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一种利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法.pdf

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文档编号：9075344

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1、(10)授权公告号 CN 102286600 B (45)授权公告日 2013.05.15 CN 102286600 B *CN102286600B* (21)申请号 201110225800.X (22)申请日 2011.08.08 C12P 39/00(2006.01) C12P 5/02(2006.01) C12P 7/10(2006.01) C12R 1/145(2006.01) C12R 1/01(2006.01) C12R 1/865(2006.01) (73)专利权人华南理工大学地址 510640 广东省广州市天河区五山路 381 号 (72)发明人朱明军李平 (74)专。

2、利代理机构广州粤高专利商标代理有限公司 44102 代理人何淑珍 CN 101423848 A,2009.05.06, 全文 . CN 101195836 A,2008.06.11, 全文 . CN 101280321 A,2008.10.08, 全文 . (54) 发明名称一种利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法 (57) 摘要本发明公开了一种利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法，包括两种嗜热厌氧菌和酵母种子液制备，发酵培养基制备及灭菌，嗜热发酵及氢气的收集和乙醇发酵等过程。集成发酵过程中，嗜热发酵 72-108 小时后，接种酵母继续发酵 12-24 小时，。

3、使发酵醪液酒精含量达到 7.12g/L 以上，发酵效率达到 75% 以上，终止发酵。本发明中的木薯渣是木薯淀粉工业中的废弃物，含有颗粒细小的淀粉和纤维素，具有较大的比表面积，有利于产酶微生物在不经过预处理的情况下直接水解和利用，不需外加酶水解即可用于乙醇和氢气的集成发酵，而且具有负成本的特点，可以变废为宝，解决木薯淀粉工业中的环境污染问题。 (51)Int.Cl. (56)对比文件审查员张蕾权利要求书 2 页说明书 8 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利权利要求书2页说明书8页 (10)授权公告号 CN 102286600 B。

4、 CN 102286600 B *CN102286600B* 1/2 页 2 1. 一种利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法，包括以下步骤：（1）两种嗜热厌氧菌种子液的制备：低温保存的两种嗜热厌氧菌Clostridium thermocellum和Thermoanaerobacterium aotearoense经西林瓶活化和血清瓶培养，分别制得在培养 1848 小时黄色物质明显及OD600 0.61.1 的两种种子液；两种种子液的培养基采用 MTC 培养基，分别以纤维素和木糖作为碳源；所述 MTC 培养基配方包括 A、 B、 C、 D 和 E 液， A、 B、 C。

5、、 D、 E 液 5 种成分按体积比 45 ： 2 ： 1 ： 1 ： 1 混合； A 液中Clostridium thermocellum 和 Thermoanaerobacterium aotearoense所需的碳源含量分别为 3 g/L 的纤维素和 5 g/L 的木糖； B 液中含有：柠檬酸三钾盐 50 g/L、一水柠檬酸 31.25 g/L、硫酸钠 25 g/L、磷酸二氢钾 25 g/L 和碳酸氢钠 62.5 g/L ； C 液中含有：氯化铵 75 g/L、尿素 250 g/L 和酵母抽提物 50 g/L ； D 液中含有：六水氯化镁 50 g/L、四水。

6、氯化亚铁 5 g/L、二水氯化钙 10 g/L 和一水半胱氨酸盐酸50 g/L ； E液中含有：二盐酸吡哆胺1 g/L、对氨基苯甲酸0.2 g/L、 D-生物素 0.1 g/L、维生素 B12 0.1 g/L 和维生素 B1 0.2 g/L ；（2）发酵培养基的制备及灭菌：发酵培养基中添加 40120 g/L 的木薯渣为碳源，其他成份同 MTC 培养基；将装有发酵培养基的血清瓶用胶塞和铝盖密封，并重复抽真空和充氮气，最后在 115130下灭菌 2040 分钟；（3）嗜热发酵及氢气的收集：将制备好的嗜热菌种子液以 5%15% 的接种量注射入灭菌后的。

7、发酵培养基中，发酵温度为 5060 ，摇床转速为 100300 rpm，发酵 72108 小时后，收集血清瓶上部的氢气；（4）乙醇发酵：嗜热发酵结束后，将酵母种子液以 5%15% 的接种量接种至嗜热发酵后的醪液中，继续厌氧酒精发酵，发酵温度为 3037，发酵 1224 小时后终止发酵；所述酵母种子液由如下方法获得：将低温保存的Saccharomyces cerevisiae经试管斜面、摇瓶逐级放大，制得细胞数大于 1108个 /mL 的酵母种子液；其中种子培养基采用 YPD 培养基。 2. 根据权利要求 1 所述的利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气。

8、的方法，其特征在于所述 YPD 培养基配方为：酵母粉 10 g/L, 蛋白胨 10 g/L，葡萄糖 20 g/L ；斜面时添加 15 g/L 琼脂；该培养基初始 pH 为 4.07.0。 3. 根据权利要求 1 所述的利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法，其特征在于所述低温均为 -20， -80 或者 -196 。 4. 根据权利要求 1 所述的利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法，其特征在于步骤（1）所述 MTC 培养基配方包括 A、 B、 C、 D 和 E 液， A 液为菌体生长所需的碳源，Clostridium thermocellum和Thermoana。

9、erobacterium aotearoense所需碳源分别为纤维素和木糖； B 液包括柠檬酸三钾盐、一水柠檬酸、硫酸钠、磷酸二氢钾和碳酸氢钠； C 液包括：氯化铵、尿素和酵母抽提物； D 液包括：六水氯化镁、四水氯化亚铁和二水氯化钙、一水半胱氨酸盐酸； E 液包括：二盐酸吡哆胺、对氨基苯甲酸、 D- 生物素和维生素。 5. 根据权利要求 1 所述的利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法，其特征在于步骤（2）所述的发酵培养基为稍作改变的 MTC 培养基，培养基主要成份为 A、 B、 C、 D、 E 液， 5 种成分按体积比 45 ： 2 ： 1 。

