技术领域
本发明涉及分子生物学和医学领域。更具体地，本发明涉及一种长效重组 人生长激素的Fc融合蛋白及其制法和用途。
背景技术
人生长激素(hGH)是由脑下垂体产生和释放，全长191个氨基酸、分子量为 22kDa的肽类激素。它参与了大部分人的正常生长和发育的调控，是刺激身体生 长的主要激素，并呈现出多种生物效应，包括线性增长、体质形成、泌乳、巨 噬细胞活化以及类似胰岛素作用等。此外，生长激素还可以刺激骨骼、软骨和 肌肉的代谢。
生长激素与其特异生长激素受体(hGHR)在靶点细胞表面相互结合，介导出 生化串联反应，从而激活生物效应。生长激素与受体分子的结合通常遵循一种 序贯机制；先通过生长激素内的结合位点1与第一个受体分子结合，其后再通过 生长激素的结合位点2与第二个受体分子结合。这种由一个生长激素分子与两个 生长激素受体分子的结合是激化生物活性、调节生长和发育所必需的步骤。具 体地，结合位点2包含了生长激素分子N端的8个氨基酸和其他几个来自属于螺 旋线1和螺旋线3内的氨基酸。结合位点1则包括生长激素分子在螺旋线1之内的 氨基酸以及C-端附近的氨基酸。结合位点1的8个氨基酸占了结合总能量的85％。 换言之，这8个氨基酸在与受体结合的过程中扮演了决定性的角色。若将这8个 氨基酸残基的位置以其它氨基酸取代，将会迅速改变其与生长激素受体结合的 能力(例如见，Wells et al.Recent Prog.Horm.Res.，48：253-75，1993)。这8 种氨基酸位于螺旋线1和螺旋线2之间段(K41，L45，P61，R64)和螺旋线4内的 羧基C端半段(K172，T175，F176，R178)，而其后段4个氨基酸残基正好位于全 长191个氨基酸的生长激素的C-终端附近。因此生长激素C端附近的氨基酸在与 受体结合的过程中举足轻重。
换言之，生长激素C端的氨基酸与其功能密切相关，故目前对GH进行基因 工程改造时通常避开C端，也不采用人GH的C末端与其他蛋白进行融合的方式。
儿童和成人在生长激素缺乏情况下，补充重组人生长激素(rhGH)是理想的 治疗方式。但其缺点是重组人生长激素在人体内药效甚短，其静脉注射的血清 清除半衰期约20分钟。若以皮下注射重组人生长激素，其高峰血药浓度通常要 几个小时后才能达到，而其消除半衰期则为3至8小时。因此，重组人生长激素 的治疗需要每周注射3次，或每天一次，以保持适当的血清生长激素水平。对于 那些需要长期接受生长激素治疗的病人，往往由于不能按时注射，造成治疗效 果降低。长效、高活性的重组人生长激素因而成为此药剂改善的目标。
在1999年到2004年间，基因技术(Genentech)公司和阿尔凯默斯(Alkermes) 股份有限公司开发出Nutropin Depot在市场销售，该产品是一种持续释放形式的 生长激素，具长效特性，接受治疗的病人其注射次数可减至每2或4周一次，而 不需每天注射。不过由于生产成本过高，该产品在2004年被撤出市场。
在此期间，数种治疗性蛋白药物藉着与某些聚合物如聚乙二醇(PEG)进行结 构上的修改来延长半其衰期和改善体内效价而创建了这些蛋白质药物的第二代 产品。蛋白药物与聚乙二醇共价性的结合通常可增加蛋白质的有效期限，并降 低其在人体内的清除率。重组人生长激素亦不例外。一些有关聚乙二醇生长激 素的文献显示，数种不同形式的聚乙二醇生长激素确实具有比重组人生长激素 较长的半衰期，但往往在蛋白质的聚乙二醇化过程中造成了生物活性的损失。
IgG类的免疫球蛋白是人类血液中最丰富的蛋白质。它们的半衰期可高达21 天。已有报导将IgG的Fc区域与其它蛋白质(如各种细胞因子和可溶性受体)结合 而形成融合蛋白(参见，例如Capon等人，Nature，337：525-531，1989；Chamow 等人，Trends Biotechnol.，14：52-60，1996；美国专利No.5,116,964和5, 541,087)。典型的融合蛋白是一重二聚体蛋白质，系通过IgG Fc绞链区中的半 胱氨酸残基与蛋白连接，而形成类似IgG、但缺少CH1区域和轻链的分子。由于 结构上的同源，Fc融合蛋白表现出的体外药物动力学特性与同种型的人IgG相当 类似。因此制造含有与人IgG蛋白质的Fc区域相连的hGH融合蛋白，将有助于延 长hGH的循环半衰期和/或增加它的生物活性。
此外，由于生长激素分子C端氨基酸在生物活性的高度重要性，因此在构 建hGH-Fc融合蛋白(hGH-Fc)时必需要预先考虑到如何克服连接Fc半体时所带 来的后果。若直接将庞大的IgG Fc半体联结在C端，会为C端造成空间位阻效应， 而大大地影响了生长激素结合位点对受体的可亲度。首先，融合蛋白与第一个 生长激素受体的结合将因Fc半体带来的位阻现象受损，其接下去与细胞表面上 的第二受体的后续结合可能因为此位阻效应而更进一步减弱。因此，根据上述 生长激素C-终端氨基酸的重要性(K172，T175，F176，R178)，hGH-Fc融合蛋白 对受体的亲和力将受到破坏，导致其生物活性降低甚至丧失。因此目前的技术 都是避免将Fc半体直接联结在C-终端，以免其活性遭受破坏。大多数重组蛋白 都将Fc半体联结到生长激素分子的N-终端。但此替换方式亦有其缺陷，由于生 长激素分子与其受体的结合位点分布于两终端，不论是将Fc接到N端或C端，融 合蛋白的生物活性都可能会因Fc所带来的位阻效应而遭破坏。
由于hGH-L-vFc融合蛋白的构建有其本质上的困难，迄今为止尚没有既具 有半衰期显著延长的令人满意的GH衍生物。因此，本领域迫切需要开发长效、 高活性、可以以合理的成本生产的hGH衍生物。
发明内容
本发明的目的就是提供一种具有高度生物活性的hGH-L-vFc融合蛋白及其 制备方法和用途。
在本发明的第一方面，提供了一种重组hGH-L-vFc融合蛋白，所述的融合蛋白 从N端到C端依次含有人GH、肽接头和人IgG Fc变体，
并且所述的人IgG Fc变体选自下组：
(i)含有Pro331Ser突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域；
