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利用地衣芽孢杆菌同时合成两种不同成分生物絮凝剂的方法.pdf

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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410148579.6 (22)申请日 2014.04.14 C12P 1/04(2006.01) C12R 1/10(2006.01) (73)专利权人厦门大学地址 361005 福建省厦门市思明南路 422 号 (72)发明人何宁姚昊晟刘昱余文成严珊王远鹏李清彪 (74)专利代理机构厦门南强之路专利事务所 ( 普通合伙 ) 35200 代理人马应森 CN 103194499 A,2013.07.10, CN 101503709 A,2009.08.12, CN 103525879 A,2014.01.22,。

2、 CN 103667412 A,2014.03.26, (54) 发明名称利用地衣芽孢杆菌同时合成两种不同成分生物絮凝剂的方法 (57) 摘要利用地衣芽孢杆菌同时合成两种不同成分生物絮凝剂的方法，涉及生物絮凝剂。将地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis) 转接于斜面培养基培养；将新鲜平板上的单菌落转接至种子培养基中培养；将种子发酵液转接至发酵培养基培养，即得两种不同成分生物絮凝剂。利用地衣芽孢杆菌一种培养条件下合成同时以多糖和 -PGA 为活性成分的生物絮凝剂，原料成本较低、发酵周期短、合成出的絮凝剂活性高、热稳定性好；特别。

3、是多糖在酸性、中性条件下絮凝效果比较好， -PGA 在中性和碱性环境下絮凝活性较高，合成同时以多糖和 -PGA 为活性成分的生物絮凝剂满足了较大的 pH 适用范围，工业应用潜力大。 (51)Int.Cl. (56)对比文件审查员王颖 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利权利要求书1页说明书6页附图2页 CN 103937838 B 2016.02.03 CN 103937838 B 1/1 页 2 1.利用地衣芽孢杆菌同时合成两种不同成分生物絮凝剂的方法，其特征在于其具体步骤如下： 1)菌种活化：将地衣芽孢杆菌(Bacillus lichenif。

4、ormis)转接于斜面培养基培养；所述斜面培养基的组成为：酵母膏 2g/L、牛肉膏 2g/L、胰蛋白胨 5g/L、葡萄糖 15g/L、 FeSO4微量、琼脂 18g/L、 pH 5 7.5 ； 2) 种子的制备：将新鲜平板上的单菌落转接至种子培养基中培养，得种子发酵液；所述种子培养基的组成为：葡萄糖 10g/L、酵母膏 0.5g/L、尿素 0.5g/L、 K2HPO4 0.1g/L、 KH2PO40.1g/L、 NaCl 0.1g/L、 MgSO47H2O 0.2g/L ； 3) 发酵培养：将种子发酵液转接至发酵培养基培养，即得两种不同成分生物絮凝剂。

5、；所述发酵培养基的组成为：葡萄糖515g/L、柠檬酸三钠1015g/L、甘油1015g/L、尿素 1 3g/L、酵母膏 0.5 1g/L、 NH4Cl 2 6g/L、谷氨酸钠 2 6g/L、 MgSO4 0.3 0.5g/ L、 K2HPO40.5 2g/L、 KH2PO4 1 5g/L、 NaCl 1 3g/L， pH 5 7.5 ；所述两种不同成分生物絮凝剂以多糖和 -PGA 为活性成分。 2.如权利要求 1 所述利用地衣芽孢杆菌同时合成两种不同成分生物絮凝剂的方法，其特征在于在步骤 1) 中，所述培养的条件为 37下 200r/min 培养 12 18h。。

6、3.如权利要求 1 所述利用地衣芽孢杆菌同时合成两种不同成分生物絮凝剂的方法，其特征在于在步骤 2) 中，所述培养的条件为：温度 37，摇床转速 200r/min，培养时间 16h。 4.如权利要求 1 所述利用地衣芽孢杆菌同时合成两种不同成分生物絮凝剂的方法，其特征在于在步骤 3) 中，所述转接的接种量为 3。 5.如权利要求 1 所述利用地衣芽孢杆菌同时合成两种不同成分生物絮凝剂的方法，其特征在于在步骤 3) 中，所述培养的条件为在 200r/min，温度 37的条件下于摇瓶培养，装液量为 50mL/250mL，发酵时间为 16 48h。权利要求。

7、书 CN 103937838 B 2 1/6 页 3 利用地衣芽孢杆菌同时合成两种不同成分生物絮凝剂的方法技术领域 0001 本发明涉及生物絮凝剂，尤其是涉及利用地衣芽孢杆菌同时合成两种不同成分生物絮凝剂的方法。背景技术 0002 生物絮凝剂是具有絮凝活性的微生物次生代谢产物或化学改性天然有机高分子，是利用生物技术，通过培养微生物的方法得到的一类新型絮凝剂，其化学成份主要是糖蛋白、多糖、蛋白质、纤维素和核酸等物质，分子量约为几十万以上(华中科技大学学报(城市科学版 )2004,6:23-25)。絮凝性微生物能使离散微粒包括菌体细胞自身之间互相粘附，并能使胶体脱稳。

8、，形成絮状沉淀而从反应体系中分离。 0003 微生物的絮凝现象最早发现于酿酒工业中，法国Louis Pasteur于1876年发现了发酵后期的酵母菌 Levure casseeuse 具有絮凝能力。20 世纪 50 年代，日本学者发现微生物培养液具有絮凝作用。1976 年， J.Nakamura 等人对能产生絮凝效果的微生物进行了专门研究，掀起了微生物絮凝剂的研究热潮 (Agric Biol Chem,1976,40(2):377-383)。在水处理中，传统的化学絮凝剂不仅具有投加量多、产泥量大的特点，而且产生的化学污泥不易被生物降解，排放至水体中对人体健康和水环境生。