10、： 1 ： 1 混合； A 液为菌体生长所需的碳源，即 40-120 g/L 的木薯渣； B 液中含有：柠檬酸三钾盐50 g/L、一水柠檬酸31.25 g/L、硫酸钠25 g/L、磷酸二氢钾25 g/ L 和碳酸氢钠 62.5 g/L ； C 液中含有：氯化铵 75 g/L、尿素 250 g/L 和酵母抽提物 50 g/L ； D 液中含有：六水氯化镁 50 g/L、四水氯化亚铁 5 g/L、二水氯化钙 10 g/L 和一水半胱氨酸权利要求书 CN 102286600 B 2/2 页 3 盐酸 50 g/L ； E 液中含有：二盐酸吡哆胺 1 g/L。

11、、对氨基苯甲酸 0.2 g/L、 D- 生物素 0.1 g/ L、维生素 B12 0.1 g/L 和维生素 B1 0.2 g/L。 6. 根据权利要求 1 所述的利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法，其特征在于步骤（2）所述的重复抽真空和充氮气为抽真空和充 0.010.04MPa 的氮气 3 次。权利要求书 CN 102286600 B 1/8 页 4 一种利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法技术领域 0001 本发明涉及微生物发酵生产领域，尤其涉及一种以木薯淀粉工业的废弃物木薯渣为原料，利用两种嗜热菌共培养产氢气及水解原料，再利用酵母快速发酵生产酒精的方。

12、法。背景技术 0002 化石能源的逐渐枯竭要求我们开发可替代的持续性清洁新能源，近年来氢气和燃料酒精的生产量也不断增加。利用各种生物质和工农业废料为原料被认为是降低新能源成本并代替传统能源的有效途径。然而，目前大部分能源酒精都是以玉米淀粉或糖类农作物为原料生产的，因此导致了粮食的紧张和价格的上升，而且原料成本非常高，阻碍了新能源产业的发展。国家政策规划要求不与人争粮，解决成本和政策上的巨大挑战最有希望的途径就是利用低品位生物质生产燃料酒精和氢气。 0003 原材料和酶的成本在燃料酒精和氢气生产中占有较大比重，在目前纤维素乙醇和氢气生产还无法产业化的背景下，以工业。

13、废料木薯渣为原料进行直接发酵，降低原料成本并省去酶的费用对于生产能源酒精和氢气具有重要意义。本发明开发了一种以木薯渣为原料，以嗜热厌氧菌Clostridium thermocellum和Thermoanaerobacterium aotearoense以及酒精酵母Saccharomyces cerevisiae为发酵菌种的同时产乙醇和氢气的集成生物系统，不需要进行原材料的预处理和酶的添加。发明内容 0004 本发明的目的在于克服现有技术存在的上述不足，提供一种利用木薯渣发酵生产能源酒精和氢气的方法，该方法以木薯渣为原料不仅省去了燃料酒精和氢气生产过程中的原材料及预处理以及。

14、酶的费用，具有经济可行性，而且可以变废为宝，解决木薯淀粉工业的环境污染问题。本发明通过如下技术方案实现。 0005 一种利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法，包括以下步骤： 0006 （1）两种嗜热厌氧菌种子液的制备：低温保存的两种嗜热厌氧菌Clostridium thermocellum和Thermoanaerobacterium aotearoense经西林瓶活化和血清瓶培养，分别制得在培养 1848 小时黄色物质明显及OD600 0.61.1 的两种种子液；两种种子液的培养基采用 MTC 培养基，分别以纤维素和木糖作为碳源； 0007 （2）发酵培养基的。

15、制备及灭菌：发酵培养基中添加 40120 g/L 的木薯渣为碳源，其他成份同 MTC 培养基；将装有发酵培养基的血清瓶用胶塞和铝盖密封，并重复抽真空和充氮气，最后在 115130下灭菌 2040 分钟； 0008 （3）嗜热发酵及氢气的收集：将制备好的嗜热菌种子液以 5%15% 的接种量注射入灭菌后的发酵培养基中，发酵温度为5060 ，摇床转速为100300 rpm，发酵72108小时后，收集血清瓶上部的氢气； 0009 （4）乙醇发酵：嗜热发酵结束后，将酵母种子液以 5%15% 的接种量接种至嗜热发说明书 CN 102286600 B 2/。

16、8 页 5 酵后的醪液中，继续厌氧酒精发酵，发酵温度为 3037，发酵 1224 小时后终止发酵。 0010 上述利用木薯渣发酵生产乙醇和氢气的方法中，步骤（4）所述酵母种子液由如下方法获得：将低温保存的酒精酵母经试管斜面、摇瓶逐级放大，制得细胞数大于 1108个 / mL 的酵母种子液；其中种子培养基采用YPD培养基，组成为：酵母粉10 g/L, 蛋白胨10 g/ L，葡萄糖 20 g/L，斜面时添加 15 g/L 琼脂，该培养基初始 pH 为 4.07.0。 0011 上述利用木薯渣发酵生产乙醇和氢气的方法中，步骤（1）所述低温均为 -20， -。