(ii)含有Ser228Pro和Leu235Ala突变的人IgG4绞链区、CH2和CH3区域；
(iii)含有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变的人IgGl绞链区、CH2和 CH3区域。
在另一优选例中，所述的肽接头含有2-20个氨基酸，所述肽接头存在于人GH 和人IgG Fc变体之间；且所述的肽接头含有两个或更多选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨 酸和苏氨酸的氨基酸。
在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：18、20或22所示。
在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列是去除了-26到-1位氨基酸残基 的hGH前导肽之后的SEQ ID NO：18、20或22所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的hGH-L-vFc融合蛋白在摩尔基础上，具有与rhGH类似 或更高的体外生物活性、更长的半衰期。
在本发明的第二方面，提供了一种编码本发明第一方面所述重组hGH-L-vFc融 合蛋白的DNA分子。
在本发明的第三方面，提供了一种CHO衍生细胞株，所述细胞在其生长培养 基中在每24小时内，产生超过10μg/百万个细胞的如本发明第一方面所述的重组 hGH-L-vFc融合蛋白。
在另一优选例中，所述的CHO衍生细胞株在生长培养基中，每24小时内，产 生超过30μg/百万个细胞的本发明第一方面所述的重组hGH-L-vFc融合蛋白。
在另一优选例中，所述的CHO衍生的细胞株含有编码hGH-L-vFc融合蛋白的 DNA序列，并且所述的DNA序列具有SEQ ID NO：17、19或21所示的核苷酸序列。
在本发明的第四方面，提供了一种制备本发明第一方面所述重组融合蛋白的方 法，包括步骤：
(a)在融合蛋白在其生长培养基中每24小时期间内，表达超过10μg/106(百 万)个细胞的条件下，培养本发明的第三方面所述的细胞株；和
(b)纯化步骤(a)表达的蛋白质，其中重组融合蛋白在摩尔基础上，具有与 rhGH类似的或更高的体外生物活性，更长的半衰期。
在另一优选例中，所述的重组融合蛋白在人GH和人IgG Fc变体之间有2-20个 氨基酸的柔性肽；且所述柔性肽接头含有两个或更多选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨 酸和苏氨酸的氨基酸。
在另一优选例中，所述的融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：18、20或22所 不。
在另一优选例中，所述的融合蛋白的氨基酸序列是去除了-26到-1位氨基酸残 基的hGH前导肽之后的SEQ ID NO：18、20或22所示的氨基酸序列。
在本发明的第五方面，提供了一种提高含有人GH、柔性肽接头和人IgG Fc 变体的重组融合蛋白的表达量的方法，所述的方法包括：
(a)将编码融合蛋白的DNA引入CHO细胞，生成CHO衍生的细胞系；
(b)培养这种CHO衍生的细胞系，从而表达融合蛋白；和
(c)纯化步骤(b)表达的融合蛋白，
其中重组融合蛋白是hGH-L-vFc融合蛋白，其特征为表现出极高的体外生物 活性，即在摩尔基础上，具有与人GH类似或更高的体外生物活性和更长的半衰 期；其中在人GH和IgG Fc变体间存在含有约2-20个氨基酸的柔性肽接头；和柔 性肽接头含有2个或多个氨基酸选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的氨基酸； 和其中人IgG Fc变体含有选自以下的人IgG的绞链区、CH2和CH3区域： Pro331Ser突变的人IgG2；Ser228Pro和Leu235Ala突变的人IgG4；和Leu234Val、 Leu235Ala和Pro331Ser突变的人IgG1。
在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：18、20或22所 示。
在另一优选例中，所述编码融合蛋白的DNA具有SEQ ID NO：17、19或21 所示的核苷酸序列。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方 案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了人IgG1、IgG2、IgG4和它们变体的绞链区和CH2区域的氨基酸序 列的比对。比较三个部分：氨基酸区域228、234-237和330-331。这些变体的氨 基酸突变以粗斜体显示。氨基酸残基编号是根据EU编号体系标定。
图2显示了在pGFP表达载体内HindIII-EcoRI片段的hGH-L-vFcγ2的核苷酸序 列及推导的氨基酸序列。氨基酸残基-26到-1是hGH的前导肽。成熟蛋白含有 hGH(氨基酸残基1到191)、肽接头(氨基酸残基192到207)和Fc变体(氨基酸残基 208到430)。在Fc区域中，粗体的核苷酸和相应的氨基酸变体用下划线标出。
图3显示了在pGFP表达载体内HindIII-EcoRI片段的hGH-L-vFcγ4的核苷酸序 列及推导的氨基酸序列。氨基酸残基-26到-1是hGH的前导肽。成熟蛋白含有 hGH(氨基酸残基1到191)、肽接头(氨基酸残基192到207)和Fc变体(氨基酸残基 208到436)。在Fc区域中，粗体的核苷酸和相应的氨基酸变体用下划线标出。
图4显示了在pGFP表达载体内HindIII-EcoRI片段的hGH-L-vFcγ1的核苷酸序 列及推导的氨基酸序列。氨基酸残基-26到-1是hGH的前导肽。成熟蛋白含有 hGH(氨基酸残基1到191)、肽接头(氨基酸残基192到207)和Fc变体(氨基酸残基 208到434)。在Fc区域中，粗体的核苷酸和相应的氨基酸变体用下划线标出。
