CD11a、CD70基因甲基化水平定量检测方法.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101724691 B (45)授权公告日 2012.01.11 CN 101724691 B *CN101724691B* (21)申请号 200910044721.1 (22)申请日 2009.11.06 C12Q 1/68(2006.01) C40B 40/06(2006.01) (73)专利权人 中南大学 地址 410083 湖南省长沙市麓山南路 1 号 (72)发明人 陆前进 张秀娟 周东蕊 陆祖宏 (74)专利代理机构 中南大学专利中心 43200 代理人 胡奕 CN 101205559 A,2008.06.25, 全文 . 张秀娟 .CD11a（ITGA。

2、L） 、 CD70（TNFSF7） 基因 甲基化定量芯片的构建. 中国优秀硕士学位论文 全文数据库 医药卫生科技辑 .2011,E065-102. AH Sawalha 等 .Defective T-cell ERK signaling induces interferonregulated gene expression and overexpression of methylation-sensitive genes similar to lupus patients.Genes and Immunity .2008 Nature Publishing Group,2008,第9卷第368。

3、 378 页 . xiujuan zhang 等 .A Proof-of-Principle Demonstration of a Novel Microarray-Based Method for Quantifying DNA Methylation Levels.Mol Biotechnol .Springer Science+Business Media,2010,第46卷第243 249 页 . (54) 发明名称 CD11a、 CD70 基因甲基化水平定量检测方法 (57) 摘要 本发明公开了一种用于 SLE 早期诊断的 DNA 芯片以及CD11a和CD70甲基化水平的定量检测方 。

4、法。该 DNA 芯片的探针由针对 CD70 或 / 和 CD11a 的 CpG 位点而设计的寡核苷酸序列组成， 每个基 因设计一对区分甲基化与非甲基化的探针。在建 立 CD70 和 CD11a 荧光强度的标准化曲线后， 利用 该芯片， 本发明还可以定量检测待检样本 CD70 和 CD11a 基因的甲基化水平。本发明的芯片能广泛 用于红斑狼疮的早期诊断， 本发明用于定量检测 待检样品中红斑狼疮相关基因甲基化水平的方法 为帮助进行红斑狼疮临床早期诊断、 判断疾病活 动性以及疗效和预后评价提供了一种的精确、 廉 价、 快速的工具。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 朱晓乐 (19)中。

5、华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 9 页 附图 4 页 CN 101724691 B1/1 页 2 1. 一种用于诊断红斑狼疮的 DNA 芯片， 由基片和固定于基片上的探针组成， 其特征在 于 ： 所述探针由针对 CD70 基因或 CD11a 基因的 CpG 位点而设计的寡核苷酸序列组成， 每个 基因包括一对区分甲基化与非甲基化的探针 ； 所述探针 5 末端采用氨基进行活性基团的 标记， 采用醛基对固定 DNA 的基片进行修饰 ； 所述探针核苷酸序列为 ： CD11a-M ： 5 NH2-(T)10-TTATCGTATTAGGTCGTTTA ； CD11。

6、a-U ： 5 NH2-(T)10-TTATTGTATTAGGTTGTTTAA ； CD70-M ： 5 NH2-(T)10-ATACGCGCGCCACGATAC ； CD70-U ： 5 NH2-(T)10-AACATACACACACCACAATAC。 2. 一种用于诊断红斑狼疮的 DNA 芯片， 由基片和固定于基片上的探针组成， 其特征在 于 ： 所述探针由针对 CD70 基因和 CD11a 基因的 CpG 位点而设计的寡核苷酸序列组成， 每个 基因包括一对区分甲基化与非甲基化的探针 ； 所述探针 5 末端采用氨基进行活性基团的 标记， 采用醛基对固定 DNA 的基片进行修饰 ； 所述探针。