17、80 或者 -196 。 0012 上述利用木薯渣发酵生产乙醇和氢气的方法中，步骤（1）所述 MTC 培养基配方包括 A、 B、 C、 D 和 E 液， A 液为菌体生长所需的碳源，Clostridium thermocellum和 Thermoanaerobacterium aotearoense所需碳源分别为纤维素和木糖； B 液包括柠檬酸三钾盐、一水柠檬酸、硫酸钠、磷酸二氢钾和碳酸氢钠； C 液包括：氯化铵、尿素和酵母抽提物； D 液包括：六水氯化镁、四水氯化亚铁和二水氯化钙、一水半胱氨酸盐酸； E 液包括：二盐酸吡哆胺、对氨基苯甲酸、 D- 。

18、生物素、维生素和维生素。 0013 上述利用木薯渣发酵生产乙醇和氢气的方法中，步骤（1）所述 MTC 培养基配方中， A、 B、 C、 D、 E 液 5 种成分按体积比 45 ： 2 ： 1 ： 1 ： 1 混合； A 液中Clostridium thermocellum 和 Thermoanaerobacterium aotearoense所需的碳源含量分别为 3 g/L 的纤维素和 5 g/L 的木糖； B 液中含有：柠檬酸三钾盐 50 g/L、一水柠檬酸 31.25 g/L、硫酸钠 25 g/L、磷酸二氢钾 25 g/L 和碳酸氢钠 62.5 g/L ； C 液。

19、中含有：氯化铵 75 g/L、尿素 250 g/L 和酵母抽提物 50 g/L ； D 液中含有：六水氯化镁 50 g/L、四水氯化亚铁 5 g/L、二水氯化钙 10 g/L 和一水半胱氨酸盐酸50 g/L ； E液中含有：二盐酸吡哆胺1 g/L、对氨基苯甲酸0.2 g/L、 D-生物素 0.1 g/L、维生素 B12 0.1 g/L 和维生素 B1 0.2 g/L。 0014 上述利用木薯渣发酵生产乙醇和氢气的方法中，步骤（2）所述的发酵培养基为稍作改变的 MTC 培养基，培养基主要成份为 A、 B、 C、 D、 E 液， 5 种成分按体积比 45 ： 2 。

20、： 1 ： 1 ： 1 混合； A液为菌体生长所需的碳源，即40-120 g/L的木薯渣； B液中含有：柠檬酸三钾盐50 g/ L、一水柠檬酸31.25 g/L、硫酸钠25 g/L、磷酸二氢钾25 g/L和碳酸氢钠62.5 g/L ； C液中含有：氯化铵 75 g/L、尿素 250 g/L 和酵母抽提物 50 g/L ； D 液中含有：六水氯化镁 50 g/ L、四水氯化亚铁5 g/L、二水氯化钙10 g/L和一水半胱氨酸盐酸50 g/L ； E液中含有：二盐酸吡哆胺 1 g/L、对氨基苯甲酸 0.2 g/L、 D- 生物素 0.1 g/L、维生素。

21、B12 0.1 g/L 和维生素 B1 0.2 g/L。 0015 上述利用木薯渣发酵生产乙醇和氢气的方法中，步骤（2）所述的重复抽真空和充氮气为抽真空和充 0.010.04MPa 的氮气 3 次。 0016 上述利用木薯渣发酵生产乙醇和氢气的方法中，步骤（4）所述的酒精酵母是 Saccharomyces cerevisiae。 0017 本发明中的木薯渣是木薯淀粉工业中的废弃物，含有颗粒细小的淀粉和纤维素，具有较大的比表面积，有利于产酶微生物在不经过预处理的情况下直接利用和水解，不需外加酶水解即可用于能源酒精和氢气的集成发酵，而且具有负成本的特点。因此，以木薯渣发。

22、酵同时生产能源酒精和氢气不仅省去了淀粉和纤维素发酵生产酒精过程中原材料、预处理及酶的费用，具有经济可行性，而且可以变废为宝，解决木薯淀粉工业中的环境污染问题，具有极大的示范和推广价值。说明书 CN 102286600 B 3/8 页 6 0018 本发明所述的方法具有以下优点： 0019 1. 发酵所用的原料是木薯淀粉工业中的废弃物木薯渣，含有颗粒细小的淀粉、纤维素，具有较大的比表面积，有利于产酶微生物在不经过预处理的情况下直接利用和水解，而且具有负成本的特点。 0020 2. 木薯渣在不经过预处理和不外加酶的情况下即可被直接转化成氢气和可发酵性糖，进而。

23、转化为乙醇，可以有效降低生产成本。 0021 3. 采用集成生物系统方法，在发酵过程中将能源酒精和氢气的生产结合起来，工艺非常简单，可以有效降低投资费用和生产成本。具体实施方式 0022 下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式作进一步说明。 0023 实施例 1 0024 利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法，具体过程如下： 0025 （1）嗜热厌氧菌种子液的制备：将 -80保存的Clostridium thermocellum经 10mL 西林瓶活化和 100mL 血清瓶放大，培养 18 小时制得OD600 0.6 的种子液；其中培养基采用 MTC 培养基，。

24、培养基主要成份为 A、 B、 C、 D、 E 液， 5 种成分按 45 ： 2 ： 1 ： 1 ： 1 ( V/V ) 用无菌注射器混合。A 液为 3 g/L 的纤维素。B 液：柠檬酸三钾盐 50 g/L、一水柠檬酸 31.25 g/L、硫酸钠25 g/L、磷酸二氢钾25 g/L、碳酸氢钠62.5 g/L ； C液：氯化铵75 g/L、尿素250 g/L、酵母抽提物50 g/L ； D液：六水氯化镁50 g/L、四水氯化亚铁5 g/L、二水氯化钙10 g/ L、一水半胱氨酸盐酸50 g/L ； E液：二盐酸吡哆胺1 g/L、对氨基苯甲酸0.2 g/L、 D。