9、态都具有潜在的危害作用。因此，化学絮凝剂在应用范围和使用条件上受到了限制，前景不容乐观。生物絮凝剂不仅具有普通絮凝剂所具有的絮凝性能，还具有普通絮凝剂所不具备的用量少、絮凝效果好、絮体易于分离、易生物降解、无二次污染、对人类健康无害、适用范围广等优点。因此，生物絮凝剂的研制和应用已成为新型高效絮凝剂开发的热点和重点。 0004 生物絮凝剂按化学组成分类可分成多肽或蛋白质、多糖、脂类和 DNA 等类型。其中目前比较常见的是多糖类以及多肽或蛋白质类。 0005 目前已经鉴定的生物絮凝剂有很多种属于多糖类物质。Paecilomyces sp.I-1 产生的PF。

10、-101絮凝剂则是由氨基半乳糖以-1,4-糖苷键相连而成的粘多糖(Agricultural and Biological Chemistry,1985,49(11):3159-3164)。 Rhizobium sp.产生的絮凝剂的主要组分是纤维素，常附着于产生菌细胞壁上，直接引起菌细胞的絮凝沉降 (Applied Microb iology,1975,30(1):123-131)。 0006 Sorangium cellulosum NUST06 在培养基 (m/v) ：淀粉 30g L-1，葡萄糖 2g L-1， K2HPO40.2%， CaCl20.01%， MgSO40.03%。

11、， FeCl20.001%， KNO30.3% 中，以 30， pH 为 7.5 的条件培养 36h，多糖絮凝剂产量可达 17.5g L-1，占总产物的 58.5%。其中葡萄糖、甘露糖、葡萄糖醛酸各单体所占比例分别为 51.3%， 39.2%， 19.5%。最高絮凝率可达 99.5%(Letters in Applied Microbiology2002,34 ： 178181)。 0007 Kazuki TOEDA 利用 Alcaligenes cupidus KT201 以培养基 (m/v) ：蔗糖 2%， (NH4)2SO40.01%， CaCl22H2O0.0。

12、02%， MgSO47H2O0.02%， NaCl20.01%， FeSO47H2O0.001%， KH2PO40.16% 和酵母提取物 0.02%，在 30条件下培养 6 8 天，产生的多糖絮凝剂说明书 CN 103937838 B 3 2/6 页 4 中葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和乙酸各单体所占比例分别为 42.57%， 36.38%， 8.52% 和 10.3%。最高絮凝活性大约为 10.8OD-1(Agricultural and Biological Chemist ry,1991,55(11):2793-2799)。 0008 Bacillus sp。

13、.DP-152 以培养基 (g L-1) ：葡萄糖 40， NH4NO31.0， K2HPO40.3， KH2PO40.3， MgSO4.7H2O0.1， MnSO4.4H2O0.1， NaCl0.05， CaCO30.4，酵母提取物0.1，大豆蛋白胨 0.1 和胰蛋白胨 0.1，在 30， pH 为 7.0 条件下培养 3 天，产生的多糖中葡萄糖、甘露糖、半乳糖和海藻糖单体比例为8:4:2:1。最高絮凝活性大约为43OD-1(Journal of Fermentation and Bioengineering,1997,84(2):108-112)。 0009 S。

14、.B.Deng 等利用 Bacillus mucilaginosus 以培养基 (g L-1) ：可溶性淀粉 1.5， K2HPO40.6，酵母提取物 0.02， MgSO4.7H2O0.02， NaCl0.01，在 30， pH 为 8.0 的最适宜条件下培养 72h，产生的生物絮凝剂 MBFA9 主要成分为多糖，其中糖醛酸、中性糖和氨基糖所占的比例分别为 19.1%， 47.4% 和 2.7%。处理高岭土的最高絮凝率为 99.6%(Appl Microbiol Biotechnol,2003,60:588593)。 0010 Corynebacterium glutamic。

15、um CCTCC M201005 在培养基 (L-1) ：蔗糖 17g，玉米浸泡液 5ml，尿素 0.45g， KH2PO40.1g， NaCl0.1g and MgSO47H2O0.1g 中在 28， pH 为 7.8 的条件下培养 48h，产生的生物絮凝剂 REA-11 主要由半乳糖醛酸组成 (Biochemical Engineering Journal,2002,11:137148)，絮凝活性可达 520U/mL(Bioresource Technology2004,94:99105)。 0011 H.Salehizadeh 利用 Bacillus sp.As-1。

16、01 以培养基 (m/v) ：蛋白胨 0.5%， (NH4)2SO40.2%，酵母粉 0.1%， CaCl22H2O0.07%， MgSO47H2O0.02%， NaCl20.01%， K2HPO40.1%，葡萄糖 0.1% 和琼脂 0.3%，在 30条件下培养 10 15h，产生的生物絮凝剂中 83% 的成分是多糖，其余为蛋白质。组成该多糖的单体分别为葡萄糖、半乳糖、甘露糖，糖醛酸，丙酮酸和乙酸。最高絮凝活性为 27OD-1。100处理 15 分钟后，絮凝活性降低 50%(Biochemical Engineering Journal2000,5:3944。

17、)。 0012 Aspergillus parasiticus 以培养基 (L-1) ：蔗糖 30， NaNO33.0， MgSO47H2O0.5， KCl0.5， FeSO40.01， KH2PO41.0，在 28初始 pH 为 5.0 6.0 的条件下培养 3 天，所得生物絮凝剂中含 76.3% 多糖。处理高岭土时，絮凝率最高可达 98.1%，对印染废水的脱色率也高于 96%(Colloids and Surfaces B:Biointerfaces2005,44:179186)。 0013 Proteus mirabilis TJ-1 以培养基 (g L-1) ：葡萄糖。

18、10，胰蛋白胨 1， K2HPO45， KH2PO42， MgSO4.7H2O0.3，在 30 ， pH 为 7.0 条件下培养 48h，产生的生物絮凝剂中 63.1%(w/w) 为多糖。其中中性糖、糖醛酸、氨基糖比例为 8.2:5.3:1。最高絮凝率为 93.13%(Bioresource Technology2008,99:65206527)。 0014 Bacillus sp.F19 以培养基 (g L-1) ：葡萄糖 10，酵母提取物 0.5， (NH4)2SO40.2， K2HPO45， KH2PO42，尿素 0.5， NaCl0.1，在 3。

