富含葡糖苷配基异黄酮的植物蛋白提取物和分离物及其生产方法 本申请是1996年4月12日提交的共同未决美国专利申请08/307,752的继续申请。
本发明涉及富含葡糖苷配基异黄酮的提取物和分离物的生产方法，这种生产方法是从植物蛋白物质提取可溶性物质，并在使大多数葡糖苷(gulucone)异黄酮转化为保留在蛋白质分离物中的葡糖苷配基异黄酮的条件下用一种或多种β-葡糖苷酶处理。
异黄酮存在于包含植物蛋白物质的各种豆科植物(如大豆)中。这些化合物包括异黄酮苷、6″-OAc异黄酮苷、6″-OMal异黄酮苷、黄豆苷原、染料木苷、6″-OAc染料木苷、6″-OMal染料木苷、染料木黄酮、glycitin,6″-OMal glycitin，黄豆黄素、生原禅宁A、芒柄花黄素和香豆甾醇(coumesterol)。典型地，这些化合物和大豆的内在的苦味有关，在商业产品如分离物和浓缩物的生产中，注意力已转移到除去这些物质。例如，在大豆蛋白质分离物生产地常规过程(其中大豆片以含水的碱性介质提取)中，许多异黄酮在提取物中溶解，并在乳清(通常在蛋白质酸沉淀后丢弃，以形成分离物)中具有可溶生。留在酸沉淀的蛋白质分离物中的剩余的异黄酮通常由充分洗涤分离物除去。
近来已经意识到：植物蛋白(如大豆)中包含的异黄酮可以阻止人癌细胞(如乳房癌细胞和前列腺癌细胞)生长，这些在下列文献中有描述：“染料木黄酮抑制人乳房癌细胞生长，雌激素受体和混合药物抗性基因的独立性”，Peterson和Barnes，生物化学和生物物理研究通讯，179卷，第1期，pp.661-667,1991年8月30日；“染料木黄酮和生原禅宁A抑制人前列腺癌细胞生长但不使表皮生长因子受体酪氨酸自身磷酸化”，Peterson和Barnes，前列腺，22卷，pp.335-345(1993)和“大豆在乳房癌模型中抑制乳房肿瘤”，Barnes等，食物中的致变物和致癌物，pp.239-253(1990)。
在上述异黄酮中，一些以与葡萄糖分子连接的葡糖苷存在。一些葡糖苷(如6″-OAc染料木苷)包含连接到葡萄糖分子自身6位的乙酸基团。当所有的异黄酮(包括糖苷)对医学评估有益时，大多数有益的特定异黄酮是葡糖苷配基，其中葡萄糖分子未被连接。这些异黄酮不是如葡糖苷或异黄酮葡糖苷是水溶性的。在这一类中的特定异黄酮是黄豆苷原、染料木黄酮和黄豆黄素。这些苷葡糖苷配基有下列通式：其中R1,R2,R3和R4可以选自由H,OH和OCH3组成的基团。因此本发明涉及苷葡糖苷配基和含这些物质的植物蛋白分离物的富集方法。
把葡糖苷异黄酮转化成为葡糖苷配基异黄酮的方法(如Obata等的日本专利申请258,669中所述的)在本领域是已知的。这种方法仅达到中等程度的转变，因此不是那么理想，特别是对于大规模的商业生产如此。此外，如在′669申请中所述的已知的方法教导了从蛋白质物质除去异黄酮，而没有描述如何制备富含葡糖苷配基异黄酮的蛋白质提取物或分离物。这样，就需要一种把至少大多数，优选地把基本上全部葡糖苷异黄酮转化为葡糖苷配基异黄酮的方法，以及生产富含葡糖苷配基异黄酮的蛋白质提取物和分离物。
因此本发明的目的是提供富含葡糖苷配基异黄酮的提取物和蛋白质分离物，以及生产这类物质的方法。这一目的和其它目的尤其在以下阐述的本发明的详细描述中达到。