25、-生物素 0.1 g/L、维生素 B12 0.1 g/L、维生素 B1 0.2 g/L。 0026 （2）发酵培养基的制备及灭菌：发酵培养基中添加 40 g/L 的木薯渣为碳源，其他成份同 MTC 培养基；将装有发酵培养基的血清瓶用胶塞和铝盖密封并重复抽真空和充 0.01MPa 的氮气 3 次，最后在 115 下灭菌 40 分钟； 0027 （3）嗜热发酵及氢气的收集：将制备好的Clostridium thermocellum种子液以 10% 的接种量注射入灭菌后的发酵培养基中，厌氧嗜热发酵，发酵温度为 55，摇床转速为 150rpm，发酵 72 小时后，。

26、收集血清瓶上部的氢气，氢气含量达到 2.71mmol。 0028 （4） -80保存的酒精酵母Saccharomyces Cerevisiae经试管斜面、摇瓶逐级放大，制得细胞数达到 108个 /mL 的酵母醪液。其中培养基采用 YPD 培养基，即酵母粉 10 g/ L, 蛋白胨 10 g/L，葡萄糖 20 g/L ；斜面时添加 15 g/L 琼脂；培养基初始 pH 为 4.0 ； 0029 （5）乙醇发酵：嗜热发酵结束后，将制备好的酵母种子液以 10% 的接种量接种至经嗜热发酵的培养液中，继续厌氧乙醇发酵，发酵温度为 30，发酵 12 小时终止发酵，酒精含。

27、量达到 7.12 g/L。 0030 实施例 2 0031 利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法，具体过程如下： 0032 （1）嗜热厌氧菌种子液的制备：将 -20 保存的Thermoanaerobacterium aotearoense经 10mL 西林瓶活化和 100mL 血清瓶放大，培养 24 小时制得OD600 0.8 的种子液；其中培养基采用 MTC 培养基，培养基主要成份为 A、 B、 C、 D、 E 液， 5 种成分按 45 ： 2 ： 1 ： 1 ： 1 ( V/V ) 用无菌注射器混合。A 液为 5 g/L 的木糖。B 液：柠。

28、檬酸三钾盐 50 g/L、一水柠说明书 CN 102286600 B 4/8 页 7 檬酸 31.25 g/L、硫酸钠 25 g/L、磷酸二氢钾 25 g/L、碳酸氢钠 62.5 g/L ； C 液：氯化铵 75 g/L、尿素 250 g/L、酵母抽提物 50 g/L ； D 液：六水氯化镁 50 g/L、四水氯化亚铁 5 g/L、二水氯化钙10 g/L、一水半胱氨酸盐酸50 g/L ； E液：二盐酸吡哆胺1 g/L、对氨基苯甲酸0.2 g/L、 D- 生物素 0.1 g/L、维生素 B12 0.1 g/L、维生素 B1 0.2 g/L。 0033 。

29、（2）发酵培养基的制备及灭菌：发酵培养基中添加 40 g/L 的木薯渣为碳源，其他成份同 MTC 培养基；将装有发酵培养基的血清瓶用胶塞和铝盖密封并重复抽真空和充 0.02MPa 的氮气 3 次，最后在 121下灭菌 30 分钟； 0034 （3）嗜热发酵及氢气的收集：将制备好的Thermoanaerobacterium aotearoense 种子液以 5% 的接种量注射入灭菌后的发酵培养基中，厌氧嗜热发酵，发酵温度为 50，摇床转速为 100rpm，发酵 96 小时后，收集血清瓶上部的氢气，氢气含量达到 2.01mmol。 0035 （4） -20保存。

30、的酒精酵母Saccharomyces Cerevisiae经试管斜面、摇瓶逐级放大，制得细胞数达到 108个 /mL 的酵母醪液。其中培养基采用 YPD 培养基，即酵母粉 10 g/ L, 蛋白胨 10 g/L，葡萄糖 20 g/L ；斜面时添加 15 g/L 琼脂；培养基初始 pH 为 7.0 ； 0036 （5）乙醇发酵：嗜热发酵结束后，将制备好的酵母种子液以 15% 的接种量接种至嗜热发酵培养液中，继续厌氧乙醇发酵，发酵温度为 33，发酵 24 小时后终止发酵，酒精含量达到 7.96 g/L。 0037 实施例 3 0038 利用木薯渣同时发酵生产乙醇。

31、和氢气的方法，具体过程如下： 0039 （1）嗜热厌氧菌种子液的制备：将 -196保存的Clostridium thermocellum和 Thermoanaerobacterium aotearoense经 10mL 西林瓶活化和 100mL 血清瓶放大，分别制得在培养 48 小时黄色物质明显的Clostridium thermocellum种子液以及OD600 1.1 的 Thermoanaerobacterium aotearoense种子液；其中培养基采用 MTC 培养基，培养基主要成份为A、 B、 C、 D、 E液， 5种成分按45 ： 2 ： 1 ： 1 ：。

32、1 ( V/V )用无菌注射器混合。菌种Clostridium thermocellum和Thermoanaerobacterium aotearoense的 A 液分别为 3 g/L 的纤维素或 5 g/L 的木糖。B 液：柠檬酸三钾盐 50 g/L、一水柠檬酸 31.25 g/L、硫酸钠 25 g/L、磷酸二氢钾 25 g/L、碳酸氢钠 62.5 g/L ； C 液：氯化铵 75 g/L、尿素 250 g/L、酵母抽提物 50 g/L ； D 液：六水氯化镁 50 g/L、四水氯化亚铁 5 g/L、二水氯化钙 10 g/L、一水半胱氨酸盐酸 50 g/L 。