图5显示旋转培养瓶内细胞株的生长及其分泌hGH-LvFcγ2融合蛋白的浓度 趋势曲线图。
图6显示了hGH-L-vFcγ2纯化蛋白刺激Nb2细胞增殖的能力。
具体实施方式
本发明人经过长期而深入的研究，首次设计了一种独到的绞链区肽接头来 降低空间位阻效应，可以制得hGH的C端与Fc连接的融合蛋白，中间有柔软的肽 接头。令人意外的是，此融合蛋白不仅不会导致GH的功能丧失，反而能够维持、 甚至提高生长激素-Fc融合蛋白的生物活性。在此基础上完成了本发明。
具体地，本发明hGH-L-vFc融合蛋白从N端到C端依次含有人GH、肽接头和 人IgG Fc变体。较佳地，其中人Ig Fc变体含有选自以下的变体绞链区、CH2和CH3 区域：(A)含有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变的人IgG1；(B)含有Pro331Ser 突变的人IgG2；和(C)含有Ser228Pro和Leu235Ala突变的人IgG4。较佳地，使用约 2-20个氨基酸长度的、含有以下2种或多种氨基酸构成的柔性肽接头：甘氨酸、 丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸。IgG Fc变体是非裂解性的，且与天然IgG Fc相比含有 氨基酸突变。此类hGH-L-vFc融合蛋白在摩尔基础上，具有与rhGH类似或更高的 体外生物活性。且hGH-L-vFcγ2的体内血清清除半衰期比rhGH有显著增长。
本发明的另一实施例为人Ig Fc变体含有绞链区、CH2和CH3区域。其CH2 区域在228、234、235和331位(由EU编号体系确定的位置)含有氨基酸突变，从 而降低Fc的效应子功能。
在本发明的另一实施例中，公开了一种从哺乳动物细胞系如CHO衍生的细 胞系制备或生产这种重组融合蛋白的方法。培养转染的细胞系，使得重组融合 蛋白在其生长培养基中在24小时期间以超过10(较佳地为30)μg/106(百万)个细胞 的水平下表达。这些hGH-L-vFc融合蛋白显示出高度的体外生物活性和更长的体 内血清半衰期而无不良副作用，从而改善了药物动力学和药效，进而降低了实 现类似药效所需的剂量和注射次数。
此外，本发明人还发现，在hGH和人IgG Fc变体间添加的肽接头以两种方 式提高hGH-L-Fc的体外生物活性：(1)使Fc区域远离hGH上的hGHR结合位点， 和(2)使一个hGH远离另一个hGH结构域，从而使两个hGH区域能分别与靶细胞 上的hGHR反应。且人的IgG Fc变体在CH2区域在228、234、235、331位点含有 氨基酸突变，从而降低Fc的效应子功能。
Fc元件
Fc元件来自免疫球蛋白的Fc区域，Fc在消灭病原体的免疫防御中具重要作 用。IgG的效应子功能由Fc介导而通过两种主要机制：(1)与细胞表面Fc受体 (FcγRs)的结合，导致通过抗体-依赖性细胞毒性(ADCC)途径，由杀伤细胞通过 吞噬作用或裂解作用而嚥吞病原体；(2)与第一补体成分Cl的Clq部分的结合， 引发依赖于补体的细胞毒性(CDC)途径，从而溶解病原体。在四种人IgG同种型 中，IgG1和IgG3能有效地结合FcγR。IgG4与FcγR的结合亲和力比IgG1或IgG3 的低一个数量级，而IgG2与FcγR的结合低得难以测定。人IgG1和IgG3还能有效 地结合Clq，并激活补体串联反应。人IgG2对补体的固定作用很弱，而IgG4似 乎在激活补体串联反应的能力方面相当缺乏。对应用于人的治疗而言，当 hGH-Fc融合蛋白结合于靶点细胞表面上的hGHR时，融合蛋白的Fc区域必须不 能有不良效应子功能，因而不会溶解或除去这些靶点细胞。因此，hGH-Fc的Fc 区域必须是非溶解性的，对结合于FcγRs和Clq从而触发效应子功能方面，Fc区 域必须是无活性的。显然，没有一种天然的IgG同种型适合产生hGH-Fc融合蛋 白。为了得到非溶解性的Fc，必须使天然Fc区域中的一些氨基酸突变，以降低 其效应子功能。
透过人和鼠的IgG同种型的氨基酸序列的比较显示，Fc片段在CH2区域N末 端附近的序列在IgG Fc与FcγRs的结合中具重要作用。其在234位到237位基序的 重要性已在基因工程建构的抗体中证明(参见，例如Duncan等人，Nature，332： 563-564，1988)。本发明所提氨基酸残基编号是根据Kabat等人所述的EU编号体 系标定(《SEQUENCES of PROTEINS of IMMUNOLOGICAL INTEREST》，第5 版，United States Department of Health and Human Services，1991)。在四种人 IgG同种型中，IgG1和IgG3与FcγRs的结合力最高，且两者具有相同的 Leu234-Leu-Gly-Gly237序列(图1)。IgG4与FcγRs结合的亲和力甚低，观其序列 显示有个氨基酸受到替换，即在234位点上Leu换成Phe。在不与FcγRs结合的IgG2 中，则发生两个位点替换和一个位点被删除，从而形成Val234-Ala-Gly237序列 (图1)。为了减少Fc与FcγR的结合和ADCC活性，IgG4中的Leu235可用Ala取代(参 见，例如Hutchins等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：11980-11984，1995)。IgG1 抗体内的Glu233-Leu-Leu235序列曾被用IgG2中的Pro233-Val-Ala235相关序列 来替换。这种改变使IgG1变体在小鼠中失去了透过FcγR-介导除去靶点细胞的能 力。
