一种从大肠杆菌悬浮液中提取谷胱甘肽的方法.pdf

《一种从大肠杆菌悬浮液中提取谷胱甘肽的方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种从大肠杆菌悬浮液中提取谷胱甘肽的方法.pdf（5页完整版）》请在专利查询网上搜索。

1、(10)授权公告号 CN 102942615 B (45)授权公告日 2014.10.29 CN 102942615 B (21)申请号 201210411921.8 (22)申请日 2012.10.25 C07K 5/037(2006.01) C07K 1/18(2006.01) (73)专利权人 广东肇庆星湖生物科技股份有限 公司 地址 526040 广东省肇庆市端州区工农北路 67 号 (72)发明人 朱义福 吴平刚 周新荣 (74)专利代理机构 深圳市君盈知识产权事务所 ( 普通合伙 ) 44315 代理人 杨利娟 CN 101054560 A,2007.10.17, 陈 坚 等 . 。

2、培养模式对重组大肠杆菌高 密度培养生产谷胱甘肽的影响 .生物工程学 报 .1998, 第 14 卷 ( 第 4 期 ),452-455. 廖鲜艳 等 . 用于谷胱甘肽合成的重组大肠 杆菌的培养和诱导表达 .过程工程学报 .2007, 第 7 卷 ( 第 1 期 ),124-128. 李 寅 等 . 重组大肠杆菌生产谷胱甘肽发酵 条件的研究 .微生物学报 .1999, 第 39 卷 ( 第 4 期 ),355-361. (54) 发明名称 一种从大肠杆菌悬浮液中提取谷胱甘肽的方 法 (57) 摘要 本发明公开了一种从大肠杆菌中提取谷胱甘 肽的方法， 是通过调节大肠杆菌悬浮液的 pH 值、 高压匀。

3、质破壁、 离心分离得到上清液， 再使用离子 交换树脂去除大分子杂质和脂类色素， 将离子交 换纯化液低温浓缩后， 冷冻干燥最终达到从大肠 杆菌中分离纯化还原型谷胱甘肽成品。制得谷胱 甘肽成品GSH产品的纯度95%以上、 蛋白质含量为 1.3%、 提取收率为 86.5%。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 劳芳 权利要求书 1 页 说明书 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书3页 (10)授权公告号 CN 102942615 B CN 102942615 B 1/1 页 2 1. 一种从大肠杆菌悬浮液中提取谷胱甘肽的方法， 其特征步。

4、骤如下 ： (1) 用 20.5mol/LH2SO4调节大肠杆菌悬浮液的 pH 值为 2-3, 经过 2.50.5MPa 匀浆 均质机破壁得破壁好的悬浮液， 所述的破壁时间为 45-60min ； (2) 将破壁好的悬浮液离心得到离心上清液， 离心转速为 5000100rpm， 时间为 10-15min ； (3) 将离心上清液经阳离子交换树脂和阴离子交换树脂连续吸附与解吸， 收集富含谷 胱甘肽的高峰液 ； (4) 将谷胱甘肽高峰液进行真空浓缩成谷胱甘肽浓缩液， 再将谷胱甘肽浓缩液冷冻干 燥即得白色粉末状谷胱甘肽成品 ； 所述步骤 3 的阳离子交换树脂是指将型号为 D001 阳离子交换树脂装柱。

5、， 柱体积 6cm80cm， 将离心上清液直接上柱， 其上柱时 pH 值为 2-3， 流速为 100ml/min， 上样直至饱 和 ； 用 3-5 倍柱体积的 pH 值为 4.0 的 PBS 缓冲液洗树脂柱， 将杂质洗去， 再用 3-5 倍柱体积 的 1.5 HCl 洗脱， 其洗脱速度为 100ml/min， 洗脱收集 D001 阳离子高峰液 ； 所述步骤 3 的阴离子交换树脂是指将型号为 D293 阴离子交换树脂装柱， 柱体积 6cm80cm， 将 D001 阳离子高峰液直接上柱， 速度为 100ml/min， 收集富含谷胱甘肽的高峰 液 ； 所述步骤 4 的真空浓缩条件是真空度 0.90.。

6、1MPa， 旋转速度 13020rpm， 温度 35 -60， 浓缩至谷胱甘肽高峰液重量百分浓度的 8-10 倍， 得谷胱甘肽浓缩液 ； 所述步骤4的冷冻干燥条件是将谷胱甘肽浓缩液在-725下干燥282h， 即得白色 粉末状谷胱甘肽成品。 权 利 要 求 书 CN 102942615 B 2 1/3 页 3 一种从大肠杆菌悬浮液中提取谷胱甘肽的方法 技术领域 0001 本发明属于生物化工领域 , 涉及一种从大肠杆菌悬浮液中提取、 制备低蛋白质含 量、 高品质的谷胱甘肽的方法， 属于谷胱甘肽制备技术领域。 背景技术 0002 谷胱甘肽， 即是 L 谷氨酰 -L 半胱氨酰甘氨酸 ( 缩写 GSH)。