7、核苷酸序列为 ： CD11a-M ： 5 NH2-(T)10-TTATCGTATTAGGTCGTTTA ； CD11a-U ： 5 NH2-(T)10-TTATTGTATTAGGTTGTTTAA ； CD70-M ： 5 NH2-(T)10-ATACGCGCGCCACGATAC ； CD70-U ： 5 NH2-(T)10-AACATACACACACCACAATAC。 3. 如权利要求 1 或 2 所述的 DNA 芯片， 其特征在于 ： 每个探针重复 6 次。 权 利 要 求 书 CN 101724691 B1/9 页 3 CD11a、 CD70 基因甲基化水平定量检测方法 技术领域 0001。

8、 本发明涉及用于系统性红斑狼疮早期诊断的基因芯片， 还涉及基因甲基化定量检 测方法。 背景技术 0002 系统性红斑狼疮 (Systemic Lupus Erythematosus， 简称 SLE) 是一种多器官、 多 系统受累的自身免疫性疾病。作为一种典型的严重危害人类健康的自身免疫性疾病， 其病 因和发病机制非常复杂， 医学界至今尚不十分清楚。目前， SLE 的诊断主要依赖临床表现和 实验室检查， 临床表现包括如面颊部蝶形红斑等， 实验室检查主要有狼疮带试验、 抗核抗体 谱等。但根据临床表现及实验室检查确诊时， 患者往往已多器官系统受累。因此， 如果能将 SLE 的诊断上升到基因水平， 找。

9、到一种能用于临床的快速诊断工具， 则能对该疾病的早期诊 断和尽早干预起到重要作用。 0003 发明人的研究表明 ： T 细胞 DNA 低甲基化在 SLE 发病中起重要作用， 这种低甲基化 在 CD11a( 又称 ITGAL， GeneID ： 3683 ； HGNC6148) 和 CD70(GeneID ： 970 ； HGNC ： 11937) 这两 个基因中表现明显。近些年来对 SLE 发病机制的研究表明 SLE 患者 CD4+T 细胞中 CD11a 和 CD70 两个基因的特定 CpG 位点处于低甲基化状态， 其甲基化改变及模式有望成为极具前途 的 SLE 早期诊断标志。 发明内容 00。

10、04 本发明的目的在于提供一种用于 SLE 早期诊断的 DNA 芯片。 0005 本发明进一步目的在于提供一种检测待检样品中红斑狼疮相关基因 CD11a 和 CD70 甲基化水平的方法。 0006 本发明用于诊断红斑狼疮的 DNA 芯片由基片和固定于基片上的探针组成， 所述探 针由针对 CD70 或 / 和 CD11a 的 CpG 位点而设计的寡核苷酸序列组成， 每个基因设计一对区 分甲基化与非甲基化的探针， 采用氨基对每个探针 5 末端进行活性基团的标记， 固定 DNA 的基片用醛基修饰。 0007 所述针对 CD70 或 / 和 CD11a 的 CpG 位点而设计的探针具体核苷酸序列为 ：。

11、 0008 CD11a-M ： 5 NH2-(T)10-TTATCGTATTAGGTCGTTTA ； 0009 CD11a-U ： 5 NH2-(T)10-TTATTGTATTAGGTTGTTTAA ； 0010 CD70-M ： 5 NH2-(T)10-ATACGCGCGCCACGATAC ； 0011 CD70-U ： 5 NH2-(T)10-AACATACACACACCACAATAC。 0012 上述的 DNA 芯片的每个探针最好横向重复 6 次。 0013 本发明检测待检样品中 CD11a 和 CD70 甲基化水平的方法包括步骤 ： (1) 分别建立 CD70 和 CD11a 荧光强度。

12、的标准化曲线 ： 针对 CD11a 和 CD70 基因分别建立甲基化的阳性与 阴性质控品， 阳性与阴性质控品按质量比 0 1、 1 3、 1 1、 3 1、 1 0 混合， 5 组质控 品混合物分别与本发明的 DNA 芯片杂交， 得到荧光图谱和荧光强度数据 ； 阳性质控品杂交 说 明 书 CN 101724691 B2/9 页 4 的荧光强度标记为M， 阴性质控品杂交的荧光强度标记为U ； 以M/(M+U)为纵坐标， 甲基化阳 性产物在总产物中的百分比为横坐标， 分别得到CD70和CD11a基因甲基化的标准曲线方程 【A ： CD70 ： y0.925x+0.017(R20.9912)】 和 。