有关抗体对FcγR与Clq结合至关重要的第二部位座落于人IgG的CH2区域 靠近羧基端的附近(参见，例如Duncan等人，Nature，332：738-740，1988)。在 四种人IgG同种型中，这部分中仅有一个位点显示取代：IgG4中的Ser330和 Ser331替换了IgG1、IgG2和IgG3中的Ala330和Pro331(图1)。Ser330的存在不影 响FcγR与Clq的结合。用Ser替代Pro331则使IgG1失去了与Clq的结合亲和力， 而用Pro替代Ser331部分保留了IgG4的补体固定活性(参见，例如Tao等人，J.Exp. Med.，178：661-667，1993；Xu等人，J.Biol.Chem.，269：3469-3474，1994)。
融合蛋白及其生产方法
本发明提供了一类新型有效的hGH-L-Fc融合蛋白，融合蛋白中的Fc元件为 变体(vFc)，以用于构建高效的hGH-L-vFc融合蛋白。人IgG2不结合FcγR，但显 示出微弱的补体活性。具有Pro331Ser突变的Fcγ2变体应比天然Fcγ2的变体活性更 低，而且仍旧不结合于FcγR。IgG4Fc在激活变体串联反应有缺陷，且它与FcγR 的结合亲和力比活性最高的同种型(IgG1)低约一个数量级(十倍)。与天然Fcγ4相 比，具有Leu235Ala突变的Fcγ4变体应表现出微的效应子功能。具有Leu234Val、 Leu235Ala和Pro331Ser突变的Fcγ1也表现出比天然Fcγ1低得多的效应子功能。这 些Fc变体都比天然存在的人IgG Fc更适于制备hGH融合蛋白。在非溶解Fc的制 备中也可引入其它替换，而不危及循环半衰期或导致不良的构象变化。
本发明融合蛋白通常由生物合成的方法制备。根据本发明所述的核苷酸序 列，本技术领域人员可方便地用各种已知方法制得本发明的编码核酸。这些方 法例如但不限于：PCR，DNA人工合成等，具体的方法可参见J.萨姆布鲁克， 《分子克隆实验指南》。作为本发明的一种实施方式，可通过分段合成核苷酸 序列再进行重叠延伸PCR的方法来构建本发明的编码核酸序列。
本发明还提供了一种表达载体，包含编码本发明的融合蛋白的序列以及与 之操作性相连的表达调控序列。所述的“操作性相连”或“可操作地连于”指这样 一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它 部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编 码序列。
表达载体可采用市售的例如但不限于：pcDNA3、pIRES、pDR，pUC18等 可用于真核细胞系统表达的载体。本领域技术人员可以根据宿主细胞来选择合 适的表达载体。
根据已知空载表达载体的酶切图谱，本领域技术人员可按照常规方法通过 限制性酶剪切与拼接，将本发明的融合蛋白的编码序列插入合适的限制性位点， 制得本发明的重组表达载体。
本发明还提供了表达本发明融合蛋白的宿主细胞，其中含有本发明的融合 蛋白的编码序列。所述的宿主细胞优选的是真核细胞，例如但不限于CHO，COS 细胞，293细胞，RSF细胞等。作为本发明的优选方式，所述的细胞是CHO细胞， 其可良好地表达本发明的融合蛋白，可获得结合活性良好，稳定性良好的融合 蛋白。
本发明还提供一种用重组DNA制备本发明融合蛋白的方法，其步骤包括：
1)提供编码融合蛋白的核酸序列(如SEQ ID NO：17序列)；
2)将1)的核酸序列插入到合适的表达载体，获得重组表达载体；
3)将2)的重组表达载体导入合适的宿主细胞；
4)在适合表达的条件下培养转化宿主细胞；
5)收集上清液，并纯化融合蛋白产物。
将所述编码序列导入宿主细胞可采用本领域的多种已知技术，例如但不限 于：磷酸钙沉淀，原生质体融合，脂质体转染，电穿孔，微注射，反转录法， 噬菌体转导法，碱金属离子法。
有关宿主细胞的培养和表达可参见Olander RM Dev Biol Stand 1996；86： 338。可通过离心去除悬浮液中的细胞和残渣，收集清液。可通过琼脂糖凝胶电 泳技术进行鉴定。
可将上述制备获得的融合蛋白纯化为基本均一的性质，例如在SDS-PAGE 电泳上呈单一条带。例如，当重组蛋白为分泌表达时，可以采用商品化的超滤 膜来分离所述蛋白，例如Millipore、Pellicon等公司产品，首先将表达上清浓缩。 浓缩液可采用凝胶层析的方法进一步加以纯化，或采用离子交换层析的方法纯 化。例如阴离子交换层析(DEAE等)或阳离子交换层析。凝胶基质可为琼脂糖、 葡聚糖、聚酰胺等常用于蛋白纯化的基质。Q-或SP-基团是较为理想的离子交换 基团。最后，还可用羟基磷灰石吸附层析，金属螯合层析，疏水相互作用层析 和反相高效液相色谱(RP-HPLC)等方法对上述纯化产物进一步精制纯化。上述 所有纯化步骤可利用不同的组合，最终使蛋白纯度达到基本均一。
可利用含有所述融合蛋白的特异性抗体、受体或配体的亲和层析柱对表达 的融合蛋白进行纯化。根据所使用的亲和柱的特性，可利用常规的方法，如高 盐缓冲液、改变pH等方法洗脱结合在亲和柱上的融合性多肽。可选择地，所述 的融合蛋白的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。 任何合适的标签都可以用于本发明。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HAl， c-Myc，6-His或8-His等。这些标签可用于对融合蛋白进行纯化。
药物组合物
本发明还提供了一种药物组合物，它含有有效量(如0.000001-90wt％；较 佳的0.1-50wt％；更佳的，5-40wt％)的本发明的融合蛋白，以及药学上可接受的 载体。通常，可将有效量的本发明融合蛋白配制于无毒的、惰性的和药学上可 接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。术语“有效 量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所 接受的量。“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副 反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药 学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