本发明提供了富含葡糖苷配基异黄酮的植物蛋白提取物和分离物，及生产这类物质的方法。生产这类提取物的方法包括用具有高于大约植物蛋白物质等电点的pH的含水提取剂提取包含葡糖苷异黄酮的植物蛋白物质，并且在足以使提取物中至少大多数葡糖苷异黄酮转化为葡糖苷配基异黄酮的时间，温度和pH下，使葡糖苷异黄酮和足够量的β-葡糖苷酶或酯酶反应，由此产生富含葡糖苷配基异黄酮的提取物。本发明也提供了生产这类提取物的方法，其中将补充的β-葡糖苷酶加入到所说的提取物中，以产生富含葡糖苷配基异黄酮的提取物。本发明还提供了获得富含葡糖苷配基的蛋白质分离物的方法，此法是调节以前所述的提取物的pH到大约蛋白质物质的等电点，以沉淀蛋白质物质并产生富含葡糖苷配基异黄酮的蛋白质分离物。然后，可以分离并脱水所产生的富含葡糖苷配基异黄酮的分离物，形成干的富集分离物。此外，本发明提供了以较高的比例从植物蛋白物质回收异黄酮的方法。
虽然本发明将就大豆产品加以描述，且虽然此方法特别适于从大豆物质生产富含葡糖苷配基异黄酮的提取物和分离物，然而本方法一般地适用于生产来自各种包含异黄酮的植物蛋白源的蛋白质提取物和分离物。这类源的例子是包含大豆物质的植物蛋白物质。如本文所使用的术语“大豆物质”指大豆或任何大豆衍生物。
按照优选的实施方案的提取物或分离物的起始物质是大豆片，其中通过溶剂萃取除去了油。大豆片用pH高于大约蛋白质物质等电点的含水提取剂提取，优选的pH约6.0-10.0，最优选的pH约6.7-9.7。如果要求提高含水提取剂(如氢氧化钠、氢氧化钾和氢氧化钙)的pH，可以使用典型的碱性试剂。所需的异黄酮化合物典型地溶解于含水的提取物。为了最大地回收含水提取物中的这些化合物，也要求大豆片与提取物的重量比控制在特定的水平上，以溶解尽可能多的蛋白质物质中固有的异黄酮。
蛋白质和异黄酮的提取可以以各种方法(包括以含水提取剂与大豆片的重量比约8∶1到16∶1的大豆片反流提取，其中初始的提取物用于提取大豆片，并提供蛋白质和异黄酮的含才提取物)进行。作为选择，可以使用一种两步提取法，其中初始步骤中提取剂与大豆片的重量比约10∶1，然后用新鲜的提取剂第二次提取大豆片，以提取剂与大豆片大约6∶1或更小的重量比进行，因此，两个步骤中提取剂与大豆片的混合重量比不超过提取剂与大豆片的约16∶1的总重量比。
除去不溶性物质之后，将形成的包含溶解的异黄酮的含水蛋白质提取物接着与一种或多种β-葡糖苷酶反应，以便将大多数(优选地是基本上全部的)葡糖苷形式的异黄酮(连接有葡萄糖分子)转化成葡糖苷配基异黄酮。β-葡糖苷酶的最适pH范围将依赖于所利用的特定β-葡糖苷酶变化，但是典型地将在约4和约8之间变化。在与酶反应前，将提取物的pH典型地调整到特定酶活性最强的大约pH范围内。典型地pH是通过加入可食用的酸如醋酸、硫酸、磷酸、盐酸或任何其它合适的试剂调整的。
β-葡糖苷酶可以天然存在于大豆物质中或从微生物生长中产生，本文称为“残余”酶，或可以加到蛋白质提取物中。添加的酶本文称为“辅助酶”。通常，如果大豆物质或者提取物中的残余酶浓度不足以转化大多数(优选地是基本上全部)葡糖苷形式的异黄酮成为葡糖苷配基形式，则应加入辅助酶。足以进行异黄酮转变的酶量随许多因素(包括存在的酶类型、酶浓度的分布、系统的PH和存在的酶活性)变化。一旦存在足够的酶浓度，通过残余酶、辅助酶的任何一种或两种酶，在足以使至少大多数(优选地是基本上全部的)提取物中包含的葡糖苷异黄酮转化为葡糖苷配基形式的时间，温度和pH下使含有溶解的异黄酮的蛋白质提取物与β-葡糖苷酶反应。
