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一种胸腺法新的纯化方法.pdf

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文档编号：9075761

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1、(10)申请公布号 CN 103467593 A (43)申请公布日 2013.12.25 CN 103467593 A *CN103467593A* (21)申请号 201310399935.7 (22)申请日 2013.09.05 C07K 14/575(2006.01) C07K 1/20(2006.01) (71)申请人杭州诺泰制药技术有限公司地址 310018 浙江省杭州市杭州下沙六号大街 452 号高科技企业孵化园 1 号楼 3B01 杭州诺泰制药技术有限公司 (72)发明人路杨杨东晖陈晓航 (74)专利代理机构北京华科联合专利事务所 11130 代理人孟旭王为。

2、(54) 发明名称一种胸腺法新的纯化方法 (57) 摘要本发明涉及一种胸腺法新的纯化方法，其特征包括以下步骤：步骤 1，将胸腺法新粗品用水溶解，调节 pH3-5 ；步骤 2，按体积分数设置梯度，使用流动相 A 冲洗聚合物反相色谱柱；步骤 3，将步骤 1 溶液载入聚合物反相色谱柱中；步骤 4，按体积分数设置梯度，洗脱梯度的初始状态流动相 B 为 5%，保持 2 分钟，然后在 5 分钟内将流动相 B 比例增至 25%，然后在 30 分钟内将流动相 B 比例增至40%。分部收集洗脱馏分；步骤5，将洗脱馏分经过干燥得到纯品胸腺法新。 (5。

3、1)Int.Cl. 权利要求书 1 页说明书 9 页附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书1页说明书9页附图4页 (10)申请公布号 CN 103467593 A CN 103467593 A *CN103467593A* 1/1 页 2 1. 一种纯化胸腺法新的方法，该方法采用聚合物反相色谱法，可使成品胸腺法新中的杂质 D-Asn28- 胸腺法新含量降低到 0.3% 以下，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤 1，将胸腺法新粗品用水溶解，调节 pH3-4 ；步骤 2，按体积分数设置梯度，使用流动相 A 冲洗聚合物。

4、反相色谱柱；步骤 3，将步骤 1 溶液载入聚合物反相色谱柱中；步骤 4，按体积分数设置梯度，洗脱梯度的初始状态流动相 B 为 5%，保持 2 分钟，然后在 5 分钟内将流动相 B 比例增至 25%，然后在 30 分钟内将流动相 B 比例增至 40%。分部收集洗脱馏分；步骤 5，将洗脱馏分经过干燥得到纯品胸腺法新；其中色谱条件为：色谱柱采用聚合物反相填料柱 (UniPSTM10-100， 50mm250mm) ；流动相 A ： 0.3% 醋酸水溶液 ; 流动相 B ：乙腈；梯度程序为 : 初始状态流动相 B 为 5%，保持 2 分钟，然后在 5 分。

5、钟内将流动相 B 比例增至 25%，然后在 30 分钟内将流动相 B 比例增至 40%，流速为： 80mL min，检测波长为 220nm。 2. 根据权利要求 1 所述的方法，其特征是：包括以下步骤：步骤 1，样品处理：将 1g 胸腺法新粗肽溶解于 50ml 纯净水中，用氨水调节 pH 为 3-4 ；步骤 2，平衡按体积分数设置梯度，使用 100% 的流动相 A 冲洗聚合物反相色谱柱 10min ；步骤 3，上样将样品溶液载入色谱柱中；步骤 4，洗脱按体积分数设置梯度，梯度的初始状态流动相 B 为 5%，保持 2 分钟，然后在 5 分钟。

6、内将流动相 B 比例增至 25%，然后在 30 分钟内将流动相 B 比例增至 40%。分部收集洗脱馏分；步骤 5，冻干将洗脱馏分经过冻干得到纯品胸腺法新；其中，聚合物反相填料柱为 (UniPSTM10-100， 50mm250mm) ；流动相： A 为 0.3% 醋酸水溶液 ; 流动相 B 为乙腈；梯度程序为 : 初始状态流动相 B 为 5%，保持 2 分钟，然后在 5 分钟内将流动相 B 比例增至 25%，然后在 30 分钟内将流动相 B 比例增至 40%，流速为： 80mL min，检测波长为 220nm。权利要求书 CN 10346759。

7、3 A 2 1/9 页 3 一种胸腺法新的纯化方法技术领域： 0001 本发明涉及一种多肽类药物的纯化方法，特别涉及一种胸腺法新的纯化方法。背景技术： 0002 胸腺法新，英名为： Thymalfasin，为线性多肽，结构式如下： 0003 0004 可简写为： 0005 N-Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu- Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH 0006 胸腺法新 (Thymosin 1，也称胸腺肽 1)。

8、是胸腺素主要生物活性成分，为体内重要免疫调节物质，是氮端乙酰化的 28 个氨基酸组成的多肽。研究表明，胸腺法新促进骨髓干细胞发育分化为原淋巴细胞及前淋巴细胞；诱导 T 淋巴细胞分化与成熟，使已成熟的 T 细胞进一步分化为几个不同的亚群，如杀伤细胞、记忆细胞、效应细胞、辅导 T 淋巴细胞等，并产生各种可溶性介质；增强淋巴细胞对有丝分裂素的反应，并可增加淋巴组织的蛋白质和核酸的合成；增加 r-IFN、 a-IFN、 IL-2、 IL-3 和淋巴毒素的生成，增强抗病毒和抗肿瘤的免疫反应；抑制自身免疫反应；恢复抑制性T细胞的功能。目前胸腺法新已。

9、被广泛应用于临床，治疗多种疾病，如用于慢性乙型肝炎的治疗；用于丙型肝炎、肝细胞癌、恶性黑色素瘤的治疗；用于治疗感染性疾病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤等的治疗。 0007 有关合成胸腺法新的纯化，国内已有多个专利进行的报道。中国专利 CN201210052504 公开了一种胸腺法新的纯化方法，具体步骤包括活性炭吸附过滤、中性氧化铝色谱柱分离、超滤膜浓缩、乙醚沉降离心洗涤、干燥。 0008 中国专利 CN201110186259 采用反相 C18 填料，依次采用 0.1%TFA/ 乙腈、 0.2% 磷酸 / 乙腈和水 / 乙腈分别对胸腺法新粗肽进行第一次、。