药学上可接受的载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、 乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可 以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常 规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量 是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。
本发明所述的融合蛋白的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程 度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来 确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的融合蛋白的药代动 力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、 患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的融合蛋白每 天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量 给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若 干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
本发明融合蛋白的优点如下：
1.延长GH的循环半衰期和/或增加生物活性。
2.血清中药物浓度波动的减少，安全性提高，耐受性的改善。
3.含有非溶解Fc变体的hGH-L-vFc融合蛋白能显著地有助于治疗因内源性 生长激素分泌不足的成长缺失，以及特纳综合症引起的体型矮小，慢性肾功能衰竭， Prader-Willi综合症，特发性体型矮小等病症。
4.降低注射频率，使患者有更好的生活品质。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York： Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所 建议的条件。
实施例1构建编码hGH-L-vFcγ2融合蛋白编码的基因
1.制备含人-生长激素的基因序列质粒
hGH-L-vFcγ2融合蛋白编码序列是由数个DNA片段组合而成的。含有人GH 的前导肽和成熟蛋白编码的基因的制备，系根据NCBI参考序号NM_000515.3所 载人-生长激素的基因序列用人工合成方法制备。合成方法是先沿着hGH基因的 双链DNA序列从5’终端向3’终端行进，制备四个上下链交替、长度约为180个碱 基的寡核苷酸片段。每个片段的终端分别与下一个互补链片段的终端含有约20 个碱基的互补重叠序列。其后再将此四个寡核苷酸片段，用聚合酶链式反应技 术(PCR)组合成长度约为650碱基的核苷酸片段。为了便于克隆，所合成基因的 两端将含有限制性酶内切位点。表1列出了用于克隆hGH-L-vFc融合蛋白的寡核 苷酸序列。
表1
SEQ ID NO 引物序列 1 5’-cccaagcttggcgcggagatggctacaggctcccgga-3’ 2 5’-cggatccgaagccacagctgccctcca-3’ 3 5’-gtcgagtgcccaccgtgccca-3’ 4 5’-ggaattctcatttacccggagacaggga-3’ 5 5’-tggttttctcgatggaggctgggaggcct-3’ 6 5’-aggcctcccagcctccatcgagaaaacca-3’ 7 5’-cggatccggtggcggttccggtggaggcggaagcggcggtggaggatcagtcgagtgcccaccgtgccca-3’
8 5’-gagtccaaatatggtccccca-3’ 9 5’-ggaattctcatttacccagagacaggga-3’ 10 5’-cctgagttcgcggggggacca-3’ 11 5’-gagtccaaatatggtcccccatgcccaccatgcccagcacctgagttcgcggggggacca-3’ 12 5’-cggatccggtggcggttccggtggaggcggaagcggcggtggaggatcagagtccaaatatggtccccca-3’ 13 5’-gacaaaactcacacatgccca-3’ 14 5’-acctgaagtcgcggggggaccgt-3’ 15 5’-gacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagtcgcggggggaccgt-3’ 16 5’-cggatccggtggcggttccggtggaggcggaagcggcggtggaggatcagacaaaactcacacatgccca-3’
在PCR组合反应时用作5’寡核苷酸引物的序列引入了HindIII的酶切位点 (SEQ ID NO：1)；3’引物则引入了BamHI位点(SEQ ID NO：2)。将得到的长度 约为650bp的hGH DNA片段以HindIII和BamHI内切酶切除末端，以琼脂糖凝胶 电泳纯化后，插入到接受载体的HindIII和BamHI位点，即克隆得到含人-生长激 素的基因序列的质粒，命名为phGH。其所含hGH基因的序列可由DNA测序验证。
2制备含L-vFcγ2序列的质粒