优选的辅助β-葡糖苷酶包括生物果胶酶100L和300L，生物果胶酶OK70L，乳糖酶F和乳酶。乳糖酶F由Amano国际酶公司，P.O.Box1000,Troy,VA22974提供，这种酶的最适pH范围为约4到6，乳酶由NovoIndustries，酶部，Novo Alle,DK-2880 Bagsvaerd，丹麦提供，这种酶的最适pH范围约为7。生物果胶酶100L、生物果胶酶300L和生物果胶酶OK 70L由Quest International,Sarasota,Florida提供。加入足够数量的辅助酶以转化至少大多数(优选地是基本上全部)葡糖苷异黄酮为葡糖苷配基。在有必要加入辅助酶的情况下，加入的酶量以干基蛋白质沉淀物的重量计约0.5％到约5％。
另一类合适的酶是酯酶。这些酶认为非常适于本文所述的优选的实施方案的方法，由于它们通过从异黄酮的缀合物除去乙酸酯和丙二酸酯基团转化乙酸酯和丙二酸酯缀合物为葡糖苷异黄酮。在大多数优选的实施方案中，利用两种类型的酶β-葡糖苷酶和酯酶。
优选的实施方案的方法优选地是一步法，并在比较短的时间内，比较容易而经济地完成很高程度的异黄酮的转化(从葡糖苷形式至葡糖苷配基形式)。如本文所使用的术语“一步’反应方法指其中某些方法参数值在反应过程中总的来说被保持的反应方法。这些方法参数包括pH和温度。
转化的很高的程度是这样的，因此至少大多数(优选地是基本上全部)大豆物质提取物中存在的葡糖苷形式的异黄酮转化为葡糖苷配基形式。术语“大多数”指葡糖苷异黄酮转化为葡糖苷配基异黄酮的程度至少约50％。术语“基本上全部”指葡糖苷异黄酮转化为葡糖苷配基异黄酮的程度至少约80％，最优选的至少大约90％。
虽然不希望限于任何特殊的理论，相信本文所述的惊人的和意想不到的高度的转化是由一步反应方法中利用的方法参数的组合引起的。优选的是，反应系统的pH保持在约4到8的值(或者大约如此)，最优选的是在一步反应方法中酶与异黄酮缀合物反应前，反应系统的pH保持在酶活性最强的值。优选的是，反应系统的温度保持在约40℃到约60℃(或者大约如此)，最优选的是在一步反应方法中反应系统的温度保持在约60℃。通常，通过本文所述的一步方法，完成基本上全部葡糖苷异黄酮转化为葡糖苷配基所必需的时间约2小时到24小时。
与一种或多种β-葡糖苷酶反应之后，通过加入酸，把pH调整到大豆蛋白质的等电点，通常在约4.0至5.0之间，优选地在约4.4至4.6之间。调整pH到等电点沉淀含较少可溶性葡糖苷配基的凝乳形式的蛋白质。在沉淀后，把凝乳或沉淀的蛋白质从乳清分离，如通过离心形成富含葡糖苷配基异黄酮的蛋白质分离物。
在优选的实施方案中，为了充分地减少从蛋白质沉淀除去葡糖苷配基异黄酮，尽管葡糖苷配基在水中的溶解生比其它异黄酮更小，仍可提供富含葡糖苷配基异黄酮的分离物，但要避免完全洗涤或者最少地洗涤沉淀的蛋白质物质。因此用水洗涤酸沉淀的蛋白质可以完全避免，或可限于用水的单一洗涤，在此方法中水与沉淀的蛋白质物质的重量比在大约2∶1至6∶1之间。尽管更充分的洗涤回收较少的异黄酮，但这种酸沉淀的凝乳的洗涤的不足提供了富含所需水平的异黄酮的分离物。中等量的洗涤提供了具有干基约1.5-3.5mg/g染料木黄酮和约1.0-3.0mg/g的黄豆苷原含量的蛋白质分离物。
然后，通过离心或浓缩组合使酸沉淀的蛋白质脱水，并以常规方式干燥。虽然利用常规干燥技术(如喷雾干燥以形成干燥的分离物)是优选的，但优选的实施方案不限于用特殊的方式脱水。本文描述的方法提供了具有增加的葡糖苷配基异黄酮量的分离物。