10、第二次纯化和转盐制备。产品冻干后纯度达 99% 以上。说明书 CN 103467593 A 3 2/9 页 4 0009 中国专利 CN201010566609 首先采用离子交换色谱纯化合成的粗肽；再用反相液相色谱进一步纯化；最后采用滤膜进行纳滤一步完成浓缩及转盐。其特点在于以纳滤代替传统的旋蒸浓缩和色谱法转盐操作。 0010 中国专利CN200910304817提供了一种胸腺法新脱盐工艺。其工艺步骤为：将酸化后的胸腺肽 1 溶液与阳离子交换树脂混合后先用水洗脱离子交换树脂，再用碱性溶液洗脱交换树脂，收集在 230nm 波长处有吸收的洗脱液，最后经浓缩干燥，。

11、得胸腺法新。具有样品处理量大，脱盐效率好，可重复上样，适合于工业化大生产的特点。现有胸腺法新的固相合成过程中，由于合成步骤较多，加入的原料数量较多，造成产物杂质种类比较多，已知的杂质包括： D-Asn28- 胸腺法新、 Asp28- 胸腺法新、 di-Ala4- 胸腺法新等，未知杂质还有很多。有关杂质中 D-Asn28- 胸腺法新，结构如下： 0011 Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Ly s-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-。

12、Ala-Glu-D-Asn-OH 0012 该杂质为毒性最大的杂质之一，而且极其不稳定，易变色，该杂质的存在严重影响胸腺法新的色泽，含量以及使用安全。因此需要找到有效的方法将其去除并使其达到优质标准级别 0.3% 以下。本发明人研究发现，该杂质用现有技术的手段很难除去，有些方法虽可以去除部分，但去除效果不理想，难以达到优质标准级别同时容易造成胸腺法新本身收率降低。为此，本发明人重点研究如何去除杂质 D-Asn28- 胸腺法新而不影响胸腺法新的收率问题。 0013 本发明人用现有的纯化方法，对用固相合成法制备的胸腺法新进行了纯化，发现杂质 D-Asn28- 胸腺。

13、法新的含量均无法达到预订目标 0.3%。为此，本发明人对胸腺法新的纯化方法进行了研究，从而得到了本发明的技术方案。发明内容： 0014 本发明的目的是提供一种高收率、高纯度以及低杂质的胸腺法新的纯化方法。本发明需要解决的技术问题是：选择一种胸腺法新的纯化方法，解决 (1) 胸腺法新成品纯度不高， (2) 胸腺法新成品收率不高， (3) 胸腺法新与杂质 D-Asn28- 胸腺法新不能有效分离的问题。 0015 本发明中一些常用的缩写具有以下含义； 0016 Fmoc ：芴甲氧羰基 0017 Fmoc-AA-OH ： N- 芴甲氧羰基保护的氨基酸 0018 tBu ：。

14、叔丁基 0019 Cl-HOBt ： 6- 氯 -1- 羟基苯骈三唑 0020 DIC ： N， N - 二异丙基碳二亚胺 0021 Asp ：天冬氨酸 0022 Glu: 谷氨酸 0023 Ala ：丙氨酸 0024 Val ：缬氨酸 0025 Leu ：亮氨酸 0026 Lys ：赖氨酸说明书 CN 103467593 A 4 3/9 页 5 0027 Ile ：异亮氨酸 0028 Ser ：丝氨酸 0029 Thr ：苏氨酸 0030 Ala-Ala ：丙氨酰丙氨酸 0031 DMF ： N， N - 二甲基甲酰胺 0032 Piperidine ：六氢吡啶。

15、0033 Fmoc-Rink Amide MBHA resin ：用 Fmoc 保护的 Rink 氨甲基树脂 0034 TFA ：三氟醋酸 0035 TIS ：三异丙基硅烷 0036 MeOH ：甲醇 0037 DCM ：二氯甲烷 0038 本发明的技术方案为： 0039 使用聚合物反相填料柱可以使胸腺法新与杂质D-Asn28-胸腺法新得到有效分离。 0040 为此本发明提供一种胸腺法新的纯化方法，其特征在于，步骤如下：步骤 1，将胸腺法新粗品用水溶解，调节 pH 到 3-4 ； 0041 步骤 2，按体积分数设置梯度，使用流动相 A 冲洗聚合物反相色谱柱；步。

16、骤 3，将步骤 1 溶液载入聚合物反相色谱柱中； 0042 步骤 4，按体积分数设置梯度，洗脱梯度的初始状态流动相 B 为 5%，保持 2 分钟，然后在 5 分钟内将流动相 B 比例增至 25%，然后在 30 分钟内将流动相 B 比例增至 40%。分部收集洗脱馏分； 0043 步骤 5，将洗脱馏分经过干燥得到纯品胸腺法新。 0044 聚合物反相填料柱为 (UniPSTM10-100， 50mm250mm) ； 0045 流动相： A 为 0.3% 醋酸水溶液 ; 0046 流动相 B 为乙腈； 0047 梯度程序为 : 初始状态流动相 B 为 5%，保持 2 分钟。

17、，然后在 5 分钟内将流动相 B 比例增至 25%，然后在 30 分钟内将流动相 B 比例增至 40%。流速为： 80mL min， 0048 检测波长为 220nm。 0049 优选的操作步骤如下： 0050 步骤 1，样品处理： 0051 将 1g 的胸腺法新粗肽溶解于 50ml 纯净水中，用氨水调节 pH 为 3-4。 0052 步骤 2，平衡 0053 按体积分数设置梯度，使用 100% 的流动相 A 冲洗色谱柱 10min ； 0054 步骤 3，上样 0055 将样品溶液载入色谱柱中； 0056 步骤 4，洗脱 0057 按体积分数设置梯度，初始状态流动。

18、相 B 为 5%，保持 2 分钟，然后在 5 分钟内将流动相 B 比例增至 25%，然后在 30 分钟内将流动相 B 比例增至 40%，分部收集洗脱馏分。 0058 步骤 5，冻干 0059 将洗脱馏分经过冻干得到纯品胸腺法新。说明书 CN 103467593 A 5 4/9 页 6 0060 以下通过实验数据进一步说明本发明的有益效果： 0061 采用中国专利CN201210052504方法纯化粗品胸腺法新，测定杂质D-Asn28-胸腺法新的含量为 0.77% 0062 采用中国专利CN201110186259方法纯化粗品胸腺法新，测定杂质D-Asn28-胸腺法新。