人IgG2重链的绞链区域含有包括4个半胱氨酸的12个氨基酸残基 (GluArgLysCysCysValGluCysProProCysPro)。在这4个半胱氨酸残基中，第3和第 4个参与两个重链间二硫键的形成；而消除第1个和第2个半胱氨酸残基可防止非 特异性的二硫键粘接。在本发明中Fcγ2的绞链区域可以将其切短为7个氨基酸残 基(ValGluCysProProCysPro)。IgG2的Fc区域可用从人白细胞制备的RNA和合适 的5’(SEQ ID NO：3)和3’(SEQ ID NO：4)引物，通过逆转录和PCR制得含人Fcγ2编码序列的基因。紧接着用此含有IgG2的绞链、CH2和CH3区域完整序列的 Fcγ2DNA片段作为模板，将Fcγ2中331位点的Ser替换成Pro，产生Fcγ2Pro331Ser(vFcγ2)变体。此替换突变的引入，是先用天然Fcγ2作为模板、含突变序 列的寡核苷酸(表1)作引物产生两个具部分重叠的DNA片段，然后用重叠PCR 中将它们组装起来：SEQ ID NO：3作为5’引物并用SEQ ID NO：5作为3’引物生 成5’片段；用SEQ ID NO：6作为5’引物并用SEQ ID NO：4作为3’引物生成3’片 段；最后用SEQ ID NO：7作为5’引物和SEQ ID NO：4作为3’引物，将这两个片 段在覆盖Pro331Ser突变的区域连接起来。SEQ ID NO：7引物含有16个氨基酸肽 接头的编码序列并包括BamHI限制性内切酶位点，而SEQ ID NO：4则含有EcoRI 限制性内切酶位点。将此制得长度约为700bp的DNA片段以BamHI和EcoRI内切 酶切除末端，以琼脂糖凝胶电泳纯化后，插入接受载体(如pUC19)的BamHI和 EcoRI位点，即可克隆得到含L-vFcγ2序列的质粒，pL-vFcγ2。其所含L-vFcγ2基因 的序列可用DNA测序验证。
3制备hGH-L-vFcγ2融合基因
hGH-L-vFcγ2融合基因的制备方法如下：用HindIII和BamHI从phGH质粒上 切下hGH片段，然后用琼脂糖凝胶电泳纯化。另一方面将pL-vFc2质粒用HindIII 和BamHI切开并用琼脂糖凝胶电泳纯化。其后将纯化的hGH片段插入pL-vFcγ2质粒肽接头的5’末端，得到phGH-L-vFcγ2质粒。该融合基因含有完整的hGH、 Gly-Ser肽接头和Fcγ2变体基因。
在hGH和Fc部分间存在的肽接头，增加了hGH区域的柔性，因而提高了其 生物活性(参见，例如美国专利No.6,797,493和6,900,292)。对本发明而言， 优选的肽接头是长度含有约20个或较少的氨基酸；而使用的氨基酸可含有2种或 更多选自以下的氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸。常见的肽接头范 例之一是含有Gly-Ser肽构建板块的肽接头，如GlyGlyGlyGlySer。
4.构建hGH-L-vFc融合蛋白表达载体
为表达hGH-L-vFc融合蛋白，需将hGH-L-vFc融合蛋白的完整基因编码插入 哺乳动物表达载体如pcDNA3(Invitrogen，Carlsbad，CA)。方法是将phGH-L-vFcγ2质粒从HindIII和EcoRI位点切下hGH-L-vFc片段，然后用琼脂糖凝胶电泳纯化。 另一方面将表达载体用HindIII和EcoRI切开并用琼脂糖凝胶电泳纯化。其后将纯 化的hGH-L-vFc片段插入切后的表达载体，得到最终的表达载体质粒(称为 pGFP2)。此pGFP2含有在哺乳动物细胞中高水平表达所需的巨细胞病毒早期基 因启动子及增强子。该质粒还含有可选择性标记基因，从而可赋予被转染的细 菌中氨苄青霉素抗性，而在被转染的哺乳动物细胞中赋予G418抗性。另外，当 宿主细胞，如仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)，的二氢叶酸还原酶 (Dihydrofolate reductase，DHFR)基因表达有缺陷时，pGFP2表达载体含有DHFR 基因，从而能在氨甲蝶呤(Methotrexate，MTX)存在下共同扩增被转染细胞内的 hGH-L-vF2融合基因和DHFR基因(参见，例如美国专利No.4,399,216)，从而 提高hGH-L-vFγ2融合蛋白的表达水平。
图2显示了pGFP表达载体内hGH-L-vFcγ2融合基因(SEQ ID NO：17)和推导 的氨基酸序列(SEQ ID NO：18)，它含有前导肽(-26到-1位氨基酸)、hGH的序列 (氨基酸残基1到191)、16个氨基酸的肽接头 (GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGLyGlyGlyGlySer)(氨基酸残基192到207) 和Fcγ2Pro331Ser变体的序列(下划线标出)。
实施例2构建编码hGH-L-vFcγ4融合蛋白编码的基因
由于绞链区域中重链间二硫键的解离，一部分的人IgG4会解离而形成被认 为是半抗体的分子。这种情况在其它三种人IgG同种型分子中通常不会发生。文 献显示，在IgG1和IgG2中的228位点为Pro，而在IgG4该位点为Ser228。将IgG4 的Ser228残基用Pro作单氨基酸取代，可使IgG4保持完整的抗体分子(参见Angal 等，Molec.Immunol.，30：105-108，1993；Owens等，Immunotechnology，3： 107-116，1997；美国专利No.6,204,007)。另外，将Fcγ4进行Leu235Ala突变， 可使此Fcγ4变体降低与FcγR的结合力。此种突变，加上前述Ser228Pro突变，将 会使得融合蛋白在纯化时更能获得均匀、完整的制备物。
构建含hGH-L-vFcγ4融合蛋白编码基因的方法如下：