13、【B ： CD11a ： y0.933x-0.014(R20.9832)】 ； (2)取待检样品血， 分选CD4+T细胞， 提取DNA， 对抽提出的DNA进行亚硫酸氢钠转化处理， 用 荧光标记引物分别进行巢式 PCR 扩增， 将 PCR 产物分别与本发明的 DNA 芯片进行杂交， 分别 读取荧光信号强度Y， 将其分别带入上述CD70和CD11a的荧光强度标准曲线中， 分别计算出 X 即为待检样本 CD70 和 CD11a 基因的甲基化百分比。 0014 所述建立 CD70 和 CD11a 甲基化的阳性与阴性质控品的过程为 ： 取正常人外周血， 分选CD4+T细胞， 提取DNA， 对抽提出的DN。

14、A进行亚硫酸氢钠转化处理， 针对CD70和CD11a基 因分别巢式 PCR 扩增经亚硫酸氢钠转化处理后的 DNA， PCR 产物回收纯化后与 p-GEM T 载体 连接， 克隆至 DH5a 感受态细胞， 对重组阳性克隆进行测序， 挑选 CG 位点转变为 TG 的作为阴 性质控品， 而把仍为 CG 者作为阳性质控品。 0015 所述针对 CD11a 进行巢式 PCR 时， 第一轮 PCR 的引物为 ： 上游 5 -GAAGAATTCGTAG GTTGGTTTGAGTGTAGTGGTGTTTAAAA-3 ； 下游5-CTCTCTAGAACTAAAACCACAAATACATACCACCATA CCT。

15、AA-3 ； 0016 第二轮 PCR 引物为 ： 上游 5 -TTTAAGTAGTTGGGATTATAGGTAT-3 ； 下游 5 Cy3-ATTAA TAACTAATTATACTCCATTA-3 ； 0017 所述针对 CD70 巢式 PCR 第一轮引物为 ： 0018 上游 5 -GGTGAATTCTTTAAGGTTAGGAGTTTAAGTTTAGTT-3 ； 0019 下游 5 -CAATCTAGAACTACACATTTATTAAAAATTAAATTA-3 ； 0020 第二轮引物为 ： 0021 上游 5 Cy3-GTTGAATTCGGTTAATATGGTGAAATTTTATTTTT。

16、AT-3 ； 0022 下游 5 -CACTCTAGATACAACAAACATCCAAAAATTAAAAATA-3 。 0023 本发明的用于诊断红斑狼疮的 DNA 芯片能广泛用于红斑狼疮的早期诊断， 以达到 提高诊断效率， 降低诊断成本， 缩短诊断时间的目的。 0024 本发明用于定量检测待检样品中红斑狼疮相关基因甲基化水平的方法借助于红 斑狼疮相关基因集成的甲基化定量检测芯片， 为临床提供一种红斑狼疮早期诊断、 疾病活 动性以及疗效和预后评价的精确、 廉价、 快速的工具。 根据标准曲线计算出该患者甲基化百 分比， 芯片的高通量与便捷解决了耗时费力的问题， 应用方便， 成本减低。 具体实施方。

17、式 0025 实施例 1 制备用于检测红斑狼疮的 DNA 芯片 0026 1. 探针的设计 0027 用于诊断红斑狼疮的 DNA 芯片由基片和固定于基片上的探针组成， 基片可以是任 何适用于固定寡核苷酸探针的载体。 固定于基片上的探针则是针对CD70和CD11a特定CpG 位点而设计的， 根据 DNA 碱基序列识别的特异性原则， 每个基因设计了一对探针来区分甲 基化与非甲基化， 探针序列见表 1。 0028 本发明的 DNA 芯片上可以只包含针对 CD11a 特定 CpG 位点而设计的用于定量检测 该基因的 DNA 探针， 或仅包含针对 CD70 特定 CpG 位点而设计的用于定量检测该基因的。