19、0， pH 为 7.0 的条件下培养 48h，产生的生物絮凝剂 MBFF19 为糖蛋白衍生物，其中中性糖、糖醛酸、氨基糖和蛋白质所占比例（w/w）分别为 3.6%、 37.0%、 0.5% 和 16.4%，而两种中性糖的比例为 1.2:1。处理高岭土的最高絮凝率为 97%(Bioresource Technology2008,99:76867691)。 0015 Bacillus licheniformis X14以培养基(g L-1) ：葡萄糖20，酵母提取物0.5，尿素 0.5， (NH4)2SO40.2， MgSO4.7H2O0.2， K2HPO45， KH2PO。

20、42， NaCl0.1，在 37， pH 为 8.0 的最适条件说明书 CN 103937838 B 4 3/6 页 5 下培养48h，产生的生物絮凝剂ZS-7含91.5%(w/w)的多糖，其中糖醛酸、丙酮酸和乙酸占总产物比例为16.4%、 7.1%和0.5%。处理高岭土的最高絮凝率为99.2%，对低温饮用水的CODMn 和浑浊度去除率分别为 61.2% 和 95.6%(Bioresource Technology2009,100:36503656)。 0016 Aspergillus flavus S44-1 以培养基 (g L-1) ：蔗糖 30，胰蛋白。

21、胨 3.0， MgSO47H2O0.5， KCl0.5， FeSO40.01， KH2PO41.0，在 30， pH 为 6.0 的条件下培养 3 天，产生的生物絮凝剂 IH-7 含 69.7%(w/w) 的多糖，其中中性糖、糖醛酸和氨基糖占总产物比例为 40%、 2.48% 和 1.8%。中性糖组成成分为蔗糖、乳糖、葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖和果糖，比例是 2.4 4.4 4.1 5.8 9.9 0.8 3.1。处理高岭土的絮凝率可达 95% 以上 (Bioresource Technology2013,127 489493)。 0017 Klebsiella pne。

22、umoniae LZ-5 以培养基 (g L-1) ：葡萄糖 20，酵母提取物 0.5，尿素 0.5， (NH4)2SO40.2， K2HPO45， KH2PO42， NaCl0.1，，在 30， pH 为 8.0 的条件下培养 3 天，产生的生物絮凝剂 MBF-5 含 96.8%(w/w) 的多糖和 2.1% 蛋白质，其中中性糖、糖醛酸和氨基糖占总产物比例为 50%、 3.44% 和 4.2%。中性糖组成成分为葡萄糖、甘露糖、半乳糖、和氨基葡萄糖，比例是 4.1 1.3 2.7 3.2。处理高岭土的絮凝率可达 98% 上 (Bioresource Techno。

23、logy2013,137:226232)。 0018 Ochrobactrum ciceri W2 以培养基 (g L-1) ：葡萄糖或果糖 10，酵母提取物 0.5，尿素 0.5， (NH4)2SO40.2， MgSO40.2， K2HPO45， KH2PO42， NaCl0.1，在 30 ， pH 为 7.5 的最适条件下培养 16h，产生由多糖和蛋白质组成的生物絮凝剂达最高产量 3.8g L-1， 30h 时处理高岭土的絮凝率达最高，为 92%(Bioresource Technology,doi:10.1016/ j.biortech.2012.11.020)。 0019 熊。

24、裕焱等利用Bacillus licheniformis CGMCC2876在培养基(g L-1) ：蔗糖15，尿素 1，酵母膏 1， KH2PO45， MnSO4H2O0.05， NaCl2 中，于 pH7.2， 200rpm， 37下摇床培养 48h，合成的生物絮凝剂含有 89% 多糖，絮凝活性达 750U mL-1( 专利号： ZL200910111262)。 0020 Asp.sojae AJ7002 合成的絮凝剂的主要活性成分是蛋白质和己糖胺 (Agricultural and Biological Chemistry,1976,。

25、40:619-624) ；生物絮凝剂 NOC-1 也是一种蛋白质，并且该蛋白质分子中含有较多的疏水氨基酸 (Agricultural and Biological Chemistry,1991,55:2663-2664)。包括丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸和天冬氨酸等，最大分子质量为 75 万。- 聚谷氨酸（-PGA）是由 L- 谷氨酸、 D- 谷氨酸单体通过酰胺键聚合而成的一种多肽分子 (Applied Microbiology and Biotechnology,2002,59(1):9-14)，分子中含有大量游离羧基，是一种生物可降解的新型生物絮凝剂。 0021 Shi。

26、h 等利用 Bacillus licheniformis CCRC12826 在培养基 (g L-1) ：谷氨酸 20，柠檬酸 12，甘油 120， NH4Cl7， MgSO47H2O0.5， FeCl3H2O0.004， K2HPO40.5 和 CaCl20.15 中，在 37， pH 为 6.5 的条件下发酵 96h 后得到 -PGA 的粘度为 17cp，其处理 Ca(OH)2溶液絮凝率达到 11OD-1(Bioresoure Technology2001,78:267-372)。 0022 Bacillus sp.PY-90 在基础培养基 (m/v) ：葡萄糖。

27、2.0%， K2HPO40.2%， MgS047H200.05%，多蛋白胨 1.0%，酵母提取物 0.05% 和琼脂 2.0% 中在 30条件下发酵 48h，所得 -PGA 在高岭土溶液絮凝活性为 15OD-1，当温度到 100时，絮凝活性开始降低 (Journal of Fermentation and Bioengineering1995,79:378-380)。 0023 Bacillus subtilis IFO3335 以培养基 (m/v) ：谷氨酸 3.0%， NH4Cl1.0%，说明书 CN 103937838 B 5 4/6 页 6 葡萄糖 1.0。

28、%， K2HPO40.2%，酵母提取物 0.2% 和 MgSO47H2O0.2%，在 30 条件下发酵 72h，所得 -PGA 在酸性黏土中絮凝率为 14OD-1(Journal of Fermentation and Bioengineering1996,82:84-87)。 0024 -PGA 生产菌 Ruditapes philippinarum ZHT4-13 在培养基 (g L-1) ：葡萄糖 20， (NH4)2SO40.2，尿素 0.5，酵母提取物 0.5， MgSO47H2O0.2， KH2PO42.0， K2HPO45.0 中在 3。