用从人白细胞制备的RNA和合适的5’引物(SEQ ID NO：8)和3’引物(SEQ ID NO：9)，通过逆转录和PCR得到含人IgG4的Fc区域(Fcγ4)编码的基因片段。接 下来将得到的含有IgG4的绞链、CH和CH3区域完整序列的Fcγ4的DNA片段作为 模板，进行Ser228Pro和Leu235Ala突变程序以产生Fcγ4变体(vFcγ4)，在这过程中 Ser228和Leu235将分别被Pro和Ala替代。在此突变过程，首先用3’引物(SEQ ID NO：9)和含有Leu235Ala突变的5’引物(SEQ ID NO：10)以PCR扩增CH2和CH3 区域。其次用SEQ ID NO：12作为5’引物和SEQ ID NO：9作为3’引物，在PCR 中将这种扩增的片段与合成的长度为60个碱基且含Ser228Pro和Leu235Ala突变 的寡核苷酸(SEQ ID NO：11)连接起来。SEQ ID NO：12引物含有16氨基酸Gly-Ser 肽接头(包括BamHI位点)的编码序列。PCR连接后得到的DNA片段长度约为 700bp，并含BamHI和EcoRI内切酶位点。将此DNA片段以BamHI和EcoRI内切酶 切除并用琼脂糖凝胶电泳纯化后，插入同样以BamHI和EcoRI内切酶切开的接受 载体，可克隆到含L-vFcγ4的质粒，pL-vFcγ4。该质粒中L-vFcγ4基因的序列可用 DNA测序验证。
其次，在制备hGH-L-vFcγ4融合基因时，用HindIII和BamHI从phGH质粒上 切下hGH片段，然后用琼脂糖凝胶电泳纯化。另一方面将pL-vFcγ4质粒用HindIII 和BamHI切开并用琼脂糖凝胶电泳纯化。其后将纯化的hGH片段插入pL-vFcγ4质粒肽接头的5’末端，得到phGH-L-vFcγ4质粒。该融合基因含有完整的hGH、16 个氨基酸的Gly-Ser肽接头和Fcγ4变体基因。最后将phGH-L-vFcγ4质粒从HindIII 和EcoRI位点切下hGH-L-vFc片段，然后用琼脂糖凝胶电泳纯化。另一方面将表 达载体用HindIII和EcoRI切开并用琼脂糖凝胶电泳纯化。其后将纯化的 hGH-L-vFc片段插入切后的表达载体，得到最终的表达载体质粒，命名为pGFP4。
图3显示了pGFP表达载体内hGH-L-vFcγ4融合基因(SEQ ID NO：19)和推导 的融合蛋白序列(SEQ ID NO：20)，它含有前导肽(氨基酸残基-26到-1)、hGH序 列(氨基酸残基1到191)、16个氨基酸的肽接头 (GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer)(氨基酸残基192到207) 和具有Ser228Pro和Leu235Ala突变的Fcγ4变体的融合基因(下划线标出)。
实施例3构建编码hGH-L-vFcγ1融合蛋白编码的基因
人IgG1重链的绞链区域含有包括3个半胱氨酸的15个氨基酸残基 (GluProLysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCysPro)。在这3个半胱氨酸残基中， 第2和第3个参与两个重链间二硫键的形成。第1个半胱氨酸残基参与与IgG轻链 的二硫键结合。由于Fc融合蛋白分子中没有轻链，该半胱氨酸残基可能与其它 半胱氨酸残基配对，而导致非特异性二硫键结合。要防止这种非特异性二硫键 结合，可以将Fcγ1的绞链区域切短，以消除第1个半胱氨酸残基 (AspLysThrHisThrCysProProCysPro)。用从人白细胞制备的RNA和合适的5’引物 (SEQ ID NO：13)和3’引物(SEQ ID NO：4)，通过逆转录和PCR得到含Fcγ1区域 编码的基因。将得到的含有Fcγ1截短的绞链区域和CH2及CH3完整序列的DNA片 段用作模板，来进行Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser三重位点突变以产生Fcγ1变体(vFcγ1)。
引导这些突变的方法如下：先制备两个含有上述位点突变的DNA片段，然 后用天然Fcγ1作为模板在重叠PCR中将它们组装起来。第一个片段，5’片段，系 用SEQ ID NO：14作为5’引物并用SEQ ID NO：5作为3’引物制成。此5’引物含 有Leu234Val、Leu235Ala突变，3’引物含有Pro331Ser突变。第二个片段，3’片 段，可用SEQ ID NO：6作为5’引物并用SEQ ID NO：4作为3’引物制成。其次， 用SEQ ID NO：14作为5’引物和SEQ ID NO：4作为3’引物，将5’和3’片段在覆盖 Pro331Ser突变的区域连接起来。最后，用SEQ ID NO：16作为5’引物、SEQ ID NO：4作为3’引物，通过PCR将此扩增的长度约650bp的片段和合成的55碱基的 寡核苷酸(SEQ ID NO：15)(含有Leu234Val和Leu235Ala)连接起来。SEQ ID NO： 16引物含有16个氨基酸Gly-Ser肽接头(包括BamHI位点)的编码序列。将得到的 长度约为700bp的DNA片段经BamHI和EcoRI切开并用琼脂糖凝胶电泳纯化后， 插入接受载体的BamHI和EcoRI位点，可克隆到pL-vFcγ1质粒。该基因的序列可 用DNA测序验证。
要制备hGH-L-vFcγ1融合基因，可先用HindIII和BamHI从phGH质粒上切下 hGH片段、纯化后，再插入pL-vFcγ1质粒肽接头的5’末端(同样用HindIII和BamHI 切开并纯化)，得到phGH-L-vFcγ1质粒。此融合基因含有hGH，16个氨基酸Gly-Ser 肽接头和Fcγ1变体基因。此hGH-L-vFcγ1融合基因片段经HindIII和EcoRI切开并用 琼脂糖凝胶电泳纯化后，可插入哺乳动物表达载体的HindIII和EcoRI位点。所得 到的最终表达的载体质粒命名为pGFP1。
图4显示了pGFP表达载体内hGH-L-vFcγ1融合基因序列(SEQ ID NO：21)和 推导的融合蛋白序列(SEQ ID NO：22)，它含有前导肽(氨基酸残基-26到-1)、hGH 序列(氨基酸残基1到191)、16个氨基酸肽接头 (GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer)(氨基酸残基192到207) 和具有Ser234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变的Fcγ1变体的融合基因(下划线标 出)。