19、的含量为 0.33% 0063 采用中国专利CN201010566609方法纯化粗品胸腺法新，测定杂质D-Asn28-胸腺法新的含量为 0.45% 0064 采用中国专利 CN CN200910304817 方法纯化粗品胸腺法新，测定杂质 D-Asn28- 胸腺法新的含量为 0.69% 0065 采用本发明的方法纯化粗品胸腺法新，测定杂质 D-Asn28- 胸腺法新的含量为 0.13%。 0066 本发明的方法是经过筛选获得的，筛选过程如下： 0067 1、聚合物反相填料的选择： 0068 UniPSTM10-100 ； UniPSTM20-300 0069 2、流动相的选。

20、择： 0070 醋酸水溶液 / 乙腈； TFA 水溶液 / 乙腈 0071 3、梯度洗脱程序的选择： 0072 梯度程序为 :（1）按体积分数设置梯度，初始状态流动相 B 为 5%，保持 2 分钟，然后在 5 分钟内将流动相 B 比例增至 25%，然后在 30 分钟内将流动相 B 比例增至 40%。（2）按体积分数设置梯度，初始状态流动相 B 为 5%，保持 2 分钟，然后在 5 分钟内将流动相 B 比例增至 20%，然后在 30 分钟内将流动相 B 比例增至 40%。 0073 为此提出了 6 种实验条件： 0074 实验条件 1 ：聚合物反相填料柱。

21、(UniPSTM10-100， 50mm250mm) ；流动相： A 为： 0.3%HAc水溶液;B为：乙腈；梯度程序为:初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后在5分钟内将流动相 B 比例增至 25%，然后在 30 分钟内将流动相B 比例增至 40%。流速为： 80mL min，检测波长为 220nm ； 0075 实验条件 2 ：聚合物反相填料柱 (UniPSTM20-300， 50mm250mm) ；流动相： A 为： 0.3%HAc 水溶液 ;B 为：乙腈；梯度程序为 : 初始状态流动相 B 为 5%，保持 2 分钟，然后在 5 分钟内将流。

22、动相 B 比例增至 25%，然后在 30 分钟内将流动相 B 比例增至 40%。流速为： 80mL min，检测波长为 220nm ； 0076 实验条件 3 ：聚合物反相填料柱 (UniPSTM10-100， 50mm250mm) ；流动相： A 为： 0.1%TFA水溶液;B为：乙腈；梯度程序为:初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后在5分钟内将流动相 B 比例增至 25%，然后在 30 分钟内将流动相 B 比例增至 40%。流速为： 80mL min，检测波长为 220nm ； 0077 实验条件 4 ：聚合物反相填料柱 (UniPSTM20-30。

23、0， 50mm250mm) ；流动相： A 为： 0.1%TFA水溶液;B为：乙腈；梯度程序为:初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后在5分钟内将流动相 B 比例增至 25%，然后在 30 分钟内将流动相 B 比例增至 40%。流速为： 80mL min，检测波长为 220nm ； 0078 实验条件 5 ：聚合物反相填料柱 (UniPSTM10-100， 50mm250mm) ；流动相： A 为：说明书 CN 103467593 A 6 5/9 页 7 0.3%HAc水溶液;B为：乙腈；梯度程序为:初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后。

24、在5分钟内将流动相 B 比例增至 20%，然后在 30 分钟内将流动相 B 比例增至 40%。流速为： 80mL min，检测波长为 220nm ； 0079 实验条件 6 ：聚合物反相填料柱 (UniPSTM20-300， 50mm250mm) ；流动相： A 为： 0.3%HAc水溶液;B为：乙腈；梯度程序为:初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后在5分钟内将流动相 B 比例增至 20%，然后在 30 分钟内将流动相 B 比例增至 40%。流速为： 80mL min，检测波长为 220nm ； 0080 采用实验条件1的方法纯化粗品胸腺法新，测定杂质。

25、D-Asn28-胸腺法新的含量如下： 0.14% 0081 采用实验条件2的方法纯化粗品胸腺法新，测定杂质D-Asn28-胸腺法新的含量如下： 0.21% 0082 采用实验条件3的方法纯化粗品胸腺法新，测定杂质D-Asn28-胸腺法新的含量如下： 0.25% 0083 采用实验条件4的方法纯化粗品胸腺法新，测定杂质D-Asn28-胸腺法新的含量如下： 0.35% 0084 采用实验条件5的方法纯化粗品胸腺法新，测定杂质D-Asn28-胸腺法新的含量如下： 0.15% 0085 采用实验条件6的方法纯化粗品胸腺法新，测定杂质D-Asn28-胸腺法新的含量如下：。

26、 0.19% 0086 以上结果表明，实验条件 1 的纯化效果最优。 0087 本发明方法得到的胸腺法新 40恒温箱放置，观察外观及性状，检测有关物质，试验结果如下 0088 时间，天外观、性状有关物质 0为白色粉末未见杂质斑点 10为白色粉末未见杂质斑点 30为白色粉末未见杂质斑点 60为白色粉末未见杂质斑点 90为白色粉末未见杂质斑点 0089 现有技术得到的胸腺法新 40恒温箱放置，观察外观及性状，检测有关物质，试验结果如下 0090 时间，天外观、性状有关物质 0为白色粉末未见杂质斑点 10为白色粉末未见杂质斑点 30为白色粉末未见杂质斑点 60为白色粉末未。

27、见杂质斑点 90为浅黄色粉末可见杂质斑点 0091 本发明的有益效果是：提供了一种高纯度（99.5%）、高收率（80% 以上）以及低杂质（D-Asn28- 胸腺法新含量小于 0.3%）的胸腺法新纯化方法。附图说明：说明书 CN 103467593 A 7 6/9 页 8 0092 图 1 粗肽的 HPLC 图谱 0093 检测方法均如下： 0094 色谱柱： Waters X-bridge5m C18(250mm4.6mm) 色谱柱或相当柱； 0095 流动相 A ： 0.1% 三乙胺磷酸调 pH2.0 ； 0096 流动相 B ：乙腈； 0097 洗脱流。