33、； E 液：二盐酸吡哆胺 1 g/L、对氨基苯甲酸 0.2 g/L、 D- 生物素 0.1 g/L、维生素 B12 0.1 g/L、维生素 B1 0.2 g/L。 0040 （2）发酵培养基的制备及灭菌：发酵培养基中添加 40 g/L 的木薯渣为碳源，其他成份同 MTC 培养基；将装有发酵培养基的血清瓶用胶塞和铝盖密封并重复抽真空和充 0.04MPa 的氮气 3 次，最后在 130下灭菌 20 分钟； 0041 （3）嗜热发酵及氢气的收集：将制备好的Clostridium thermocellum和 Thermoanaerobacter。

34、ium aotearoense种子液以1:1的比例， 15%的总接种量注射入至灭菌后的发酵培养基中，厌氧嗜热发酵，发酵温度为 60，摇床转速为 200rpm，发酵 96 小时后，收集血清瓶上部的氢气，氢气含量达到 4.55mmol。 0042 （4） -196保存的酒精酵母Saccharomyces Cerevisiae经试管斜面、摇瓶逐级放大，制得细胞数达到 108个 /mL 的酵母醪液。其中培养基采用 YPD 培养基，即酵母粉 10 g/ L, 蛋白胨 10 g/L，葡萄糖 20 g/L ；斜面时添加 15 g/L 琼脂；培养基初始 pH 为 5.0 ；说。

35、明书 CN 102286600 B 5/8 页 8 0043 （5）乙醇发酵：嗜热发酵结束后，将制备好的酵母种子液以 5% 的接种量接种至嗜热发酵培养液中，继续厌氧乙醇发酵，发酵温度为 37，发酵 20 小时后终止发酵，酒精含量达到 8.93 g/L。 0044 实施例 4 0045 利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法，具体过程如下： 0046 （1）嗜热厌氧菌种子液的制备：将 -80保存的Clostridium thermocellum和 Thermoanaerobacterium aotearoense经 10mL 西林瓶活化和 100mL 血清瓶放大，。

36、分别制得在培养 36 小时黄色物质明显的Clostridium thermocellum种子液以及OD600 1.0 的 Thermoanaerobacterium aotearoense种子液；其中培养基采用 MTC 培养基，培养基主要成份为A、 B、 C、 D、 E液， 5种成分按45 ： 2 ： 1 ： 1 ： 1 ( V/V )用无菌注射器混合。菌种Clostridium thermocellum和Thermoanaerobacterium aotearoense的 A 液分别为 3 g/L 的纤维素或 5 g/L 的木糖。B 液：柠檬酸三钾盐 50 g/L、一水柠檬。

37、酸 31.25 g/L、硫酸钠 25 g/L、磷酸二氢钾 25 g/L、碳酸氢钠 62.5 g/L ； C 液：氯化铵 75 g/L、尿素 250 g/L、酵母抽提物 50 g/L ； D 液：六水氯化镁 50 g/L、四水氯化亚铁 5 g/L、二水氯化钙 10 g/L、一水半胱氨酸盐酸 50 g/L ； E 液：二盐酸吡哆胺 1 g/L、对氨基苯甲酸 0.2 g/L、 D- 生物素 0.1 g/L、维生素 B12 0.1 g/L、维生素 B1 0.2 g/L。 0047 （2）发酵培养基的制备及灭菌：发酵培养基中添加 40 g/L 的木薯渣为碳源，。

38、其他成份同 MTC 培养基；将装有发酵培养基的血清瓶用胶塞和铝盖密封并重复抽真空和充 0.04MPa 的氮气的过程 3 次，最后在 121下灭菌 30 分钟； 0048 （3）嗜热发酵及氢气的收集：将制备好的Clostridium thermocellum和 Thermoanaerobacterium aotearoense种子液以1:2的比例， 10%的总接种量注射入至灭菌后的发酵培养基中，厌氧嗜热发酵，发酵温度为 55，摇床转速为 250rpm，发酵 84 小时后，收集血清瓶上部的氢气，氢气含量达到 4.35mmol。 0049 （4）。

39、 -80保存的酒精酵母Saccharomyces Cerevisiae经试管斜面、摇瓶逐级放大，制得细胞数达到 108个 /mL 的酵母醪液。其中培养基采用 YPD 培养基，即酵母粉 10 g/ L, 蛋白胨 10 g/L，葡萄糖 20 g/L ；斜面时添加 15 g/L 琼脂；培养基初始 pH 为 5.5 ； 0050 （5）乙醇发酵：嗜热发酵结束后，将制备好的酵母种子液以 10% 的接种量接种至嗜热发酵培养液中，继续厌氧乙醇发酵，发酵温度为 37，发酵 24 小时后终止发酵，酒精含量达到 8.80 g/L。 0051 实施例 5 0052 利用木薯渣同时。

40、发酵生产乙醇和氢气的方法，具体过程如下： 0053 （1）嗜热厌氧菌种子液的制备：将 -80保存的Clostridium thermocellum和 Thermoanaerobacterium aotearoense经 10mL 西林瓶活化和 100mL 血清瓶放大，分别制得在培养 24 小时黄色物质明显的Clostridium thermocellum种子液以及OD600 0.8 的 Thermoanaerobacterium aotearoense种子液；其中培养基采用 MTC 培养基，培养基主要成份为A、 B、 C、 D、 E液， 5种成分按45 ： 2 ： 1 ：。

41、1 ： 1 ( V/V )用无菌注射器混合。菌种Clostridium thermocellum和Thermoanaerobacterium aotearoense的 A 液分别为 3 g/L 的纤维素或 5 g/L 的木糖。B 液：柠檬酸三钾盐 50 g/L、一水柠檬酸 31.25 g/L、硫酸钠 25 g/L、磷酸二氢钾 25 g/L、碳酸氢钠 62.5 g/L ； C 液：氯化铵 75 g/L、尿素 250 g/L、酵母抽提物 50 g/L ；说明书 CN 102286600 B 6/8 页 9 D 液：六水氯化镁 50 g/L、四水氯化亚铁 5 g/。