29、0， pH 为 8.0 的条件下发酵 4 天后处理高岭土的絮凝率达到 86.22%(Bioresource Technology2009,100:49965001)。 0025 -PGA 生产菌 Bacillus subtilis R23 在培养基 (g L-1) ：葡萄糖 52.5，柠檬酸 15.5， NaCl20， (NH4)2SO44.75， L- 谷氨酸 20， KCl0.66， K2HPO41， MgSO47H2O6.8， CaCl22H2O0.18， NaHCO30.18， MgCl26H2O4.7， - 酮戊二酸 5mM 和 MnSO47H2O0.05 。

30、中，在 372条件下发酵 48h 后处理高岭土的絮凝率达到 30.32OD-1(Food and Bioprocess Technology2011,4:745-752)。 0026 Bacillus licheniformis P-104 以培养基 (g L-1) ：谷氨酸钠 50，葡萄糖 50，柠檬酸钠 12， NH4Cl7， K2HPO40.5， MgSO47H2O0.5， CaCl22H2O0.15 和 MnSO47H2O0.104，在 37， pH为7.2的条件下发酵36h所得-PGA产量为41.6g L-1，产率为1.07g L-1h-1。稀释20倍后培养液絮凝活。

31、性可达46.662.89OD-1(Appl Biochem Biotechnol2013,170:562572)。 0027 严珊等利用 Bacillus licheniformis CGMCC2876 在培养基 (g L-1) ：柠檬酸三钠 20，甘油 20， NH4Cl9，谷氨酸钠 10， MgSO47H2O0.5， K2HPO40.5， pH7.2， 200rpm， 37条件下，培养20h，所得絮凝剂产量为21.8g L-1，其中-PGA含量为94.3%，絮凝活性达11679U mL-1 （参见中国专利 CN103194499A）。 0028 虽然目前有许多用微生物法生产。

32、以多糖类为主要成分或 -PGA 为主要成分的生物絮凝剂的研究较为详细，但是利用某一菌株在一种培养条件下同时合成以多糖类和 -PGA 为活性成分的生物絮凝剂的方法还鲜有报道。发明内容 0029 本发明的目的在于针对目前生物絮凝剂生产所存在的原料成本高、发酵周期长、絮凝活性低、热稳定性差、难以推广等问题，提供一种利用地衣芽孢杆菌同时合成两种不同成分生物絮凝剂的方法。 0030 本发明采用的微生物为地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis)，该微生物已于 2009 年 01 月 14 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号。

33、为 CGMCC No.2876（参见中国专利 CN101503709）。 0031 本发明的具体步骤如下： 0032 1）菌种活化：将地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis) 转接于斜面培养基培养； 0033 2）种子的制备：将新鲜平板上的单菌落转接至种子培养基中培养； 0034 3）发酵培养：将种子发酵液转接至发酵培养基培养，即得两种不同成分生物絮凝剂。 0035 在步骤 1）中，所述斜面培养基的组成可为（g L-1）：酵母膏 2、牛肉膏 2、胰蛋白胨 5、葡萄糖 15、 FeSO4微量、琼脂 18、 pH5 7.5 ；。

34、所述培养的条件可为 37下 200r/min 培养说明书 CN 103937838 B 6 5/6 页 7 12 18h。 0036 在步骤 2）中，所述种子培养基的组成可为（g L-1）：葡萄糖 10、酵母膏 0.5、尿素 0.5、 K2HPO40.1、 KH2PO40.1、 NaCl0.1、 MgSO47H2O0.2 ；所述培养的条件可为：温度 37，摇床转速 200r/min，培养时间 16h。 0037 在步骤 3）中，所述转接的接种量可为 3% ；所述发酵培养基的组成可为 (g L-1) ：葡萄糖 5 15、柠檬酸三钠 10 15、甘油。

35、 10 15、尿素 1 3、酵母膏 0.5 1、 NH4Cl2 6、谷氨酸钠 2 6、 MgSO40.3 0.5、 K2HPO40.5 2、 KH2PO41 5、 NaCl1 3， pH5 7.5 ；所述培养的条件可为在 200r/min，温度 37的条件下于摇瓶培养，装液量为 50mL/250mL，发酵时间为 16 48h，所得生物絮凝剂以多糖和 -PGA 为活性成分。 0038 本发明利用地衣芽孢杆菌一种培养条件下合成同时以多糖和 -PGA 为活性成分的生物絮凝剂，该方法具有的优点有原料成本较低、发酵周期短、合成出的絮凝剂活性高、热稳定性好；特别是多糖在酸。

36、性、中性条件下絮凝效果比较好， -PGA 在中性和碱性环境下絮凝活性较高，合成同时以多糖和 -PGA 为活性成分的生物絮凝剂满足了较大的 pH 适用范围，工业应用潜力大。附图说明 0039 图 1 为 Bacillus licheniformis CGMCC2876 的发酵曲线。 0040 图 2 为苯酚 - 硫酸法测定絮凝剂中总糖浓度。 0041 图 3 为 L-Glu 标准品离子色谱图。 0042 图 4 为絮凝剂水解液离子色谱图。具体实施方式 0043 以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明，以便为更好地理解本发明提供依据。 0044 实施例 1. 发酵培养基组成。

37、(g L-1) ：葡萄糖 12、柠檬酸三钠 15、甘油 15、尿素 2.5、酵母膏 0.6、 NH4Cl5、谷氨酸钠 5、 MgSO40.5、 K2HPO40.5、 KH2PO45、 NaCl2。发酵时间为 20h 时，絮凝活性达到 11179U mL-1（参见图 1）。 0045 实施例 2. 与实施例 1 相同培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中葡萄糖的浓度为 5g L-1。 0046 实施例 3. 与实施例 1 相同培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中葡萄糖的浓度为 15g L-1。 00。

38、47 实施例 4. 与实施例 1 相同培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中柠檬酸三钠的浓度为 10g L-1。 0048 实施例 5. 与实施例 1 相同培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中柠檬酸三钠的浓度为 12g L-1。 0049 实施例 6. 与实施例 1 相同培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中甘油的浓度为 10g L-1。 0050 实施例 7. 与实施例 1 相同培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中甘油的浓度为 1。