7、， 是由 L- 谷氨酸、 L 半胱氨酰和甘氨酸经肽键缩合而成的一种同时具有谷氨酰基和巯基的生物活性三肽化 合物。谷胱甘肽有两种形式 : 还原型 GSH 和氧化型 GSSG, 只有 GSH 才具有活性， 而生物体 内的 GSSG 需还原后才能发挥其重要的生理功能。还原型谷胱甘肽固体较为稳定， 但其水溶 液在空气中极易被氧化成氧化型谷胱甘肽 GSSG。 GSH 在自然界中广泛分布于动物、 植物和 微生物细胞内。 GSH在生物体内有着多种重要的生理功能， 特别是对于维持生物体内适宜的 氧化还原环境起着至关重要的作用。 GSH还具有独特的生理功能， 被称为长寿因子和抗衰老 因子。由于 GSH 在强化食。

8、品风味的同时对人体有保健作用， 它的应用前景显然要优于其它 类型的防腐剂或抗氧化剂。 随着GSH的生理生化功能和性质被不断研究发现， GSH作为一种 多功能的生物活性添加剂在食品加工业中的应用将会愈来愈广， GSH 的需求量正日益增大。 0003 生物发酵法生产谷胱甘肽的方法不断得到改进， 已经成为目前国内外生产谷胱甘 肽最普遍的方法。但要从菌体发酵液中获得纯度很高的 GSH， 一直成为国内外研究的热点。 到目前为止报道的分离提纯 GSH 的方法有铜盐法、 离子交换、 亲和层析、 双水相分离等。铜 盐法是一种比较传统的方法， 有一定实用价值， 目前仍然被一些 GSH 生产工艺所应用， 但污 染。

9、较大， 工艺复杂， 所以随着各项新的分离纯化技术的出现， 必将逐渐被淘汰。由于氨基酸 和多肽类物质为具有弱碱性和弱酸性官能团的两性化合物， 因此采用阴阳离子交换树脂吸 附、 解吸的方法来使得氨基酸和肤类化合物和其他物质快速有效的分离。该方法经济效益 较高， 可望完全代替铜盐法。亲和层析方法是一种有效的分离纯化 GSH 的方法。一般而言 含汞树脂对酸碱比较敏感， 稳定性比较差， 在工业应用上有一定的限制。 0004 近年来我国离子交换树脂工业发展迅速， 国产离子交换树脂的价格相对于进口树 脂价格大大降低， 使得离子交换法在生化物质的分离方面的研究不断深入。离子交换法能 够将带电情况不同的物质进行。

10、分离， 广泛应用于天然活性成分的研究中。 对于离子交换法， 国内外对阳离子交换树脂的研究比较多， 但大多 GSH 的回收率很低， 只达到 32.9%-57.6%， 同时获得的产品纯度普遍较低。 发明内容 0005 本发明的目的是克服现有技术存在的不足， 提供一种从大肠杆菌悬浮液中提取谷 胱甘肽的方法， 是利用生物发酵法在大肠杆菌中表达积累谷胱甘肽后， 通过先进的分离纯 化手段制备高品质、 高含量的谷胱甘肽的方法， 制备的产品以富含谷胱甘肽的作为高端食 品添加剂存在。 0006 为解决上述技术问题， 本发明所提供的技术方案是 ： 一种从大肠杆菌悬浮液中提 说 明 书 CN 102942615 B。

11、 3 2/3 页 4 取谷胱甘肽的方法， 包括步骤如下 ： 0007 (1) 用 20.5molH2S04调节大肠杆菌悬浮液的 pH 值为 2-3, 经过 2.50.5MPa 匀 浆均质机破壁得破壁好的悬浮液， 所述的破壁时间为 45-60min ； 0008 (2) 将破壁好的悬浮液离心得到离心上清液， 离心转速为 5000 100rpm， 时间为 10-15 min ； 0009 （3） 将离心上清液经阳离子交换树脂和阴离子交换树脂连续吸附与解吸， 收集富 含谷胱甘肽的高峰液 ； 0010 （4） 将谷胱甘肽高峰液进行低温浓缩成谷胱甘肽浓缩液， 再将谷胱甘肽浓缩液冷 冻干燥即得白色粉末状谷。

12、胱甘肽成品。 0011 进一步 ： 在上述从大肠杆菌悬浮液中提取谷胱甘肽的方法中， 所述步骤 3 的阳离 子树脂交换是指将型号为 D001 阳离子交换树脂装柱， 柱体积 6cm80cm， 将离心上清液直 接上柱， 其上柱时 pH 值为 2-3， 流速为 100ml/min， 上样直至饱和 ； 用 3-5 倍柱体积的以盐 酸调 pH 值为 4 的蒸馏水洗树脂柱， 将杂质洗去， 再用 3-5 倍柱体积的 1.5%HCl 洗脱， 其洗 脱速度为 100ml/min， 洗脱收集 D001 阳离子高峰液。所述步骤 3 的阴离子树脂交换是指将 型号为 D293 阴离子交换树脂装柱， 柱体积 6cm80cm。