42、L、二水氯化钙 10 g/L、一水半胱氨酸盐酸 50 g/L ； E 液：二盐酸吡哆胺 1 g/L、对氨基苯甲酸 0.2 g/L、 D- 生物素 0.1 g/L、维生素 B12 0.1 g/L、维生素 B1 0.2 g/L。 0054 （2）发酵培养基的制备及灭菌：发酵培养基中添加 40 g/L 的木薯渣为碳源，其他成份同 MTC 培养基；将装有发酵培养基的血清瓶用胶塞和铝盖密封并重复抽真空和充 0.04MPa 的氮气 3 次，最后在 121下灭菌 30 分钟； 0055 （3）嗜热发酵及氢气的收集：将制备好的Clostridium。

43、 thermocellum和 Thermoanaerobacterium aotearoense种子液以1:4的比例， 10%的总接种量注射入至灭菌后的发酵培养基中，厌氧嗜热发酵，发酵温度为 55，摇床转速为 150rpm，发酵 72 小时后，收集血清瓶上部的氢气，氢气含量达到 4.47mmol。 0056 （4） -80保存的酒精酵母Saccharomyces Cerevisiae经试管斜面、摇瓶逐级放大，制得细胞数达到 108个 /mL 的酵母醪液。其中培养基采用 YPD 培养基，即酵母粉 10 g/ L, 蛋白胨 10 g/L，葡萄糖 20 g/L ；斜面时添加。

44、 15 g/L 琼脂；培养基初始 pH 为 5.5 ； 0057 （5）乙醇发酵：嗜热发酵结束后，将制备好的酵母种子液以 10% 的接种量接种至嗜热发酵液中，继续厌氧酒精发酵，发酵温度为 37，发酵 24 小时后终止发酵，酒精含量达到 9.14 g/L。 0058 实施例 6 0059 利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法，具体过程如下： 0060 （1）嗜热厌氧菌种子液的制备：将 -80保存的Clostridium thermocellum和 Thermoanaerobacterium aotearoense经 10mL 西林瓶活化和 100mL 血清瓶放大，。

45、分别制得在培养 24 小时黄色物质明显的Clostridium thermocellum种子液以及OD600 0.8 的 Thermoanaerobacterium aotearoense种子液；其中培养基采用 MTC 培养基，培养基主要成份为A、 B、 C、 D、 E液， 5种成分按45 ： 2 ： 1 ： 1 ： 1 ( V/V )用无菌注射器混合。菌种Clostridium thermocellum和Thermoanaerobacterium aotearoense的 A 液分别为 3 g/L 的纤维素或 5 g/L 的木糖。B 液：柠檬酸三钾盐 50 g/L、一水柠。

46、檬酸 31.25 g/L、硫酸钠 25 g/L、磷酸二氢钾 25 g/L、碳酸氢钠 62.5 g/L ； C 液：氯化铵 75 g/L、尿素 250 g/L、酵母抽提物 50 g/L ； D 液：六水氯化镁 50 g/L、四水氯化亚铁 5 g/L、二水氯化钙 10 g/L、一水半胱氨酸盐酸 50 g/L ； E 液：二盐酸吡哆胺 1 g/L、对氨基苯甲酸 0.2 g/L、 D- 生物素 0.1 g/L、维生素 B12 0.1 g/L、维生素 B1 0.2 g/L。 0061 （2）发酵培养基的制备及灭菌：发酵培养基中添加 60 g/L 的木薯渣为碳源，。

47、其他成份同 MTC 培养基；将装有发酵培养基的血清瓶用胶塞和铝盖密封并重复抽真空和充 0.04MPa 的氮气 3 次，最后在 121下灭菌 30 分钟； 0062 （3）嗜热发酵及氢气的收集：将制备好的Clostridium thermocellum和 Thermoanaerobacterium aotearoense种子液以1:9的比例， 10%的总接种量注射入至灭菌后的发酵培养基中，厌氧嗜热发酵，发酵温度为 55，摇床转速为 150rpm，发酵 84 小时后，收集血清瓶上部的氢气，氢气含量达到 4.53mmol。 0063 （4） -。

48、80保存的酒精酵母Saccharomyces Cerevisiae经试管斜面、摇瓶逐级放大，制得细胞数达到 108个 /mL 的酵母醪液。其中培养基采用 YPD 培养基，即酵母粉 10 g/ L, 蛋白胨 10 g/L，葡萄糖 20 g/L ；斜面时添加 15 g/L 琼脂；培养基初始 pH 为 5.5 ；说明书 CN 102286600 B 7/8 页 10 0064 （5）乙醇发酵：嗜热发酵结束后，将制备好的酵母种子液以 10% 的接种量接种至嗜热发酵培养液中，继续厌氧乙醇发酵，发酵温度为 37，发酵 24 小时后终止发酵，酒精含量达到 10.26。