28、速： 1ml/min ； 0098 检测波长： 210nm ； 0099 洗脱梯度： 0100 时间（min）流动相 A（%）流动相 B（%） 08614 328020 338614 458614 图 2 纯化后胸腺法新 HPLC 0102 检测方法均如下： 0103 色谱柱： Waters X-bridge5m C18(250mm4.6mm) 色谱柱或相当柱； 0104 流动相 A ： 0.1% 三乙胺磷酸调 pH2.0 ； 0105 流动相 B ：乙腈； 0106 洗脱流速： 1ml/min ； 0107 检测波长： 210nm ； 0108 洗脱梯度： 0109 。

29、时间（min）流动相 A（%）流动相 B（%） 08614 328020 338614 458614 0110 图 3 对照品胸腺法新 HPLC 0111 检测方法均如下： 0112 色谱柱： Waters X-bridge5m C18(250mm4.6mm) 色谱柱或相当柱； 0113 流动相 A ： 0.1% 三乙胺磷酸调 pH2.0 ； 0114 流动相 B ：乙腈； 0115 洗脱流速： 1ml/min ； 0116 检测波长： 210nm ； 0117 洗脱梯度： 0118 时间（min）流动相 A（%）流动相 B（%） 08614 328020 338614 4。

30、58614 说明书 0101 CN 103467593 A 8 7/9 页 9 具体实施方式： 0119 实施例 1 ： 0120 Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Ly s-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH（胸腺法新）制备 0121 步骤 1 0122 Fmoc-Asp(RinkAmide-MBHA-Resin)-OtBu 合成 0123 称取Rink Amide MBHA树脂（替代度0.45mmol/g）（2.67g， 1。

31、.0equiv）加入固相合成管中，加入 DCM （10mL），控温 10-30搅拌溶胀 30min，抽滤除去液体。再加入 DMF （10mL2）洗涤。量取20% （v/v，下同） Piperidine/DMF溶液（9.0mL），加入固相合成管内，控温20-30 搅拌反应 5min，抽滤除去液体。再次量取 20%Piperidine/DMF 溶液（9.0mL），加入固相合成管内，控温 20-30搅拌反应 10min，抽滤除去液体。量取 DMF（10mL7）加入固相合成管洗涤后抽滤除去液体。另称取 Fmoc-Asp-OtBu（1.97g， 4equiv）。

32、， Cl-HOBt（0.82g， 4equiv）加入烧杯。量取 DMF/DCM=1/1 混合溶剂（6.5mL）加入烧杯，搅拌完全溶解后用冰盐浴冷却至 0-10，加入 DIC（0.89mL， 4.8equiv），搅拌，控温 0-10反应 5min，然后将此反应液加入到固相合成管内， 3h 后抽滤除去液体。量取 DMF（12mL3）加入固相合成管洗涤后抽滤除去液体。茚三酮检测呈阴性。 0124 步骤 2 0125 H-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser (tBu)-Ser(tBu )-Glu(OtB。

33、u)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-L ys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp(Rink Amide-MBHA-Resin)-OtBu 合成 0126 将步骤 1 产物氨基酸树脂按照相同方法脱去 Fmoc。称取 Fmoc-AA-OH（4equiv）， Cl-HOBt（4equiv）加入烧杯。量取 DMF/DCM=1/1 混合溶剂（6.5mL）加入烧杯，搅拌完全溶解后用冰盐浴冷却至。

34、5-10，加入 DIC （4.8equiv），搅拌，控温 5-25反应 5min，然后将此反应液加入到固相合成管内， 3h 后抽滤除去液体。量取 DMF（12mL3）加入固相合成管洗涤后抽滤除去液体。茚三酮检测，如结果为阳性，则重复进行偶联一次。所有氨基酸偶联结束后，再进行去 Fmoc 操作，并用 DMF 洗涤 7 遍。 0127 步骤 3 0128 Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu )-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Bo。

35、c)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-L ys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp(Rink Amide-MBHA-Resin)-OtBu 合成 0129 往步骤 2 所得产物肽树脂中加入含有 Ac2O（0.57mL， 5equiv）、吡啶 (0.48mL,5equiv) 的 DMF（8mL），于 15-20，反应 1h 后抽滤除去液体，再依次用 DMF （18mL3）、 MeOH（18mL2）、 DCM（20mL2。

36、）、 MeOH（18mL2）洗涤树脂。取出胸腺法新肽树脂，干燥后得 7.20g。 0130 步骤 4 0131 Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Ly s-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH（胸腺法新）合成说明书 CN 103467593 A 9 8/9 页 10 0132 量取 TFA（68mL）、 TIS（4.0mL）依次加入到 100mL 三口瓶中，，搅拌混匀，冷却至 15-20，将步骤 3 所得肽树脂加。

37、入三口瓶中。升温到 25-30反应 1h 后停止搅拌。将反应液过滤，并用 TFA（5mL2）洗涤树脂，合并后取滤液，置旋转蒸发仪中减压蒸馏除去大部分 TFA。将所得残留液加入到预冷至 -10 -5甲基叔丁基醚（120mL）中，进行沉降。所得悬浊液经重复离心、甲基叔丁基醚洗涤 6 遍后，得到糊状粗肽，减压干燥后得粗肽 4.22g。粗肽 HPLC 见图谱 1。取粗肽样品适量进行外标法定量，计算后得粗肽中含胸腺法新 2.25g，合成收率： 60.3%。 0133 步骤 5 0134 Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu。

38、-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Ly s-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH（胸腺法新） RP-HPLC 纯化 0135 称取步骤 4 所得粗肽 2.06g 用纯净水 35mL 溶解，调节 pH 到 3.50，充分搅拌后，过滤，得粗肽溶液。采取发明方法进行纯化制备，条件如下：色谱柱：聚合物反相填料柱 (UniPSTM10-100， 50mm250mm) ；流动相 A ： 0.3% 醋酸水溶液 ; 流动相 B ：乙腈；梯度程序 : 初始状态流动相 B 为 5%，保持 2 分钟，然后在 5 分。