18、 DNA 说 明 书 CN 101724691 B3/9 页 5 探针， 也可以同时包括两种探针。 0029 表 1 0030 0031 2.DNA 探针的点样及固定 0032 先将探针用碳酸缓冲液稀释至 50umol/L， 通过微阵列点样仪分别将表 1 中的各条 探针横向重复 6 次点印在基片上。为了使寡核苷酸探针有效地固定于基片上， 合成探针时， 采用氨基直接进行 5 末端活性基团的标记， 固定 DNA 的玻片用醛基修饰， 探针点印于玻片 后置于 37、 80的饱和湿度过夜进行进一步固定。 0033 3. 根据样本的芯片杂交结果与其测序结果的一致性来验证芯片的效度 0034 针对 CD70。

19、 和 CD11a 每个基因挑选一个 SLE 病人和一个健康对照样本， 一面用本发 明的芯片进行定量分析， 一面用传统的金标准亚硫酸氢钠测序， 每个样本挑选 20 个克隆进 行测序， 计算其甲基化水平， 两者相比较， 具有较好的一致性 ( 参见图 4 和图 5)。 0035 实施例 2 CD11a、 CD70 基因甲基化定量检测方法 0036 ( 一 ) 建立 CD11a、 CD70 基因甲基化标准曲线 0037 1. 制备 CD11a、 CD70 阳性和阴性质控品 0038 (1) 取人外周血标本 20ml ； 0039 (2) 免疫磁珠分选 CD4+T 细胞， 具体步骤如下 ： 0040 i。

20、. 取肝素抗凝静脉血与等量 PBS 充分混匀。 0041 ii. 在 50ml 离心管中加入淋巴细胞分离液， 使淋巴细胞分离液 ： PBS ： 待检血 ( 体 积比 ) 1 1 1， 用移液器将稀释后的肝素抗凝静脉血沿管壁缓慢叠加于分离液面上， 注意保持清楚的界面。20水平 2000rpm( 加速减速均为 0) 离心 30 分钟。 0042 iii. 离心后管内分为四层， 从上往下顺次为血浆和 PBS 液、 单个核细胞层、 淋巴细 胞分离液层、 红细胞层。单个核细胞层为血浆与淋巴细胞分离液处的一层白色云雾层狭窄 带， 单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外， 还含有血小板。用毛细血管插到云雾层。

21、， 小心吸取单个核细胞。置入另一干净离心管中， 加入 5 倍以上体积的 PBS， 1500rpm( 加速为 8， 减速为9)10分钟， 离心洗涤细胞两次。 将所得的单个核细胞悬液加入PBS洗涤一次， 250g 离心 10 分钟。弃上清 ； 0043 iv. 约每 107 个细胞加入 80l 缓冲液和 20l MACS CD4磁珠， 混匀 ； 0044 v.4避光孵育 15 分钟， 每 107 个细胞再加入 1 2ml 缓冲液洗涤细胞 ； 0045 vi.300g 离心 10 分钟， 弃上清， 加入 500l 缓冲液悬浮细胞 ； 0046 vii. 置 LS 分离柱于 Midi MACS 分选器。

22、中， 3ml 缓冲液湿润 LS 分离柱 ； 0047 viii. 将细胞悬液加入分离柱中， 待完全滴尽后， 加 3ml 缓冲液冲洗 LS 分离柱 3 说 明 书 CN 101724691 B4/9 页 6 次 ； 所得的滤过液为除去 CD4+T 细胞的单个核细胞， 收集于 15ml 干净离心管， 用于下一步分 离 CD8+T 细胞 ； 0048 ix. 将 LS 分离柱移出磁场， 加入 5ml 缓冲液将滞留在 LS 分离柱中的 CD4+T 细胞冲 出 ； 0049 (3) 提取 DNA ； DNA 抽提采用 TIANamp Genomic DNA kit( 血液 / 组织 / 细胞基因 组 D。