49、 g/L。 0065 实施例 7 0066 利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法，具体过程如下： 0067 （1）嗜热厌氧菌种子液的制备：将 -80保存的Clostridium thermocellum和 Thermoanaerobacterium aotearoense经 10mL 西林瓶活化和 100mL 血清瓶放大，分别制得在培养 24 小时黄色物质明显的Clostridium thermocellum种子液以及OD600 1.0 的 Thermoanaerobacterium aotearoense种子液；其中培养基采用 MTC 培养基，培养基主要成份为A、 B、 C、 D、 E液， 5种成分按45 ： 2 ： 1 ： 1 ： 1 ( V/V )用无菌注射器混合。菌种Clostridium thermocellum和Thermoanaerobacterium aotearoense的 A 液分别为 3 g/L 的纤维素或 5 g/L 的木糖。B 液：柠檬酸三钾盐 50 g/L、一水柠檬酸 31.25 g/L、硫酸钠 25 g/L、磷酸二氢钾 25 g/L、碳酸氢钠 62.5 g/L ； C 液：氯化铵 75 g/L、尿素 250 g/L、酵母抽提物 50 g/L ； D 液：六水氯化镁 50 g/L、。

摘要
申请专利号：	CN201110225800.X	申请日：	20110808
公开号：	CN102286600B	公开日：	20130515
当前法律状态：		有效性：	有效
法律详情：
IPC分类号：	C12P39/00,C12P5/02,C12P7/10,C12R1/145,C12R1/01,C12R1/865	主分类号：	C12P39/00,C12P5/02,C12P7/10,C12R1/145,C12R1/01,C12R1/865
申请人：	华南理工大学
发明人：	朱明军,李平
地址：	510640 广东省广州市天河区五山路381号
优先权：	CN201110225800A
专利代理机构：	广州粤高专利商标代理有限公司	代理人：	何淑珍
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内容摘要

本发明公开了一种利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法，包括两种嗜热厌氧菌和酵母种子液制备，发酵培养基制备及灭菌，嗜热发酵及氢气的收集和乙醇发酵等过程。集成发酵过程中，嗜热发酵72-108小时后，接种酵母继续发酵12-24小时，使发酵醪液酒精含量达到7.12g/L以上，发酵效率达到75%以上，终止发酵。本发明中的木薯渣是木薯淀粉工业中的废弃物，含有颗粒细小的淀粉和纤维素，具有较大的比表面积，有利于产酶微生物在不经过预处理的情况下直接水解和利用，不需外加酶水解即可用于乙醇和氢气的集成发酵，而且具有负成本的特点，可以变废为宝，解决木薯淀粉工业中的环境污染问题。

权利要求书

1.一种利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法，包括以下步骤：（1）两种嗜热厌氧菌种子液的制备：低温保存的两种嗜热厌氧菌和经西林瓶活化和血清瓶培养，分别制得在培养18~48小时黄色物质明显及0.6~1.1的两种种子液；两种种子液的培养基采用MTC培养基，分别以纤维素和木糖作为碳源；所述MTC培养基配方包括A、B、C、D和E液，A、B、C、D、E液5种成分按体积比45：2：1：1：1混合；A液中所需的碳源含量分别为3 g/L的纤维素和5 g/L的木糖；B液中含有：柠檬酸三钾盐50 g/L、一水柠檬酸31.25 g/L、硫酸钠25 g/L、磷酸二氢钾25 g/L和碳酸氢钠62.5 g/L；C液中含有：氯化铵75 g/L、尿素250 g/L和酵母抽提物50 g/L；D液中含有：六水氯化镁50 g/L、四水氯化亚铁5 g/L、二水氯化钙10 g/L和一水半胱氨酸盐酸50 g/L；E液中含有：二盐酸吡哆胺1 g/L、对氨基苯甲酸0.2 g/L、D-生物素0.1 g/L、维生素B 0.1 g/L和维生素B 0.2 g/L；（2）发酵培养基的制备及灭菌：发酵培养基中添加40~120 g/L的木薯渣为碳源，其他成份同MTC培养基；将装有发酵培养基的血清瓶用胶塞和铝盖密封，并重复抽真空和充氮气，最后在115~130℃下灭菌20~40分钟；（3）嗜热发酵及氢气的收集：将制备好的嗜热菌种子液以5%~15%的接种量注射入灭菌后的发酵培养基中，发酵温度为50~60 ℃，摇床转速为100~300 rpm，发酵72~108小时后，收集血清瓶上部的氢气；（4）乙醇发酵：嗜热发酵结束后，将酵母种子液以5%~15%的接种量接种至嗜热发酵后的醪液中，继续厌氧酒精发酵，发酵温度为30~37℃，发酵12~24小时后终止发酵；所述酵母种子液由如下方法获得：将低温保存的经试管斜面、摇瓶逐级放大，制得细胞数大于1×10个/mL 的酵母种子液；其中种子培养基采用YPD培养基。 2.根据权利要求1所述的利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法，其特征在于所述YPD培养基配方为：酵母粉10 g/L, 蛋白胨10 g/L，葡萄糖20 g/L；斜面时添加15 g/L琼脂；该培养基初始pH为4.0~7.0。 3.根据权利要求1所述的利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法，其特征在于所述低温均为-20，-80或者-196 ℃。 4.根据权利要求1所述的利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法，其特征在于步骤（1）所述MTC培养基配方包括A、B、C、D和E液，A液为菌体生长所需的碳源，和所需碳源分别为纤维素和木糖；B液包括柠檬酸三钾盐、一水柠檬酸、硫酸钠、磷酸二氢钾和碳酸氢钠；C液包括：氯化铵、尿素和酵母抽提物；D液包括：六水氯化镁、四水氯化亚铁和二水氯化钙、一水半胱氨酸盐酸；E液包括：二盐酸吡哆胺、对氨基苯甲酸、D-生物素和维生素。 5.根据权利要求1所述的利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法，其特征在于步骤（2）所述的发酵培养基为稍作改变的MTC培养基，培养基主要成份为A、B、C、D、E液，5种成分按体积比45：2：1：1：1混合；A液为菌体生长所需的碳源，即40-120 g/L的木薯渣；B液中含有：柠檬酸三钾盐50 g/L、一水柠檬酸31.25 g/L、硫酸钠25 g/L、磷酸二氢钾25 g/L和碳酸氢钠62.5 g/L；C液中含有：氯化铵75 g/L、尿素250 g/L和酵母抽提物50 g/L；D液中含有：六水氯化镁50 g/L、四水氯化亚铁5 g/L、二水氯化钙10 g/L和一水半胱氨酸盐酸50 g/L；E液中含有：二盐酸吡哆胺1 g/L、对氨基苯甲酸0.2 g/L、D-生物素0.1 g/L、维生素B 0.1 g/L和维生素B 0.2 g/L。 6.根据权利要求1所述的利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法，其特征在于步骤（2）所述的重复抽真空和充氮气为抽真空和充0.01~0.04MPa的氮气3次。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物发酵生产领域，尤其涉及一种以木薯淀粉工业的废弃物——木薯渣为原料，利用两种嗜热菌共培养产氢气及水解原料，再利用酵母快速发酵生产酒精的方法。