实施例4融合蛋白于转染细胞株中的表达
为实现融合蛋白的表达，可将重组pGFP1、pGFP2或pGFP4表达载体质粒转 染入哺乳动物宿主细胞株，以表达hGH-L-vFc融合蛋白。为了获得稳定、高水平 的表达，优选的宿主细胞株是具DHFR酶缺陷的CHO细胞(参见，例如美国专利 No.4,818,679)。优选的转染方法是电穿孔。其它方法，包括磷酸钙共沉淀、 脂转染和原生质融合也可以使用。转染时先在比色皿内放置2-5×107个细胞，随 后加入10μg用BspCI线性化的质粒DNA，均匀混合，然后放置于电穿孔仪器中 (Gene Pulser Electroporator，Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)，将电压设置 在250V电容设置在960μFd行使电穿孔。在转染2天后，将培养基改成含0.8mg/ml G418的生长培养基。转染约2周后，对G418药物具有抗性的转染子可长成肉眼 可见的细胞群落(克隆)。此时可用抗人IgG Fc酶联免疫吸附测定法(ELISA)筛选 分泌融合蛋白的转染子。此外，通过ELISA也可用抗hGH试验进行对表达的融 合蛋白作定量分析。在选定融合蛋白较高表达的转染子后，通过在96孔板上极 限稀释，亚克隆这些产生高水平Fc融合蛋白的细胞群落。
为了使选定并经过亚克隆的转染子细胞克隆达到融合蛋白较高水平的表 达，适宜的方法是用与DHFR基因共扩增的程序来增加融合蛋白的基因数量。通 常，基因数量增加，融合蛋白的表达量会随之增高。在含有递增浓度MTX的生 长培养基中，DHFR酶的活性受MTX药物抑制而不能正常合成核苷，细胞的正 常生长因而受到影响。细胞为克服此MTX药物的抑制必需扩增DHFR酶的基因 数以产生更多的酶让细胞维持正常生长。转染的融合蛋白基因与DHFR基因相 邻，因此在DHFR基因扩增的过程会与DHFR基因共同扩增。经过递增浓度MTX 的逐步筛选，选出能在高达1μg/ml MTX培养基中生长的转染子，再次通过极限 稀释法进行亚克隆。通过测定分泌率，对亚克隆的细胞株进行进一步的分析， 最后选出几个分泌率水平超过约10(较佳地约30)μg/106(百万)个细胞/24小时的 细胞株。将这些选出的细胞株使用无血清生长培养基培养，让其逐渐适应于悬 浮培养。这些细胞在生长过程中会分泌融合蛋白于培养基中，可用之纯化融合 蛋白。
其中之一细胞株，定号9-10-39，可以20μg/106(百万)个细胞/24小时的速率 分泌hGH-LvFcγ2。培养液内hGH-LvFcγ2融合蛋白的浓度用ELISA定量分析测定， 以纯化之hGH-LvFcγ2融合蛋白作标准溶液。将细胞株9-10-39在100毫升的旋转培 养瓶逐步适应成悬浮细胞培养。
图5显示在100毫升的旋转培养瓶内，此细胞株的生长曲线及其分泌 hGH-LvFcγ2融合蛋白的浓度。十二天后，培养液内之融合蛋白之浓度可累积至 约1克/升(g/L)。
实施例5融合蛋白的纯化和定性
用1N NaOH将含有hGH-L-vFc融合蛋白的条件培养基滴定到pH 7到8，然后 用0.45μm的硝酸纤维素过滤器过滤。将滤液加样到磷酸盐缓冲盐水(PBS)平衡的 Prosep A柱上。待融合蛋白结合于Prosep A后，弃去流穿组分。用PBS洗涤该柱， 直到280nm处的OD值低于0.01。然后用0.1M pH3.75的柠檬酸缓冲液洗脱结合的 融合蛋白。用0.4体积的1M K2HPO4中和，合并含有纯化蛋白的组分，并用PBS 透析。然后溶液用0.22μm的硝酸纤维素过滤器过滤，并存储在4℃。在非还原条 件下，由SDS-PAGE测得纯化的hGH-L-vFc蛋白质的分子量范围为90到100kDa。 在还原条件下，纯化的蛋白迁移至约50kDa。用BSA作为标准，通过BCA蛋白 质分析定量该融合蛋白。
实施例6体外生物活性分析
体外生物活性可以用转染子或纯化蛋白质刺激大鼠淋巴瘤细胞Nb2细胞的 增殖能力方法测定。虽然Nb2细胞的增殖是受到生长激素对细胞上的泌乳受体 刺激而起反应，但Nb2细胞增殖活性的测试可以用来评价生长激素的生物活性 (参见，例如内田等人，J.Mol.Endocrinol.，23：347-353，1999)。
测验开始约48小时之前，先将细胞转移到预检测培养基中(RPMI 1640培养 基，含有1％马血清和50μmol的β-巯基乙醇以减缓细胞增殖速度。保温培育后， 收集细胞并以每毫升4×105个细胞的浓度悬浮在培养基。将每份50μl细胞样品加 到96孔组织培育板的各孔中。用50μl含有0.01-100nM各种浓度hGH-L-vFc融合 蛋白或rhGH对照的分析培养基培养这些细胞。在37℃、5％CO2湿润培养箱中培 养该平板48小时，然后在各孔中添加20μl噻唑兰(用PBS配制成2.5mg/ml)。五 小时后，在每孔中加入100μl含有10％SDS的裂解液，封口膜密封后置37℃恒温 箱中过夜，以溶解细胞和所形成的甲瓒。然后在570nm对该平板进行光密度读 数，其中参考光束设为630nm。将OD读数相对于hGH-L-vFc融合蛋白的浓度作 图。由所得剂量反应曲线可测定hGH-L-vFc的生物活性。
图6显示了hGH-L-vFcγ2纯化蛋白刺激Nb2细胞增殖的能力。由此图读出S形 曲线的转折点，即可算出最大有效浓度的半数值(half maximal effective concentration，EC50)为1.2nM。按摩尔计，重组融合蛋白表现出的体外生物活 性与rhGH类似。
实施例7药物组合物制备
hGH-L-vFc融合蛋白50μg
生理盐水 1ml
调节pH至 6.7-7.2
得到含hGH-L-vFc融合蛋白的药物组合物。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。