本发明也提供了从植物蛋白物质(如大豆物质)以十分高的比例回收异黄酮的方法。通过本文描述的方法，基于开始的植物蛋白物质中所有形式的全部特殊异黄酮可达到的回收水平典型地至少50％，优选地65％，最优选地80％。虽然不希望限于任何特殊的理论，但相信高回收来自本文描述的转化反应以及也描述的各种加工操作。在加工的一个特殊阶段，通过转化相对可溶的葡糖苷异黄酮缀合物为溶解性较小的葡糖苷配基形式，在产物中回收高百分比异黄酮(源于饲料)是可能的。
下列实施例描述了本发明的特定的但非限制性的实施方案。
实验
通过加入5克提取的脱脂大豆片(粉)到5克水中制备样品，并调整pH为7和8。加入0.25克乳糖酶F或乳酶到每种悬浮液，因此每一种样品中，以固体的重量计，酶浓度为大约5％。样品在40℃和60℃温育。加入酶之前(t=0)和在目标温度下温育24小时后提取小样品。温育24小时后，具有乳糖酶F或乳酶的大豆片(粉)中异黄酮变化和分布的百分比在表1中显示。加入辅助酶之前，样品没有消毒，且微生物和污染物生长没有受到抑制。
表1
6″-OMAL-6″-OAC 6″-OML-6″-OAC 6″-OMAL样品 染料木苷 染料木苷 染料木苷 染料木苷 异黄酮苷 异黄酮苷 异黄酮苷 异黄酮苷 GLYCITIN GLYCITIN 黄豆黄素
％ ％ ％ ％ ％ ％ ％ ％ ％ ％ ％t=0 16 80 0 4 16 79 1 3 22 62 16pH7.0,40 ℃,t=24不加酶 4 48 0 48 3 51 0 46 0 42 58乳糖酶F 2 39 0 59 2 41 0 57 0 30 70 乳酶 3 45 0 51 2 49 1 48 0 40 60pH7.0,60℃,t=24不加酶 5 22 0 73 7 33 0 60 4 21 75乳糖酶F 10 32 0 59 10 35 3 52 6 23 71 乳酶 4 22 0 76 5 33 0 62 0 23 77pH8.0,40℃,t=24不加酶 6 49 0 47 3 50 2 45 0 43 57乳糖酶F 3 39 0 58 3 40 3 55 0 29 71 乳酶 5 46 0 49 4 48 0 47 0 40 60pH8.0,60℃,t=24不加酶 2 14 0 84 3 26 3 70 0 15 85乳糖酶F 6 24 0 80 8 30 3 59 5 22 74 乳酶 2 14 0 84 3 24 6 67 0 16 84
这些数据表明通过残余酶和辅助酶的组合可达到的转化程度。残余酶的来源可以是微生物生长或内源性大豆酶。异黄酮缀合物到葡糖苷配基的显著转化发生在pH为8,60℃下温育24小时的大豆片(粉)中。本文描述的每一种类型的异黄酮的浓度基于那一种类型的异黄酮的所有形式的全部。
另一系列样品通过形成脱脂大豆片的16％水悬浮液制备。样品的pH是调整到4.5和7，并在45℃温育24小时。在0和24小时取小样品。分析所有样品的异黄酮含量。表2表明在pH4.5和7,45℃下温育24小时之后，脱脂大豆片中计算的异黄酮分布百分比的变化。
表2
6″-OMAL-6″-OAC 6″-OML-6″-OAC 6″-OMAL 样品 染料木苷 染料木苷 染料木苷 染料木苷 异黄酮苷 异黄酮苷 异黄酮苷 异黄酮苷 GLYCITIN GLYCITIN 黄豆黄素
％ ％ ％ ％ ％ ％ ％ ％ ％ ％ ％t=0 大豆片