39、钟内将流动相 B 比例增至 25%，然后在 30 分钟内将流动相 B 比例增至 40% ；流速为： 80mL min ；检测波长为 220nm。纯化后，并冻干得去氨加压素 0.90g，杂质 D-Asn28- 胸腺法新含量为 0.14%，胸腺法新含量： 99.78%，见图 2。纯化收率为 80%。 0136 胸腺法新的含量测定方法： 0137 粗肽中胸腺法新的含量 = 胸腺法新对照品含量胸腺法新粗肽主峰面积 / 胸腺法新对照品峰面积 100%=86.31%922.4698.98/854.04415.70=53.32% 0138 注：胸腺法新对照品和胸腺法新粗肽的检测。

40、条件和进样量一致，都为： 25l。 0139 胸腺法新对照品浓度： 8.98mg/ml 0140 胸腺法新对照品峰面积： 854.044mAU*min（图 3） 0141 胸腺法新对照品含量： 86.31% 0142 胸腺法新粗肽配制浓度： 15.70mg/ml 0143 胸腺法新粗肽主峰面积： 922.469mAU*min（图 1） 0144 本发明方法纯化后胸腺法新的含量 = 胸腺法新对照品含量胸腺法新精肽峰面积 / 胸腺法新对照品峰面积 100%=86.31%1176.3778.98/854.04410.70=99.78% 0145 注：胸腺法新对照品和胸腺法新精肽。

41、的检测条件和进样量一致，都为： 25l。 0146 胸腺法新对照品浓度： 8.98mg/ml 0147 胸腺法新对照品峰面积： 854.044mAU*min（图 3） 0148 胸腺法新对照品含量： 86.31% 0149 胸腺法新精肽配制浓度： 10.70mg/ml 0150 胸腺法新精肽峰面积： 1176.377mAU*min（图 2） 0151 本发明方法纯化后D-Asn28-胸腺法新的含量=胸腺法新对照品含量D-Asn28-胸腺法新峰面积校正因子/胸腺法新对照品峰面积100%=86.31%1.5831.048.98/ 854.04410.70=0.14% 0152 注。

42、：胸腺法新对照品和胸腺法新精肽的检测条件和进样量一致，都为： 25l。校正因子 D-Asn28- 胸腺法新的校正因子 1.04。说明书 CN 103467593 A 10 9/9 页 11 0153 胸腺法新对照品浓度： 8.98mg/ml 0154 胸腺法新对照品峰面积： 854.044mAU*min（图 3） 0155 胸腺法新对照品含量： 86.31% 0156 胸腺法新精肽配制浓度： 10.70mg/ml 0157 D-Asn28- 胸腺法新峰面积： 1.583mAU*min（图 2）。说明书 CN 103467593 A 11 1/4 页 12 说明书附图 CN 103467593 A 12 2/4 页 13 图 1 说明书附图 CN 103467593 A 13 3/4 页 14 图 2 说明书附图 CN 103467593 A 14 4/4 页 15 图 3 说明书附图 CN 103467593 A 15 。

摘要
申请专利号：	CN201310399935.7	申请日：	20130905
公开号：	CN103467593A	公开日：	20131225
当前法律状态：		有效性：	有效
法律详情：
IPC分类号：	C07K14/575,C07K1/20	主分类号：	C07K14/575,C07K1/20
申请人：	杭州诺泰制药技术有限公司
发明人：	路杨,杨东晖,陈晓航
地址：	310018 浙江省杭州市杭州下沙六号大街452号高科技企业孵化园1号楼3B01杭州诺泰制药技术有限公司
优先权：	CN201310399935A
专利代理机构：	北京华科联合专利事务所	代理人：	孟旭;王为
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内容摘要

本发明涉及一种胸腺法新的纯化方法，其特征包括以下步骤：步骤1，将胸腺法新粗品用水溶解，调节pH3-5；步骤2，按体积分数设置梯度，使用流动相A冲洗聚合物反相色谱柱；步骤3，将步骤1溶液载入聚合物反相色谱柱中；步骤4，按体积分数设置梯度，洗脱梯度的初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后在5分钟内将流动相B比例增至25%，然后在30分钟内将流动相B比例增至40%。分部收集洗脱馏分；步骤5，将洗脱馏分经过干燥得到纯品胸腺法新。

权利要求书

1.一种纯化胸腺法新的方法，该方法采用聚合物反相色谱法，可使成品胸腺法新中的杂质D-Asn-胸腺法新含量降低到0.3%以下，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤1，将胸腺法新粗品用水溶解，调节pH3-4；步骤2，按体积分数设置梯度，使用流动相A冲洗聚合物反相色谱柱；步骤3，将步骤1溶液载入聚合物反相色谱柱中；步骤4，按体积分数设置梯度，洗脱梯度的初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后在5分钟内将流动相B比例增至25%，然后在30分钟内将流动相B比例增至40%。分部收集洗脱馏分；步骤5，将洗脱馏分经过干燥得到纯品胸腺法新；其中色谱条件为：色谱柱采用聚合物反相填料柱(UniPS10-100，50mm×250mm)；流动相A：0.3%醋酸水溶液;流动相B：乙腈；梯度程序为:初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后在5分钟内将流动相B比例增至25%，然后在30分钟内将流动相B比例增至40%，流速为：80mL／min，检测波长为220nm。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：包括以下步骤：步骤1，样品处理：将1g胸腺法新粗肽溶解于50ml纯净水中，用氨水调节pH为3-4；步骤2，平衡按体积分数设置梯度，使用100%的流动相A冲洗聚合物反相色谱柱10min；步骤3，上样将样品溶液载入色谱柱中；步骤4，洗脱按体积分数设置梯度，梯度的初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后在5分钟内将流动相B比例增至25%，然后在30分钟内将流动相B比例增至40%。分部收集洗脱馏分；步骤5，冻干将洗脱馏分经过冻干得到纯品胸腺法新；其中，聚合物反相填料柱为(UniPS10-100，50mm×250mm)；流动相：A为0.3%醋酸水溶液;流动相B为乙腈；梯度程序为:初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后在5分钟内将流动相B比例增至25%，然后在30分钟内将流动相B比例增至40%，流速为：80mL／min，检测波长为220nm。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种多肽类药物的纯化方法，特别涉及一种胸腺法新的纯化方法。