23、NA 提取试剂盒 ) 提取， 具体操作步骤如下 ： 0050 i. 上述分离出的 CD4+T 细胞， 加入 200l 缓冲液 GA， 振荡至彻底混匀。 0051 ii. 加入 20l 蛋白酶 K(20mg/ml) 溶液， 混匀。 0052 iii. 加入 220l 缓冲液 GB， 充分颠倒混匀， 70水浴箱中放置 10 分钟， 溶液应变 清亮， 简短离心以去除管盖内壁的水珠。 0053 iv.加220l无水乙醇， 充分振荡混匀15秒， 此时可能会出现絮状沉淀， 简短离心 以去除管盖内壁的水珠。 0054 v. 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱 CB3 中 ( 吸附柱放入收集管 中 )。

24、， 12,000rpm 离心 30 秒， 倒掉废液， 吸附柱 CB3 放入收集管中。 0055 vi.向吸附柱CB3中加入500l去蛋白液GD， 12,000rpm离心30秒， 倒掉废液， 吸 附柱 CB3 放入收集管中。 0056 vii. 向吸附柱 CB3 中加入 700l 漂洗液 PW， 12,000rpm 离心 30 秒， 倒掉废液， 吸 附柱 CB3 放入收集管中。 0057 viii.向吸附柱CB3中加入500l漂洗液PW， 12,000rpm离心30秒， 倒掉废液， 吸 附柱 CB3 放入收集管中。 0058 ix. 将吸附柱 CB3 放回废液收集管中， 12,000rpm 离心。

25、 2 分钟， 将吸附柱中残余的 漂洗液去除。将吸附柱 CB3 置于室温或 50温箱放置数分钟， 以彻底晾干吸附材料中残余 的漂洗液。 0059 x. 将吸附柱 CB3 转入一个干净的离心管中， 向吸附膜的中间部位悬空滴加 50 200l 经 65 70水浴预热的洗脱缓冲液 TE， 室温放置 2 5 分钟， 12,000rpm 离心 30 秒。 0060 xi. 离心得到的溶液再加入吸附柱 CB3 中， 室温放置 2 分钟， 12,000rpm 离心 2 分 钟。收集离出液。 0061 (4) 对抽提出的 DNA 进行亚硫酸氢钠转化处理 ； 采用 Qiagen 公司的 EpiTect Bisul。

26、fite 试剂盒处理 CD4+T 细胞 DNA， DNA 标本来自第一部分实验提取所得， 操作步骤按试 剂盒说明书进行， 具体如下 ： 0062 i. 往缓冲液 BW 中加入 30ml 无水乙醇 ； 0063 ii. 往缓冲液 BD 中加入 30ml 无水乙醇 ； 0064 iii. 将 310l 无酶水加入 310g carrier RNA 中， 得到 1g/l 的 carrier RNA 溶 液 0065 iv. 按 1 100 体积往缓冲液 BL 中加入 1g/l 的 carrier RNA 溶液， 使缓冲液 BL 中 carrier RNA 的浓度为 10g/ml ； 0066 v. 。

27、根据需要处理的样本多少溶解 Bisulfite Mix， 每管 Bisulfite Mix 中加入 800l 的无酶水， 剧烈震荡 5 分钟至完全溶解 ； 说 明 书 CN 101724691 B5/9 页 7 0067 vi. 在 200l 的 PCR 管中依次表 2.5 加入各成分， 充分震荡混匀， 0068 vii. 在 PCR 仪中按表 3 条件进行亚硫酸氢钠转换 ； 0069 表 2 亚硫酸氢钠处理反应物组成 0070 0071 表 3 亚硫酸氢钠处理反应条件 0072 0073 viii. 反应结束后将 PCR 管简短离心， 将所有的反应液体转至干净的 1.5mlEP 管 中 ； 。

28、0074 ix.加入560l缓冲液BL(含10g/mlcarrier RNA， 见第4步)， 震荡混匀， 简短 离心 ； 0075 x. 将上一步所得的所有液体全部转入带有收集管的 EpiTect spin 离心柱中， 13000rpm 离心 1 分钟， 倒掉废液， 将离心柱放回收集管中 ； 0076 xi.往离心柱中加入500l洗脱缓冲液BW， 13000rpm离心1分钟， 倒掉废液， 将离 心柱放回收集管中 ； 0077 xii.往离心柱中加入500l缓冲液BD， 室温孵育15分钟 ； 13000rpm离心1分钟， 倒掉废液， 将离心柱放回收集管中 ； 0078 xiii.13000rpm。