39、5g L-1。说明书 CN 103937838 B 7 6/6 页 8 0051 实施例 8. 与实施例 1 相同培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中尿素的浓度为 1g L-1。 0052 实施例 9. 与实施例 1 相同培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中尿素的浓度为 3g L-1。 0053 实施例10.与实施例1相同培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中酵母膏的浓度为 0.5g L-1。 0054 实施例11.与实施例1相同培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝。

40、剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中酵母膏的浓度为 1g L-1。 0055 实施例12.与实施例1相同培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中 NH4Cl 的浓度为 2g L-1。 0056 实施例13.与实施例1相同培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中 NH4Cl 的浓度为 6g L-1。 0057 实施例14.与实施例1相同培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中谷氨酸钠的浓度为 2g L-1。 0058 实施例15.与实施例1相同培养条件，考察发酵培养基组成对絮。

41、凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中谷氨酸钠的浓度为 6g L-1。 0059 实施例16.与实施例1相同培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中 MgSO4的浓度为 0.3g L -1。 0060 实施例17.与实施例1相同培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中 MgSO4的浓度为 0.4g L -1。 0061 实施例18.与实施例1相同培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中 K2HPO4的浓度为 1.2g L -1。 0062 实施例19.与实施例1相同培养条件，。

42、考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中 K2HPO4的浓度为 2g L -1。 0063 实施例20.与实施例1相同培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中 KH2PO4的浓度为 1g L -1。 0064 实施例21.与实施例1相同培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中 KH2PO4的浓度为 3g L -1。 0065 实施例22.与实施例1相同培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中 NaCl 的浓度为 1g L-1。 0066 实施例23.与实。

43、施例1相同培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中 NaCl 的浓度为 3g L-1。 0067 实施例 24. 与实施例 1 相同的培养条件，获得的絮凝剂利用苯酚 - 硫酸法测定其中多糖含量。（参见图 2） 0068 实施例 25. 与实施例 1 相同的培养条件，获得的絮凝剂利用离子色谱法检测其中的 - 聚谷氨酸（-PGA）。 0069 以 L- 谷氨酸标准品作为参照，利用离子色谱法对产物酸水解液进行分析。从图 3 和 4 中可以看出 L-Glu 标准品和产物水解液出峰时间在 29.1min 左右，确定发酵产物含有由谷氨酸单体组成的多肽。说明书 CN 103937838 B 8 1/2 页 9 图 1 图 2 说明书附图 CN 103937838 B 9 2/2 页 10 图 3 图 4 说明书附图 CN 103937838 B 10 。

摘要
申请专利号：	CN201410148579.6	申请日：	20140414
公开号：	CN103937838B	公开日：	20160203
当前法律状态：		有效性：	有效
法律详情：
IPC分类号：	C12P1/04,C12R1/10	主分类号：	C12P1/04,C12R1/10
申请人：	厦门大学
发明人：	何宁,姚昊晟,刘昱,余文成,严珊,王远鹏,李清彪
地址：	361005 福建省厦门市思明南路422号
优先权：	CN201410148579A
专利代理机构：	厦门南强之路专利事务所(普通合伙)	代理人：	马应森
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内容摘要

利用地衣芽孢杆菌同时合成两种不同成分生物絮凝剂的方法，涉及生物絮凝剂。将地衣芽孢杆菌(Bacillus?licheniformis)转接于斜面培养基培养；将新鲜平板上的单菌落转接至种子培养基中培养；将种子发酵液转接至发酵培养基培养，即得两种不同成分生物絮凝剂。利用地衣芽孢杆菌一种培养条件下合成同时以多糖和γ-PGA为活性成分的生物絮凝剂，原料成本较低、发酵周期短、合成出的絮凝剂活性高、热稳定性好；特别是多糖在酸性、中性条件下絮凝效果比较好，γ-PGA在中性和碱性环境下絮凝活性较高，合成同时以多糖和γ-PGA为活性成分的生物絮凝剂满足了较大的pH适用范围，工业应用潜力大。

权利要求书

1.利用地衣芽孢杆菌同时合成两种不同成分生物絮凝剂的方法，其特征在于其具体步骤如下：1)菌种活化：将地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)转接于斜面培养基培养；所述斜面培养基的组成为：酵母膏2g/L、牛肉膏2g/L、胰蛋白胨5g/L、葡萄糖15g/L、FeSO微量、琼脂18g/L、pH5～7.5；2)种子的制备：将新鲜平板上的单菌落转接至种子培养基中培养，得种子发酵液；所述种子培养基的组成为：葡萄糖10g/L、酵母膏0.5g/L、尿素0.5g/L、KHPO0.1g/L、KHPO0.1g/L、NaCl0.1g/L、MgSO·7HO0.2g/L；3)发酵培养：将种子发酵液转接至发酵培养基培养，即得两种不同成分生物絮凝剂；所述发酵培养基的组成为：葡萄糖5～15g/L、柠檬酸三钠10～15g/L、甘油10～15g/L、尿素1～3g/L、酵母膏0.5～1g/L、NHCl2～6g/L、谷氨酸钠2～6g/L、MgSO0.3～0.5g/L、KHPO0.5～2g/L、KHPO1～5g/L、NaCl1～3g/L，pH5～7.5；所述两种不同成分生物絮凝剂以多糖和γ-PGA为活性成分。 2.如权利要求1所述利用地衣芽孢杆菌同时合成两种不同成分生物絮凝剂的方法，其特征在于在步骤1)中，所述培养的条件为37℃下200r/min培养12～18h。 3.如权利要求1所述利用地衣芽孢杆菌同时合成两种不同成分生物絮凝剂的方法，其特征在于在步骤2)中，所述培养的条件为：温度37℃，摇床转速200r/min，培养时间16h。 4.如权利要求1所述利用地衣芽孢杆菌同时合成两种不同成分生物絮凝剂的方法，其特征在于在步骤3)中，所述转接的接种量为3％。 5.如权利要求1所述利用地衣芽孢杆菌同时合成两种不同成分生物絮凝剂的方法，其特征在于在步骤3)中，所述培养的条件为在200r/min，温度37℃的条件下于摇瓶培养，装液量为50mL/250mL，发酵时间为16～48h。

