显著低于水对照 所示。
测试溶液
醋酸钾 0.3M pH4.0
醋酸钾 0.05M pH4.0
醋酸 0.05M
醋酸 0.2M
三氟醋酸 0.05M
盐酸吡啶 0.05M
盐酸 0.025M
盐酸四丁基鏻 0.05M
醋酸钾0.05M+醋酸 0.05M
醋酸锌 0.05M pH4.0
醋酸钾0.05M，pH4.0+三氟醋酸 0.05M
50∶50 pH1.8
70∶30 pH2.1
80∶20 pH2.5
醋酸锌 0.05M，pH4.0+三氟醋酸 0.05M(80∶20)
醋酸镁 0.05M pH4.0
醋酸铵 0.05M
四丁基醋酸铵 0.05M
四乙基醋酸铵 0.05M
醋酸锌 0.05M，pH4.0+三氟醋酸 (pH2.0，2.5.3.0，3.5)
醋酸锌 0.05M+甘氨酸0.05M pH3.3
醋酸锌 0.05M+柠檬酸钠0.05M pH3.3
醋酸锌 0.05M+柠檬酸钠0.05M pH4.2
氯化锌 0.05M+甘氨酸钠0.05M pH2.75
氯化锌 0.05M+柠檬酸钠0.05M pH2.5
实施例9.从Armored RNA提取RNA。在一个替代性方法中， 胎牛血清(FBS)(Invitrogen，Carlsbad，CA)用来替代血浆。与对照 进行比较，在对照中105微升FBS/Armored RNA与2毫克颗粒和代替 测试溶液的200微升0.1％DEPC处理水合并。如实施例4所述通过 RT-PCR分析含RNA的洗脱液。除了下文所列出的之外，实施例4的 大部分测试溶液都允许回收可扩增的RNA，如CT值显著低于水对照所 示。
测试溶液
甘氨酸 0.05M pH2.5
甘氨酸 0.3M pH2.5
甘氨酸 0.3M pH3.0
柠檬酸钠 0.3M pH3.5
柠檬酸钠 0.1M pH3.5
柠檬酸钠 0.3M pH3.0
实施例10.使用实施例1、2、3和4的每种固相材料以及多种酸 性溶液都成功实施了实施例8中用于分离和扩增加到血浆中的Armored RNA的方法。
固相 酸性溶液
实施例 1 醋酸钴 0.05M，pH4.0
实施例 1 醋酸锰 0.05M，pH4.0
实施例 1 醋酸钴 0.05M+醋酸钾0.05M，pH4.0
实施例 2 醋酸钾 0.05M，pH4.0
实施例 2 醋酸锌 0.05M，pH4.0
实施例 3 醋酸锌 0.05M，pH4.0
实施例 4 醋酸锌 0.05M，pH4.0
实施例11.从血浆提取和分析HTV RNA。本发明方法用于从来自 EDTA抗凝血处理的HIV阳性血浆中提取RNA。使用COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR TEST ver.1.5(Roche Diagnostics)检 测样品中HIV RNA的存在。此检测是用于定量HIV-1RNA的自动化 RT-PCR检测，将RNA逆转录成cDNA拷贝，PCR扩增gag基因高度 保守区中的155个碱基对序列，带生物素标记的扩增子与结合了磁性颗 粒的寡核苷酸探针杂交，生物素标签与亲和素-辣根过氧化物酶缀合物 结合，使用TMB进行显色检测。
试剂盒提供的样品制备方法用如下所述的本发明所用方法替代。
HIV RNA提取方法
1.在100微升50mM KOAc(pH4)中制备2毫克实施例1颗粒的浆液。
2.将100微升50mM KOAc(pH4)加到100微升血浆。点触涡旋所述 混合物，在室温孵育1分钟。
3.将血浆溶液加入到珠子浆液，涡旋混匀30秒。
4.除去上清，加入200微升50mM KOAc(pH4)。涡旋5秒。
5.重复步骤4。
6.除去上清，加入200微升0.1％DEPC处理的水。涡旋5秒。
7.重复步骤6。
8.除去所有剩余缓冲液。加入50微升50mM NaOH，涡旋1分钟。
9.将洗脱液转移到洁净的1.5毫升管。
10.将150微升0.1％ DEPC处理水加入到所述颗粒进行再次洗脱，涡旋 1分钟。
11.将第一和第二次洗脱液合并。
12.将50微升合并的洗脱液加入到HIV-1 MONITOR Test，ver.1.5。
在进行COBAS AMPLICOR扩增、杂交和免疫结合之后，制备系 列稀释液，然后进行检测。当使用上述方案时，分析已知含有1.88×105HIV颗粒/毫升的血浆样品允许在ELISA中检测1：729的稀释液。
实施例12.从人全血中提取RNA。使用简单的测试系统以证明本 发明方法用于从人全血中回收RNA的效用。作为仍含有完整RNA的新 鲜抽取血液的模型，培养的人T淋巴细胞(Jurkat)被掺入到全血(CPD 抗凝血)中以评价多种条件和试剂的相对效率。
沉淀收集7×105个Jurkat细胞，除去培养基。将所述沉淀与100 微升人全血合并。所述血液与含2毫克实施例1或2颗粒的100微升测 试溶液合并，涡旋混匀30秒。在磁力台上从所述颗粒除去液体，依次 用2×500微升清洗溶液和2×500微升0.1％DEPC处理水清洗所述颗 粒。通过下述步骤分离RNA，将所述颗粒与50微升50mM NaOH和 20mM tris pH8.0的溶液合并，涡旋混匀1分钟，然后移除所述溶液。 用50微升100mM醋酸锌pH4中和所述洗脱液，通过下述步骤重新结 合新的珠子，将被中和的洗脱液与含2毫克实施例1或2之颗粒的100 微升测试溶液合并，涡旋混匀30秒。在磁力台上从所述颗粒除去液体， 依次用2×500微升清洗溶液和2×500微升0.1％DEPC处理水清洗所 述颗粒。通过下述步骤分离RNA，将所述颗粒与50微升50mM NaOH 和20mM tris pH8.0的溶液合并，涡旋混匀1分钟，然后移除所述溶液。
对含RNA的洗脱液进行RT-PCR和PCR，其使用引物对以扩增 GAPDH及18S基因的RNA和DNA。使用iScriptTM一步法RT-PCR试剂 盒和 Green(Bio-Rad)利用iCycler设备(Bio-Rad)进行扩增反 应以进行扩增和检测。获得了阳性扩增结果(RT-PCR的CT<PCR的CT)。
固相 酸性溶液
实施例 1 醋酸锌 0.05M，pH4.0
实施例 1 3，3-二甲基戊二酸0.05M，pH3.2
实施例 2 醋酸锌 0.05M，pH4.0