背景技术：

胸腺法新，英名为：Thymalfasin，为线性多肽，结构式如下：

可简写为：

N-Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH

胸腺法新(Thymosin α1，也称胸腺肽α1)是胸腺素主要生物活性成分，为体内重要免疫调节物质，是氮端乙酰化的28个氨基酸组成的多肽。研究表明，胸腺法新促进骨髓干细胞发育分化为原淋巴细胞及前淋巴细胞；诱导T淋巴细胞分化与成熟，使已成熟的T细胞进一步分化为几个不同的亚群，如杀伤细胞、记忆细胞、效应细胞、辅导T淋巴细胞等，并产生各种可溶性介质；增强淋巴细胞对有丝分裂素的反应，并可增加淋巴组织的蛋白质和核酸的合成；增加r-IFN、a-IFN、IL-2、IL-3和淋巴毒素的生成，增强抗病毒和抗肿瘤的免疫反应；抑制自身免疫反应；恢复抑制性T细胞的功能。目前胸腺法新已被广泛应用于临床，治疗多种疾病，如用于慢性乙型肝炎的治疗；用于丙型肝炎、肝细胞癌、恶性黑色素瘤的治疗；用于治疗感染性疾病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤等的治疗。

有关合成胸腺法新的纯化，国内已有多个专利进行的报道。中国专利CN201210052504公开了一种胸腺法新的纯化方法，具体步骤包括活性炭吸附过滤、中性氧化铝色谱柱分离、超滤膜浓缩、乙醚沉降离心洗涤、干燥。

中国专利CN201110186259采用反相C18填料，依次采用0.1%TFA/乙腈、0.2%磷酸/乙腈和水/乙腈分别对胸腺法新粗肽进行第一次、第二次纯化和转盐制备。产品冻干后纯度达99%以上。

中国专利CN201010566609首先采用离子交换色谱纯化合成的粗肽；再用反相液相色谱进一步纯化；最后采用滤膜进行纳滤一步完成浓缩及转盐。其特点在于以纳滤代替传统的旋蒸浓缩和色谱法转盐操作。

中国专利CN200910304817提供了一种胸腺法新脱盐工艺。其工艺步骤为：将酸化后的胸腺肽α1溶液与阳离子交换树脂混合后先用水洗脱离子交换树脂，再用碱性溶液洗脱交换树脂，收集在230nm波长处有吸收的洗脱液，最后经浓缩干燥，得胸腺法新。具有样品处理量大，脱盐效率好，可重复上样，适合于工业化大生产的特点。现有胸腺法新的固相合成过程中，由于合成步骤较多，加入的原料数量较多，造成产物杂质种类比较多，已知的杂质包括：D-Asn28-胸腺法新、Asp28-胸腺法新、di-Ala4-胸腺法新等，未知杂质还有很多。有关杂质中D-Asn28-胸腺法新，结构如下：

Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-D-Asn-OH

该杂质为毒性最大的杂质之一，而且极其不稳定，易变色，该杂质的存在严重影响胸腺法新的色泽，含量以及使用安全。因此需要找到有效的方法将其去除并使其达到优质标准级别0.3%以下。本发明人研究发现，该杂质用现有技术的手段很难除去，有些方法虽可以去除部分，但去除效果不理想，难以达到优质标准级别同时容易造成胸腺法新本身收率降低。为此，本发明人重点研究如何去除杂质D-Asn28-胸腺法新而不影响胸腺法新的收率问题。

本发明人用现有的纯化方法，对用固相合成法制备的胸腺法新进行了纯化，发现杂质D-Asn28-胸腺法新的含量均无法达到预订目标0.3%。为此，本发明人对胸腺法新的纯化方法进行了研究，从而得到了本发明的技术方案。

发明内容：

本发明的目的是提供一种高收率、高纯度以及低杂质的胸腺法新的纯化方法。本发明需要解决的技术问题是：选择一种胸腺法新的纯化方法，解决(1)胸腺法新成品纯度不高，(2)胸腺法新成品收率不高，(3)胸腺法新与杂质D-Asn28-胸腺法新不能有效分离的问题。

本发明中一些常用的缩写具有以下含义；

Fmoc：芴甲氧羰基

Fmoc-AA-OH：Nα-芴甲氧羰基保护的氨基酸

tBu：叔丁基

Cl-HOBt：6-氯-1-羟基苯骈三唑

DIC：N，N′-二异丙基碳二亚胺

Asp：天冬氨酸

Glu:谷氨酸

Ala：丙氨酸

Val：缬氨酸

Leu：亮氨酸

Lys：赖氨酸

Ile：异亮氨酸

Ser：丝氨酸

Thr：苏氨酸

Ala-Ala：丙氨酰丙氨酸

DMF：N，N′-二甲基甲酰胺

Piperidine：六氢吡啶

Fmoc-Rink Amide MBHA resin：用Fmoc保护的Rink氨甲基树脂

TFA：三氟醋酸

TIS：三异丙基硅烷

MeOH：甲醇

DCM：二氯甲烷

本发明的技术方案为：

使用聚合物反相填料柱可以使胸腺法新与杂质D-Asn28-胸腺法新得到有效分离。

为此本发明提供一种胸腺法新的纯化方法，其特征在于，步骤如下：步骤1，将胸腺法新粗品用水溶解，调节pH到3-4；

步骤2，按体积分数设置梯度，使用流动相A冲洗聚合物反相色谱柱；步骤3，将步骤1溶液载入聚合物反相色谱柱中；

步骤4，按体积分数设置梯度，洗脱梯度的初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后在5分钟内将流动相B比例增至25%，然后在30分钟内将流动相B比例增至40%。分部收集洗脱馏分；

步骤5，将洗脱馏分经过干燥得到纯品胸腺法新。

聚合物反相填料柱为(UniPSTM10-100，50mm×250mm)；

流动相：A为0.3%醋酸水溶液;

流动相B为乙腈；

梯度程序为:初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后在5分钟内将流动相B比例增至25%，然后在30分钟内将流动相B比例增至40%。流速为：80mL／min，