说明书

技术领域

本发明涉及生物絮凝剂，尤其是涉及利用地衣芽孢杆菌同时合成两种不同成分生物絮凝剂的方法。

背景技术

生物絮凝剂是具有絮凝活性的微生物次生代谢产物或化学改性天然有机高分子，是利用生物技术，通过培养微生物的方法得到的一类新型絮凝剂，其化学成份主要是糖蛋白、多糖、蛋白质、纤维素和核酸等物质，分子量约为几十万以上(华中科技大学学报(城市科学版)2004, 6:23-25)。絮凝性微生物能使离散微粒包括菌体细胞自身之间互相粘附，并能使胶体脱稳，形成絮状沉淀而从反应体系中分离。

微生物的絮凝现象最早发现于酿酒工业中，法国LouisPasteur于1876年发现了发酵后期的酵母菌Levurecasseeuse具有絮凝能力。20世纪50年代，日本学者发现微生物培养液具有絮凝作用。1976年，J.Nakamura等人对能产生絮凝效果的微生物进行了专门研究，掀起了微生物絮凝剂的研究热潮(AgricBiolChem,1976,40(2):377-383)。在水处理中，传统的化学絮凝剂不仅具有投加量多、产泥量大的特点，而且产生的化学污泥不易被生物降解，排放至水体中对人体健康和水环境生态都具有潜在的危害作用。因此，化学絮凝剂在应用范围和使用条件上受到了限制，前景不容乐观。生物絮凝剂不仅具有普通絮凝剂所具有的絮凝性能，还具有普通絮凝剂所不具备的用量少、絮凝效果好、絮体易于分离、易生物降解、无二次污染、对人类健康无害、适用范围广等优点。因此，生物絮凝剂的研制和应用已成为新型高效絮凝剂开发的热点和重点。

生物絮凝剂按化学组成分类可分成多肽或蛋白质、多糖、脂类和DNA等类型。其中目前比较常见的是多糖类以及多肽或蛋白质类。

目前已经鉴定的生物絮凝剂有很多种属于多糖类物质。Paecilomycessp.I-1产生的PF-101 絮凝剂则是由氨基半乳糖以α-1,4-糖苷键相连而成的粘多糖(AgriculturalandBiological Chemistry,1985,49(11):3159-3164)。Rhizobiumsp.产生的絮凝剂的主要组分是纤维素，常附着于产生菌细胞壁上，直接引起菌细胞的絮凝沉降(AppliedMicrobiology,1975,30(1):123-131)。

SorangiumcellulosumNUST06在培养基(m/v)：淀粉30gL-1，葡萄糖2gL-1，K2HPO40.2%，CaCl20.01%，MgSO40.03%，FeCl20.001%，KNO30.3%中，以30℃，pH为7.5的条件培养36h，多糖絮凝剂产量可达17.5gL-1，占总产物的58.5%。其中葡萄糖、甘露糖、葡萄糖醛酸各单体所占比例分别为51.3%，39.2%，19.5%。最高絮凝率可达99.5%(Lettersin AppliedMicrobiology2002,34：178–181)。

KazukiTOEDA利用AlcaligenescupidusKT201以培养基(m/v)：蔗糖2%，(NH4)2SO40.01 %，CaCl2·2H2O0.002%，MgSO4·7H2O0.02%，NaCl20.01%，FeSO4·7H2O0.001%，KH2PO40.16%和酵母提取物0.02%，在30℃条件下培养6～8天，产生的多糖絮凝剂中葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和乙酸各单体所占比例分别为42.57%，36.38%，8.52%和10.3%。最高絮凝活性大约为10.8OD-1(AgriculturalandBiologicalChemistry,1991,55(11):2793-2799)。

Bacillussp.DP-152以培养基(gL-1)：葡萄糖40，NH4NO31.0，K2HPO40.3，KH2PO40.3， MgSO4.7H2O0.1，MnSO4.4H2O0.1，NaCl0.05，CaCO30.4，酵母提取物0.1，大豆蛋白胨 0.1和胰蛋白胨0.1，在30℃，pH为7.0条件下培养3天，产生的多糖中葡萄糖、甘露糖、半乳糖和海藻糖单体比例为8:4:2:1。最高絮凝活性大约为43OD-1(JournalofFermentationand Bioengineering,1997,84(2):108-112)。

S.B.Deng等利用Bacillusmucilaginosus以培养基(gL-1)：可溶性淀粉1.5，K2HPO40.6，酵母提取物0.02，MgSO4.7H2O0.02，NaCl0.01，在30℃，pH为8.0的最适宜条件下培养72 h，产生的生物絮凝剂MBFA9主要成分为多糖，其中糖醛酸、中性糖和氨基糖所占的比例分别为19.1%，47.4%和2.7%。处理高岭土的最高絮凝率为99.6%(ApplMicrobiol Biotechnol,2003,60:588–593)。

CorynebacteriumglutamicumCCTCCM201005在培养基(L-1)：蔗糖17g，玉米浸泡液5 ml，尿素0.45g，KH2PO40.1g，NaCl0.1gandMgSO4·7H2O0.1g中在28℃，pH为7.8的条件下培养48h，产生的生物絮凝剂REA-11主要由半乳糖醛酸组成(BiochemicalEngineering Journal,2002,11:137–148)，絮凝活性可达520U/mL(BioresourceTechnology2004,94: 99–105)。

H.Salehizadeh利用Bacillussp.As-101以培养基(m/v)：蛋白胨0.5%，(NH4)2SO40.2%，酵母粉0.1%，CaCl2·2H2O0.07%，MgSO4·7H2O0.02%，NaCl20.01%，K2HPO40.1%，葡萄糖0.1%和琼脂0.3%，在30℃条件下培养10～15h，产生的生物絮凝剂中83%的成分是多糖，其余为蛋白质。组成该多糖的单体分别为葡萄糖、半乳糖、甘露糖，糖醛酸，丙酮酸和乙酸。最高絮凝活性为27OD-1。100℃处理15分钟后，絮凝活性降低50%(Biochemical EngineeringJournal2000,5:39–44)。