49 46 0 4 49 44 3 3 44 33 2245℃,pH7.0,t=24 大豆片
3 28 0 69 2 35 5 59 0 28 7345℃,pH4.5,t=24 大豆片
19 42 0 39 17 48 4 31 14 37 49
这些数据表明通过蛋白质物质中残余酶可达到的转化程度。温育24小时后，在pH为7，温度为45℃发生异黄酮缀合物到葡糖苷配基的明显转化。
在另一系列实验中，研究了衍生自大豆的蛋白质分离物中染料木黄酮和黄豆苷原回收的百分比。通过测定分离物中染料木黄酮(或黄豆苷原)的量，并以基于大豆起始物质中所有形式的染料木黄酮(或黄豆苷原)的总量的百分比表示该量，得到回收百分比。100g脱脂大豆粉用1,000g水提取，其在32℃的温度下，通过加入氢氧化钠调整pH为9.7。这提供了10∶1的水与大豆粉的重量比。把大豆粉从提取物中分离出来，并以具有pH为9.7，温度为32℃的600g含水提取物再次提取。第二提取步骤提供了6∶1的水与大豆粉的重量比。通过离心分离大豆粉，第一次和第二次提取物混和，并调整pH到4.5以形成大豆乳清和酸沉淀的凝乳的浆液。把该浆液加热到50℃，并按酶凝乳干重的2％加入乳糖酶F。使得浆液在50℃下反应16小时，以保证完成葡糖苷异黄酮向葡糖苷配基形式的转化。把酸沉淀的凝乳通过离心从乳清分离以形成富含葡糖苷配基的分离物。避免用水进一步洗涤沉淀的凝乳。在分离物中回收的染料木黄酮的量是起始大豆物质(脱脂大豆粉)中所有形式的染料木苷和染料木黄酮的总量的86％。类似地，分离物中回收的黄豆苷原的量是75％。
下列是用于定量大豆产品中异黄酮的方法的描述。通过把0.75g样品(喷雾干燥或细磨粉)和50ml的80/20甲醇/水溶剂混合，从大豆产品提取异黄酮。混合物在室温下以定轨摇床摇动2小时。2小时后，剩余的未溶解的物质通过Whatman42号滤纸过滤除去。5ml滤液以4ml水和5ml甲醇稀释。
提取的异黄酮利用Beckman C18反相柱经HPLC(高效液相层析)分离。把异黄酮注射到柱上，并用溶剂梯度洗脱，开始用88％甲醇，10％水和2％冰乙酸，最后用98％甲醇和2％冰乙酸。以0.4ml/分的流速，所有异黄酮-染料木苷，6″-O-乙酰染料木苷，6″-O-丙二酰染料木苷，染料木黄酮，异黄酮苷，6″-O-乙酰异黄酮苷，6″-O-丙二酰异黄酮苷，异黄酮苷，glycitin及它的衍生物和黄豆黄素被清楚地分辨。峰检测通过262nm的UV吸收。鉴别峰用质谱仪进行。
通过利用从Indofine化学公司，Sommerville,NJ所购买的纯标准品(染料木苷、染料木黄酮、异黄酮苷和黄豆苷原)完成定量。计算上述化合物的每个响应因子(总面积/浓度)，并用于计算未知样品的数量。对于缀合形式没有纯标准品可供使用，假定响应因子为母体分子的响应因子，但分子量的差别已校正。glycitin的响应因子假定为已校正分子量差别的染料木苷的响应因子。
这种方法提供了每个个体异黄酮的数量。为方便起见，可以计算总染料木黄酮、总黄豆苷原以及总黄豆黄素，并且如果所有缀合形式转化为它们各自的非缀合形式，可以代表这些化合物的集合重量。这些总量也可以通过用酸水解转化缀合形式的方法直接测定。
当然，可以理解前述的仅是本发明优选的实施方案，在不背离附加的权利要求所提出的精神和范围的情况下可以进行各种变化和改变，这可以按照专利法的原则(包括等同物学说)解释。