检测波长为220nm。

优选的操作步骤如下：

步骤1，样品处理：

将1g的胸腺法新粗肽溶解于50ml纯净水中，用氨水调节pH为3-4。

步骤2，平衡

按体积分数设置梯度，使用100%的流动相A冲洗色谱柱10min；

步骤3，上样

将样品溶液载入色谱柱中；

步骤4，洗脱

按体积分数设置梯度，初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后在5分钟内将流动相B比例增至25%，然后在30分钟内将流动相B比例增至40%，分部收集洗脱馏分。

步骤5，冻干

将洗脱馏分经过冻干得到纯品胸腺法新。

以下通过实验数据进一步说明本发明的有益效果：

采用中国专利CN201210052504方法纯化粗品胸腺法新，测定杂质D-Asn28-胸腺法新的含量为0.77%

采用中国专利CN201110186259方法纯化粗品胸腺法新，测定杂质D-Asn28-胸腺法新的含量为0.33%

采用中国专利CN201010566609方法纯化粗品胸腺法新，测定杂质D-Asn28-胸腺法新的含量为0.45%

采用中国专利CN CN200910304817方法纯化粗品胸腺法新，测定杂质D-Asn28-胸腺法新的含量为0.69%

采用本发明的方法纯化粗品胸腺法新，测定杂质D-Asn28-胸腺法新的含量为0.13%。

本发明的方法是经过筛选获得的，筛选过程如下：

1、聚合物反相填料的选择：

UniPSTM10-100；UniPSTM20-300

2、流动相的选择：

醋酸水溶液/乙腈；TFA水溶液/乙腈

3、梯度洗脱程序的选择：

梯度程序为:（1）按体积分数设置梯度，初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后在5分钟内将流动相B比例增至25%，然后在30分钟内将流动相B比例增至40%。（2）按体积分数设置梯度，初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后在5分钟内将流动相B比例增至20%，然后在30分钟内将流动相B比例增至40%。

为此提出了6种实验条件：

实验条件1：聚合物反相填料柱(UniPSTM10-100，50mm×250mm)；流动相：A为：0.3%HAc水溶液;B为：乙腈；梯度程序为:初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后在5分钟内将流动相B比例增至25%，然后在30分钟内将流动相B比例增至40%。流速为：80mL／min，检测波长为220nm；

实验条件2：聚合物反相填料柱(UniPSTM20-300，50mm×250mm)；流动相：A为：0.3%HAc水溶液;B为：乙腈；梯度程序为:初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后在5分钟内将流动相B比例增至25%，然后在30分钟内将流动相B比例增至40%。流速为：80mL／min，检测波长为220nm；

实验条件3：聚合物反相填料柱(UniPSTM10-100，50mm×250mm)；流动相：A为：0.1%TFA水溶液;B为：乙腈；梯度程序为:初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后在5分钟内将流动相B比例增至25%，然后在30分钟内将流动相B比例增至40%。流速为：80mL／min，检测波长为220nm；

实验条件4：聚合物反相填料柱(UniPSTM20-300，50mm×250mm)；流动相：A为：0.1%TFA水溶液;B为：乙腈；梯度程序为:初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后在5分钟内将流动相B比例增至25%，然后在30分钟内将流动相B比例增至40%。流速为：80mL／min，检测波长为220nm；

实验条件5：聚合物反相填料柱(UniPSTM10-100，50mm×250mm)；流动相：A为：0.3%HAc水溶液;B为：乙腈；梯度程序为:初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后在5分钟内将流动相B比例增至20%，然后在30分钟内将流动相B比例增至40%。流速为：80mL／min，检测波长为220nm；

实验条件6：聚合物反相填料柱(UniPSTM20-300，50mm×250mm)；流动相：A为：0.3%HAc水溶液;B为：乙腈；梯度程序为:初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后在5分钟内将流动相B比例增至20%，然后在30分钟内将流动相B比例增至40%。流速为：80mL／min，检测波长为220nm；

采用实验条件1的方法纯化粗品胸腺法新，测定杂质D-Asn28-胸腺法新的含量如下：0.14%

采用实验条件2的方法纯化粗品胸腺法新，测定杂质D-Asn28-胸腺法新的含量如下：0.21%

采用实验条件3的方法纯化粗品胸腺法新，测定杂质D-Asn28-胸腺法新的含量如下：0.25%

采用实验条件4的方法纯化粗品胸腺法新，测定杂质D-Asn28-胸腺法新的含量如下：0.35%

采用实验条件5的方法纯化粗品胸腺法新，测定杂质D-Asn28-胸腺法新的含量如下：0.15%

采用实验条件6的方法纯化粗品胸腺法新，测定杂质D-Asn28-胸腺法新的含量如下：0.19%

以上结果表明，实验条件1的纯化效果最优。

本发明方法得到的胸腺法新40℃恒温箱放置，观察外观及性状，检测有关物质，试验结果如下

时间，天外观、性状有关物质 0 为白色粉末未见杂质斑点 10 为白色粉末未见杂质斑点 30 为白色粉末未见杂质斑点 60 为白色粉末未见杂质斑点 90 为白色粉末未见杂质斑点

现有技术得到的胸腺法新40℃恒温箱放置，观察外观及性状，检测有关物质，试验结果如下

时间，天外观、性状有关物质 0 为白色粉末未见杂质斑点 10 为白色粉末未见杂质斑点 30 为白色粉末未见杂质斑点 60 为白色粉末未见杂质斑点 90 为浅黄色粉末可见杂质斑点