Aspergillusparasiticus以培养基(L-1)：蔗糖30，NaNO33.0，MgSO4·7H2O0.5，KCl0.5， FeSO40.01，KH2PO41.0，在28℃初始pH为5.0～6.0的条件下培养3天，所得生物絮凝剂中含76.3 %多糖。处理高岭土时，絮凝率最高可达98.1%，对印染废水的脱色率也高于96%(Colloidsand SurfacesB:Biointerfaces2005,44:179–186)。

ProteusmirabilisTJ-1以培养基(gL-1)：葡萄糖10，胰蛋白胨1，K2HPO45，KH2PO42， MgSO4.7H2O0.3，在30℃，pH为7.0条件下培养48h，产生的生物絮凝剂中63.1%(w/w)为多糖。其中中性糖、糖醛酸、氨基糖比例为8.2:5.3:1。最高絮凝率为93.13%(Bioresource Technology2008,99:6520–6527)。

Bacillussp.F19以培养基(gL-1)：葡萄糖10，酵母提取物0.5，(NH4)2SO40.2，K2HPO45， KH2PO42，尿素0.5，NaCl0.1，在30℃，pH为7.0的条件下培养48h，产生的生物絮凝剂MBFF19 为糖蛋白衍生物，其中中性糖、糖醛酸、氨基糖和蛋白质所占比例（w/w）分别为3.6%、37.0 %、0.5%和16.4%，而两种中性糖的比例为1.2:1。处理高岭土的最高絮凝率为97%(Bioresource Technology2008,99:7686–7691)。

BacilluslicheniformisX14以培养基(gL-1)：葡萄糖20，酵母提取物0.5，尿素0.5， (NH4)2SO40.2，MgSO4.7H2O0.2，K2HPO45，KH2PO42，NaCl0.1，在37℃，pH为8.0的最适条件下培养48h，产生的生物絮凝剂ZS-7含91.5%(w/w)的多糖，其中糖醛酸、丙酮酸和乙酸占总产物比例为16.4%、7.1%和0.5%。处理高岭土的最高絮凝率为99.2%，对低温饮用水的CODMn和浑浊度去除率分别为61.2%和95.6%(BioresourceTechnology2009,100: 3650–3656)。

AspergillusflavusS44-1以培养基(gL-1)：蔗糖30，胰蛋白胨3.0，MgSO4·7H2O0.5，KCl 0.5，FeSO40.01，KH2PO41.0，在30℃，pH为6.0的条件下培养3天，产生的生物絮凝剂IH-7 含69.7%(w/w)的多糖，其中中性糖、糖醛酸和氨基糖占总产物比例为40%、2.48%和1.8%。中性糖组成成分为蔗糖、乳糖、葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖和果糖，比例是2.4∶4.4∶4.1∶ 5.8∶9.9∶0.8∶3.1。处理高岭土的絮凝率可达95%以上(BioresourceTechnology2013,127∶ 489–493)。

KlebsiellapneumoniaeLZ-5以培养基(gL-1)：葡萄糖20，酵母提取物0.5，尿素0.5， (NH4)2SO40.2，K2HPO45，KH2PO42，NaCl0.1，，在30℃，pH为8.0的条件下培养3天，产生的生物絮凝剂MBF-5含96.8%(w/w)的多糖和2.1%蛋白质，其中中性糖、糖醛酸和氨基糖占总产物比例为50%、3.44%和4.2%。中性糖组成成分为葡萄糖、甘露糖、半乳糖、和氨基葡萄糖，比例是4.1∶1.3∶2.7∶3.2。处理高岭土的絮凝率可达98%上(BioresourceTechnology 2013,137:226–232)。

OchrobactrumciceriW2以培养基(gL-1)：葡萄糖或果糖10，酵母提取物0.5，尿素0.5， (NH4)2SO40.2，MgSO40.2，K2HPO45，KH2PO42，NaCl0.1，在30℃，pH为7.5的最适条件下培养16h，产生由多糖和蛋白质组成的生物絮凝剂达最高产量3.8gL-1，30h时处理高岭土的絮凝率达最高，为92%(BioresourceTechnology,doi:10.1016/j.biortech.2012.11.020)。

熊裕焱等利用BacilluslicheniformisCGMCC2876在培养基(gL-1)：蔗糖15，尿素1，酵母膏1，KH2PO45，MnSO4·H2O0.05，NaCl2中，于pH7.2，200rpm，37℃下摇床培养48h，合成的生物絮凝剂含有89%多糖，絮凝活性达750UmL-1(专利号：ZL200910111262)。

Asp.sojaeAJ7002合成的絮凝剂的主要活性成分是蛋白质和己糖胺(Agriculturaland BiologicalChemistry,1976,40:619-624)；生物絮凝剂NOC-1也是一种蛋白质，并且该蛋白质分子中含有较多的疏水氨基酸(AgriculturalandBiologicalChemistry,1991,55:2663-2664)。包括丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸和天冬氨酸等，最大分子质量为75万。γ-聚谷氨酸（γ-PGA）是由 L-谷氨酸、D-谷氨酸单体通过酰胺键聚合而成的一种多肽分子(AppliedMicrobiologyand Biotechnology,2002,59(1):9-14)，分子中含有大量游离羧基，是一种生物可降解的新型生物絮凝剂。

Shih等利用BacilluslicheniformisCCRC12826在培养基(gL-1)：谷氨酸20，柠檬酸12，甘油120，NH4Cl7，MgSO4·7H2O0.5，FeCl3·H2O0.004，K2HPO40.5和CaCl20.15中，在37 ℃，pH为6.5的条件下发酵96h后得到γ-PGA的粘度为17cp，其处理Ca(OH)2溶液絮凝率达到11OD-1(BioresoureTechnology2001,78:267-372)。

Bacillussp.PY-90在基础培养基(m/v)：葡萄糖2.0%，K2HPO40.2%，MgS04·7H200.05 %，多蛋白胨1.0%，酵母提取物0.05%和琼脂2.0%中在30℃条件下发酵48h，所得γ-PGA 在高岭土溶液絮凝活性为15OD-1，当温度到100℃时，絮凝活性开始降低(Journalof FermentationandBioengineering1995,79:378-380)。