13、， 将 D001 阳离子高峰液直接上柱， 速 度为 100ml/min， 收集富含谷胱甘肽的高峰液。所述步骤 4 的低温真空浓缩条件是真空度 0.90.1MPa， 旋转速度 13020 rpm， 温度 55-60， 浓缩至谷胱甘肽高峰液重量百分浓度 的 8-10 倍， 得谷胱甘肽浓缩液。所述步骤 4 的冷冻干燥条件是将谷胱甘肽在低温条件下经 纳滤浓缩与真空低温浓缩后的浓缩液在 -725下干燥 282h， 即得白色粉末状谷胱甘 肽成品。 0012 与现有技术相比， 本发明从谷胱甘肽大肠杆菌的悬浮液中提取 GSH 的过程分为提 取和浓缩两个部分， 提取为从含有谷胱甘肽的大肠杆菌中， 通过菌体破壁抽。

14、提， 悬浮液的固 液分离， 得到含有谷胱甘肽的上清液， 经过离子交换树脂技术、 代温纳滤浓缩、 真空低温浓 缩、 冷冻干燥得到 GSH。用 2molH2S04调节 pH 值， 经过高压匀质器破壁， 高速离心得到含有 的谷胱甘肽的上清液。采用在破壁前调节 pH 值， 不仅有利于 GSH 的稳定， 而且可以使大分 子蛋白质变性沉淀， 除去大部分蛋白质。阳阴离子交换技术去除大分子杂质和脂类色素物 质， 最终达到从悬浮液中分离、 纯化、 浓缩谷胱甘肽的操作工序， 有效的去除菌体细胞碎片、 大分子蛋白、 有色物质， 尤其是离子交换技术适合大规模的工业化生产。该法操作简单、 高 效、 费用低廉、 成品纯度。

15、较高、 环境污染小、 易于工业化。制得 GSH 产品的纯度为 95% 以上、 蛋白质含量为 1.3%、 提取收率为 86.5% 的谷胱甘肽成品。 具体实施方式 0013 为更好理解本发明， 下面结合实施例对本发明作进一步介绍， 但需要说明的是， 本 发明所要求的保护的范围并不局限于实施例所表述的范围。 0014 实施例 1 0015 发酵培养得到的谷胱甘肽大肠杆菌悬浮液， 成份分析结果:菌体275g/L;GSH含量 3.95 g/L。将上述 30L 悬浮液用 2 mo1/L 硫酸调节 pH 至 2-3 范围内， 经过高压匀质器破壁 45-60min， 将破碎好的悬浮液， 经高速冷冻离心机分离，。

16、 条件 ： 5 -10， 5000rpm， 15min。 得到离心上清液12L,取12L上清液直接上D001阳离子交换树脂柱， 柱体积为6m80cm， 流 说 明 书 CN 102942615 B 4 3/3 页 5 速为100ml/min， 上样直至饱和;用3-5倍柱体积的pH 4.0的PBS缓冲液洗树脂柱， 将杂质 洗去， 再用3-5倍柱体积的1.5% HCl洗脱， 其洗脱速度为100ml/min， 洗脱收集富含D001阳 离子高峰液。再将 D001 阳离子高峰液直接上 D293 阴离子交换树脂柱， 速度为 100ml/min， 收集富含谷胱甘肽的脱色高峰。此时 GSH 回收率为 93.1。

17、， 蛋白质去除率为 78%。将上述经 吸附柱浓缩后的谷胱甘肽浓缩液进行真空浓缩， 按照下列条件进行 : 真空度 0.9MPa， 旋转 速度 130 rpm， 温度 35 -60浓缩至 8 倍。将谷胱甘肽浓缩液进行冷冻干燥， 于 -72下 干燥28 h后得到白色粉末状谷胱甘肽成品。 此时谷胱甘肽的纯含量为102.52 g， 提取收率 为 86.5% 。谷胱甘肽呈白色粉末状物质， 具有良好的感官品质。 0016 对比实施例 1 0017 改变破壁 pH。在破壁前不用硫酸所调 pH 值， 其它操作同实施例 1 一样操作。 0018 结果 : 谷肤甘肽的纯含量为 36.85g， 提取收率为 31.1%。

18、 0019 对比实施例 2 0020 改变所用的洗脱剂， 将 1.5% 的 HCl 改为采用 1.5%NaCl 为洗脱剂。其他操作同实 施例 1。结果 : 提取收率为 72.4%， 蛋白质去除率 40.6% 0021 对比实施例 3 0022 阳离子交换树脂前不用调节 PH 值， 其他操作同实施例 1， 结果离交后因杂质太多， 无法离交高峰的纯度明显下降， 纯含量只有 38.32%。 0023 对比实施例 4 0024 依照实施例 1 方法， 将谷胱甘肽低温浓缩液进行真空干燥， 最终得到谷胱甘肽 26.43g， 提取收率为 22.3%。 0025 对比实施例 5 0026 对比其他的干燥方式， 冻干的损失率最低， 真空烘干损失率 ： 69.3% ； 鼓风烘干损 失率 ： 87.7%。 0027 通过上述对比说明， 本发明操作简单、 高效、 费用低廉、 成品纯度较高、 环境污染 小、 易于工业化。 说 明 书 CN 102942615 B 5 。