本发明的有益效果是：提供了一种高纯度（99.5%）、高收率（80%以上）以及低杂质（D-Asn28-胸腺法新含量小于0.3%）的胸腺法新纯化方法。

附图说明：

图1粗肽的HPLC图谱

检测方法均如下：

色谱柱：Waters X-bridge5μm C18(250mm×4.6mm)色谱柱或相当柱；

流动相A：0.1%三乙胺磷酸调pH2.0；

流动相B：乙腈；

洗脱流速：1ml/min；

检测波长：210nm；

洗脱梯度：

时间（min）流动相A（%）流动相B（%） 0 86 14 32 80 20 33 86 14 45 86 14

[0101] 图2纯化后胸腺法新HPLC

检测方法均如下：

色谱柱：Waters X-bridge5μm C18(250mm×4.6mm)色谱柱或相当柱；

流动相A：0.1%三乙胺磷酸调pH2.0；

流动相B：乙腈；

洗脱流速：1ml/min；

检测波长：210nm；

洗脱梯度：

时间（min）流动相A（%）流动相B（%） 0 86 14 32 80 20 33 86 14 45 86 14

图3对照品胸腺法新HPLC

检测方法均如下：

色谱柱：Waters X-bridge5μm C18(250mm×4.6mm)色谱柱或相当柱；

流动相A：0.1%三乙胺磷酸调pH2.0；

流动相B：乙腈；

洗脱流速：1ml/min；

检测波长：210nm；

洗脱梯度：

时间（min）流动相A（%）流动相B（%） 0 86 14 32 80 20 33 86 14 45 86 14

具体实施方式：

实施例1：

Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH（胸腺法新）制备

步骤1

Fmoc-Asp(RinkAmide-MBHA-Resin)-OtBu合成

称取Rink Amide MBHA树脂（替代度0.45mmol/g）（2.67g，1.0equiv）加入固相合成管中，加入DCM（10mL），控温10-30℃搅拌溶胀30min，抽滤除去液体。再加入DMF（10mL×2）洗涤。量取20%（v/v，下同）Piperidine/DMF溶液（9.0mL），加入固相合成管内，控温20-30℃搅拌反应5min，抽滤除去液体。再次量取20%Piperidine/DMF溶液（9.0mL），加入固相合成管内，控温20-30℃搅拌反应10min，抽滤除去液体。量取DMF（10mL×7）加入固相合成管洗涤后抽滤除去液体。另称取Fmoc-Asp-OtBu（1.97g，4equiv），Cl-HOBt（0.82g，4equiv）加入烧杯。量取DMF/DCM=1/1混合溶剂（6.5mL）加入烧杯，搅拌完全溶解后用冰盐浴冷却至0-10℃，加入DIC（0.89mL，4.8equiv），搅拌，控温0-10℃反应5min，然后将此反应液加入到固相合成管内，3h后抽滤除去液体。量取DMF（12mL×3）加入固相合成管洗涤后抽滤除去液体。茚三酮检测呈阴性。

步骤2

H-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser (tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp(RinkAmide-MBHA-Resin)-OtBu合成

将步骤1产物氨基酸树脂按照相同方法脱去Fmoc。称取Fmoc-AA-OH（4equiv），Cl-HOBt（4equiv）加入烧杯。量取DMF/DCM=1/1混合溶剂（6.5mL）加入烧杯，搅拌完全溶解后用冰盐浴冷却至5-10℃，加入DIC（4.8equiv），搅拌，控温5-25℃反应5min，然后将此反应液加入到固相合成管内，3h后抽滤除去液体。量取DMF（12mL×3）加入固相合成管洗涤后抽滤除去液体。茚三酮检测，如结果为阳性，则重复进行偶联一次。所有氨基酸偶联结束后，再进行去Fmoc操作，并用DMF洗涤7遍。

步骤3

Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp(RinkAmide-MBHA-Resin)-OtBu合成

往步骤2所得产物肽树脂中加入含有Ac2O（0.57mL，5equiv）、吡啶(0.48mL,5equiv)的DMF（8mL），于15-20℃，反应1h后抽滤除去液体，再依次用DMF（18mL×3）、MeOH（18mL×2）、DCM（20mL×2）、MeOH（18mL×2）洗涤树脂。取出胸腺法新肽树脂，干燥后得7.20g。

步骤4

Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH（胸腺法新）合成

量取TFA（68mL）、TIS（4.0mL）依次加入到100mL三口瓶中，，搅拌混匀，冷却至15-20℃，将步骤3所得肽树脂加入三口瓶中。升温到25-30℃反应1h后停止搅拌。将反应液过滤，并用TFA（5mL×2）洗涤树脂，合并后取滤液，置旋转蒸发仪中减压蒸馏除去大部分TFA。将所得残留液加入到预冷至-10～-5℃甲基叔丁基醚（120mL）中，进行沉降。所得悬浊液经重复离心、甲基叔丁基醚洗涤6遍后，得到糊状粗肽，减压干燥后得粗肽4.22g。粗肽HPLC见图谱1。取粗肽样品适量进行外标法定量，计算后得粗肽中含胸腺法新2.25g，合成收率：60.3%。

步骤5

Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH（胸腺法新）RP-HPLC纯化

称取步骤4所得粗肽2.06g用纯净水35mL溶解，调节pH到3.50，充分搅拌后，过滤，得粗肽溶液。采取发明方法进行纯化制备，条件如下：色谱柱：聚合物反相填料柱(UniPSTM10-100，50mm×250mm)；流动相A：0.3%醋酸水溶液;流动相B：乙腈；梯度程序:初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后在5分钟内将流动相B比例增至25%，然后在30分钟内将流动相B比例增至40%；流速为：80mL／min；检测波长为220nm。纯化后，并冻干得去氨加压素0.90g，杂质D-Asn28-胸腺法新含量为0.14%，胸腺法新含量：99.78%，见图2。纯化收率为80%。

胸腺法新的含量测定方法：

粗肽中胸腺法新的含量=胸腺法新对照品含量×胸腺法新粗肽主峰面积/胸腺法新对照品峰面积×100%=86.31%×922.469×8.98/854.044×15.70=53.32%

注：胸腺法新对照品和胸腺法新粗肽的检测条件和进样量一致，都为：25μl。

胸腺法新对照品浓度：8.98mg/ml

胸腺法新对照品峰面积：854.044mAU*min（图3）

胸腺法新对照品含量：86.31%

胸腺法新粗肽配制浓度：15.70mg/ml

胸腺法新粗肽主峰面积：922.469mAU*min（图1）

本发明方法纯化后胸腺法新的含量=胸腺法新对照品含量×胸腺法新精肽峰面积/胸腺法新对照品峰面积×100%=86.31%×1176.377×8.98/854.044×10.70=99.78%

注：胸腺法新对照品和胸腺法新精肽的检测条件和进样量一致，都为：25μl。

胸腺法新对照品浓度：8.98mg/ml

胸腺法新对照品峰面积：854.044mAU*min（图3）