BacillussubtilisIFO3335以培养基(m/v)：谷氨酸3.0%，NH4Cl1.0%，葡萄糖1.0%， K2HPO40.2%，酵母提取物0.2%和MgSO4·7H2O0.2%，在30℃条件下发酵72h，所得γ-PGA 在酸性黏土中絮凝率为14OD-1(JournalofFermentationandBioengineering1996,82:84-87)。

γ-PGA生产菌RuditapesphilippinarumZHT4-13在培养基(gL-1)：葡萄糖20，(NH4)2SO40.2，尿素0.5，酵母提取物0.5，MgSO4·7H2O0.2，KH2PO42.0，K2HPO45.0中在30℃，pH 为8.0的条件下发酵4天后处理高岭土的絮凝率达到86.22%(BioresourceTechnology2009,100: 4996–5001)。

γ-PGA生产菌BacillussubtilisR23在培养基(gL-1)：葡萄糖52.5，柠檬酸15.5，NaCl20， (NH4)2SO44.75，L-谷氨酸20，KCl0.66，K2HPO41，MgSO4·7H2O6.8，CaCl2·2H2O0.18， NaHCO30.18，MgCl2·6H2O4.7，α-酮戊二酸5mM和MnSO4·7H2O0.05中，在37±2℃条件下发酵48h后处理高岭土的絮凝率达到30.32OD-1(FoodandBioprocessTechnology2011,4: 745-752)。

BacilluslicheniformisP-104以培养基(gL-1)：谷氨酸钠50，葡萄糖50，柠檬酸钠12， NH4Cl7，K2HPO40.5，MgSO4·7H2O0.5，CaCl2·2H2O0.15和MnSO4·7H2O0.104，在37℃， pH为7.2的条件下发酵36h所得γ-PGA产量为41.6gL-1，产率为1.07gL-1h-1。稀释20倍后培养液絮凝活性可达46.66±2.89OD-1(ApplBiochemBiotechnol2013,170:562–572)。

严珊等利用BacilluslicheniformisCGMCC2876在培养基(gL-1)：柠檬酸三钠20，甘油 20，NH4Cl9，谷氨酸钠10，MgSO4·7H2O0.5，K2HPO40.5，pH7.2，200rpm，37℃条件下，培养20h，所得絮凝剂产量为21.8gL-1，其中γ-PGA含量为94.3%，絮凝活性达11679 UmL-1（参见中国专利CN103194499A）。

虽然目前有许多用微生物法生产以多糖类为主要成分或γ-PGA为主要成分的生物絮凝剂的研究较为详细，但是利用某一菌株在一种培养条件下同时合成以多糖类和γ-PGA为活性成分的生物絮凝剂的方法还鲜有报道。

发明内容

本发明的目的在于针对目前生物絮凝剂生产所存在的原料成本高、发酵周期长、絮凝活性低、热稳定性差、难以推广等问题，提供一种利用地衣芽孢杆菌同时合成两种不同成分生物絮凝剂的方法。

本发明采用的微生物为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)，该微生物已于2009年01月 14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为 CGMCCNo.2876（参见中国专利CN101503709）。

本发明的具体步骤如下：

1）菌种活化：将地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)转接于斜面培养基培养；

2）种子的制备：将新鲜平板上的单菌落转接至种子培养基中培养；

3）发酵培养：将种子发酵液转接至发酵培养基培养，即得两种不同成分生物絮凝剂。

在步骤1）中，所述斜面培养基的组成可为（gL-1）：酵母膏2、牛肉膏2、胰蛋白胨5、葡萄糖15、FeSO4微量、琼脂18、pH5～7.5；所述培养的条件可为37℃下200r/min培养 12～18h。

在步骤2）中，所述种子培养基的组成可为（gL-1）：葡萄糖10、酵母膏0.5、尿素0.5、 K2HPO40.1、KH2PO40.1、NaCl0.1、MgSO4·7H2O0.2；所述培养的条件可为：温度37℃，摇床转速200r/min，培养时间16h。

在步骤3）中，所述转接的接种量可为3%；所述发酵培养基的组成可为(gL-1)：葡萄糖 5～15、柠檬酸三钠10～15、甘油10～15、尿素1～3、酵母膏0.5～1、NH4Cl2～6、谷氨酸钠 2～6、MgSO40.3～0.5、K2HPO40.5～2、KH2PO41～5、NaCl1～3，pH5～7.5；所述培养的条件可为在200r/min，温度37℃的条件下于摇瓶培养，装液量为50mL/250mL，发酵时间为 16～48h，所得生物絮凝剂以多糖和γ-PGA为活性成分。

本发明利用地衣芽孢杆菌一种培养条件下合成同时以多糖和γ-PGA为活性成分的生物絮凝剂，该方法具有的优点有原料成本较低、发酵周期短、合成出的絮凝剂活性高、热稳定性好；特别是多糖在酸性、中性条件下絮凝效果比较好，γ-PGA在中性和碱性环境下絮凝活性较高，合成同时以多糖和γ-PGA为活性成分的生物絮凝剂满足了较大的pH适用范围，工业应用潜力大。

附图说明

图1为BacilluslicheniformisCGMCC2876的发酵曲线。

图2为苯酚-硫酸法测定絮凝剂中总糖浓度。

图3为L-Glu标准品离子色谱图。

图4为絮凝剂水解液离子色谱图。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明，以便为更好地理解本发明提供依据。

实施例1.发酵培养基组成(gL-1)：葡萄糖12、柠檬酸三钠15、甘油15、尿素2.5、酵母膏0.6、NH4Cl5、谷氨酸钠5、MgSO40.5、K2HPO40.5、KH2PO45、NaCl2。发酵时间为 20h时，絮凝活性达到11179UmL-1（参见图1）。

实施例2.与实施例1相同培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中葡萄糖的浓度为5gL-1。

实施例3.与实施例1相同培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中葡萄糖的浓度为15gL-1。

实施例4.与实施例1相同培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中柠檬酸三钠的浓度为10gL-1。

实施例5.与实施例1相同培养条件，考察发酵培养基组成对絮凝剂合成的影响。其区别在于所用发酵培养基中柠檬酸三钠的浓度为12gL-1。