29、 离心 1 分钟， 倒掉废液， 将离心柱放回收集管中 0079 xiv. 往离心柱中加入 500l 洗脱缓冲液 BW， 13000rpm 离心 1 分钟， 倒掉废液， 将 离心柱放回收集管中 ； 说 明 书 CN 101724691 B6/9 页 8 0080 xv. 重复步骤 xiv 一次 ； 0081 xvi. 将离心管放入一个新的 2ml 的收集管中， 13000rpm 离心 1 分钟 ； 0082 xvii. 将离心管放入一个新的 1.5ml 的 EP 管中， 加 20l 缓冲液 EB， 12000rpm 离 心 1 分钟洗脱 DNA， 所得的液体即为纯化了的亚硫酸氢钠处理后的 DNA。

30、。 0083 (5) 巢式 PCR 扩增经亚硫酸氢钠转化处理后的 DNA ； 为了获得杂交信号， 所用巢式 PCR 引物中的一条需用 Cy3 标记， 具体见表 4。PCR 采用 promega 公司的 GoTaq hot star polymerase 系统， CD70 及 CD11a 的巢式第一轮反应体系及反应条件见表 5 及表 6， 第二轮 反应体系及反应条件见表 7 及表 8。 0084 表 4 巢式 PCR 引物序列 0085 0086 表 5 巢式 PCR 第一轮反应体系 0087 0088 表 6 巢式 PCR 第一轮反应条件 0089 说 明 书 CN 101724691 B7/。

31、9 页 9 0090 表 7 巢式 PCR 第二轮反应体系 0091 0092 表 8 巢式 PCR 第二轮反应条件 0093 0094 (6)将巢式PCR产物进行回收纯化， 操作过程按照回收纯化试剂盒(天根生物有限 公司 ) 的要求进行。 0095 (7) 将回收纯化后的 PCR 产物与 pGEM-T 载体连接， 具体过程如下 ： 将反应缓冲液 5l， 连接酶 1l， T 载体 1l， (pGEM-T easy vector 试剂盒提供 )(Promega， Madison， WI， USA) 与纯化后的 DNA 3l 加入 PCR 管中， 4过夜与载体连接。 0096 (8) 转化到 DH。

32、5a 感受态细胞， 具体步骤为 ： 0097 i. 连接产物加入 100lDH5a 感受态细胞中， 冰上 30 分钟 ； 说 明 书 CN 101724691 B8/9 页 10 0098 ii.42水浴 90 秒 ； 0099 iii. 冰上 2 分钟 ； 0100 iv. 加入 800l 不含氨苄青霉素的 LB 液体培养基， 置于摇床 37， 200rpm， 1 小 时 ； 0101 v.4000rpm 离心 10 分钟， 留沉淀涂于含氨苄青霉素的 LB 固体培养基上。培养基 37倒置过夜生长 ； 0102 vi. 培养基上挑取独立， 饱满的白色菌落作为重组阳性克隆， 加至 4ml 含氨苄。

33、青霉 素的 LB 液体培养基中 37， 300rpm 过夜培养 ； 0103 vii. 抽提质粒后进行测序 ； 0104 viii. 测序结果进行序列比对， 挑选 CG 位点转变为 TG 的作为阴性质控品， 而把仍 为 CG 者作为阳性质控品。 0105 2. 分别建立 CD11a、 CD70 甲基化标准曲线 0106 将甲基化阳性与阴性质控品 PCR 扩增， 阳性与阴性扩增产物按质量比 0 1、 1 3、 1 1、 3 1、 1 0 混合， 5 组质控品混合物分别与实施例 1 的芯片杂交， 得到荧光 图谱和荧光强度数据 ( 见图 1)。其中， 阳性质控品杂交的荧光强度标记为 M， 阴性质控品。

34、杂 交的荧光强度标记为 U。 0107 以 M/(M+U) 为纵坐标， 甲基化阳性产物在总产物中的百分比为横坐标， 每组探针 分别对应 5 个散点， 进行一元线性回归分析， 分别得到呈线性关系的 CD70 荧光强度线性回 归方程 【A ： CD70 ： y 0.925x+0.017(R2 0.9912)】 和标准曲线 ( 见图 2)， 以及 CD11a 的 荧光强度荧光强度线性回归方程 【B ： CD11a ： y 0.933x-0.014(R2 0.9832)】 和标准曲线 ( 见图 3)。 0108 ( 二 ) 样本 CD11a、 CD70 基因甲基化定量检测 0109 1. 样本中 CD。

35、11a、 CD70 的提取和扩增 ： 取待检人外周血标本 20ml ； 免疫磁珠分选 CD4+T 细胞 ； DNA 抽提 ； 对抽提出的 DNA 进行亚硫酸氢钠转化处理 ； 巢式 PCR。所有过程的具 体操作步骤见 ( 一 ) 中。 0110 2. 扩增产物与 DNA 芯片杂交 ： 将上述巢式 PCR 产物与实施例 1 中所述本发明的 DNA芯片进行杂交， 具体步骤为 ： 取5-10ul的荧光标记产物花青素5与3X杂交液混合， 与固 定在玻片上的探针进行杂交， 盖上盖玻片， 放入湿润的杂 交盒中孵育两个小时， 前一小时 42， 后一小时改为37， 然后将玻片用2XSSc， 0.2XSSc/0.。

36、5SDS各洗一次， 每次五分钟， 接着双蒸水洗两次， 每次五分钟， 然后氮气吹干， 在LuxScan-10K/A microarray scanner上 进行扫描。 0111 3. 信号检测与基因甲基化计算 ： 杂交信号可以通过包含绿光通道的激光芯片扫 描仪 ( 本方法所用为 LuxScan-10K/A microarray scanner)( 北京博奥生物有限公司 ) 进 行检测。扫描获得杂交信号， 用分析软件 (Genepix pro 3.0) 提取每个信号的荧光强度值， 为减少偏移， 取重复的六个信号荧光强度的平均值作为 Y 值， 将其带入相应的标准曲线中， 根据公式计算出的 X 值即为。

37、该样本的甲基化百分比。 0112 为了进一步对本发明的甲基化定量检测方法进行验证， 发明人进一步对 20 名 SLE 病人以及 20 名健康对照进行了芯片分析。芯片检测结果 ( 参见图 6 和图 7) 显示， 与健康 对照相比， SLE 病人的 CD70 和 CD11a 甲基化水平明显降低 ( 参见图 8)。 说 明 书 CN 101724691 B9/9 页 11 0113 以上对本发明实施例的描述并不限制本发明， 本领域技术人员根据本发明作出各 种变通均应属于本发明所附的权利要求所属的范围。 附图说明 0114 图 1 是 CD11a 和 CD70 甲基化阳性与阴性质控品按比例混合后与本发。

38、明芯片杂交 的荧光图 ； 0115 图 2 是 CD70 的甲基化标准曲线 ； 0116 图 3 是 CD11a 的甲基化标准曲线 ； 0117 图 4 是用传统测序和对本发明芯片定量分析 SLE 病人和健康对照样本的 CD70 甲 基化水平的一致性比较图 ； 0118 图 5 是用传统测序和对本发明芯片定量分析 SLE 病人和健康对照样本的 CD11a 甲 基化水平的一致性比较图 ； 0119 图 6 是对 20 例 SLE 和 20 名健康对照样本的 CD70 甲基化芯片检测荧光图 ； 0120 图 7 是对 20 例 SLE 和 20 名健康对照样本的 CD11a 甲基化芯片检测荧光图 ； 0121 图 8 是用本发明的方法检测 20 例 SLE 和 20 名健康对照样本的 CD70 和 CD11a 甲 基化率对照图。 说 明 书 CN 101724691 B1/4 页 12 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 101724691 B2/4 页 13 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 101724691 B3/4 页 14 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 101724691 B4/4 页 15 图 7 图 8 说 明 书 附 图 。