背景技术

化石能源的逐渐枯竭要求我们开发可替代的持续性清洁新能源，近年来氢气和燃料酒精的生产量也不断增加。利用各种生物质和工农业废料为原料被认为是降低新能源成本并代替传统能源的有效途径。然而，目前大部分能源酒精都是以玉米淀粉或糖类农作物为原料生产的，因此导致了粮食的紧张和价格的上升，而且原料成本非常高，阻碍了新能源产业的发展。国家政策规划要求不与人争粮，解决成本和政策上的巨大挑战最有希望的途径就是利用低品位生物质生产燃料酒精和氢气。

原材料和酶的成本在燃料酒精和氢气生产中占有较大比重，在目前纤维素乙醇和氢气生产还无法产业化的背景下，以工业废料——木薯渣为原料进行直接发酵，降低原料成本并省去酶的费用对于生产能源酒精和氢气具有重要意义。本发明开发了一种以木薯渣为原料，以嗜热厌氧菌Clostridium thermocellum和Thermoanaerobacterium aotearoense以及酒精酵母Saccharomyces cerevisiae为发酵菌种的同时产乙醇和氢气的集成生物系统，不需要进行原材料的预处理和酶的添加。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的上述不足，提供一种利用木薯渣发酵生产能源酒精和氢气的方法，该方法以木薯渣为原料不仅省去了燃料酒精和氢气生产过程中的原材料及预处理以及酶的费用，具有经济可行性，而且可以变废为宝，解决木薯淀粉工业的环境污染问题。本发明通过如下技术方案实现。

一种利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法，包括以下步骤：

（1）两种嗜热厌氧菌种子液的制备：低温保存的两种嗜热厌氧菌Clostridium thermocellum和Thermoanaerobacterium aotearoense经西林瓶活化和血清瓶培养，分别制得在培养18~48小时黄色物质明显及OD600 0.6~1.1的两种种子液；两种种子液的培养基采用MTC培养基，分别以纤维素和木糖作为碳源；

（2）发酵培养基的制备及灭菌：发酵培养基中添加40~120 g/L的木薯渣为碳源，其他成份同MTC培养基；将装有发酵培养基的血清瓶用胶塞和铝盖密封，并重复抽真空和充氮气，最后在115~130℃下灭菌20~40分钟；

（3）嗜热发酵及氢气的收集：将制备好的嗜热菌种子液以5%~15%的接种量注射入灭菌后的发酵培养基中，发酵温度为50~60 ℃，摇床转速为100~300 rpm，发酵72~108小时后，收集血清瓶上部的氢气；

（4）乙醇发酵：嗜热发酵结束后，将酵母种子液以5%~15%的接种量接种至嗜热发酵后的醪液中，继续厌氧酒精发酵，发酵温度为30~37℃，发酵12~24小时后终止发酵。

上述利用木薯渣发酵生产乙醇和氢气的方法中，步骤（4）所述酵母种子液由如下方法获得：将低温保存的酒精酵母经试管斜面、摇瓶逐级放大，制得细胞数大于1×108个/mL 的酵母种子液；其中种子培养基采用YPD培养基，组成为：酵母粉10 g/L, 蛋白胨10 g/L，葡萄糖20 g/L，斜面时添加15 g/L琼脂，该培养基初始pH为4.0~7.0。

上述利用木薯渣发酵生产乙醇和氢气的方法中，步骤（1）所述低温均为-20，-80或者-196 ℃。

上述利用木薯渣发酵生产乙醇和氢气的方法中，步骤（1）所述MTC培养基配方包括A、B、C、D和E液，A液为菌体生长所需的碳源，Clostridium thermocellum和Thermoanaerobacterium aotearoense所需碳源分别为纤维素和木糖；B液包括柠檬酸三钾盐、一水柠檬酸、硫酸钠、磷酸二氢钾和碳酸氢钠；C液包括：氯化铵、尿素和酵母抽提物；D液包括：六水氯化镁、四水氯化亚铁和二水氯化钙、一水半胱氨酸盐酸；E液包括：二盐酸吡哆胺、对氨基苯甲酸、D-生物素、维生素和维生素。

上述利用木薯渣发酵生产乙醇和氢气的方法中，步骤（1）所述MTC培养基配方中，A、B、C、D、E液5种成分按体积比45：2：1：1：1混合；A液中Clostridium thermocellum和Thermoanaerobacterium aotearoense所需的碳源含量分别为3 g/L的纤维素和5 g/L的木糖；B液中含有：柠檬酸三钾盐50 g/L、一水柠檬酸31.25 g/L、硫酸钠25 g/L、磷酸二氢钾25 g/L和碳酸氢钠62.5 g/L；C液中含有：氯化铵75 g/L、尿素250 g/L和酵母抽提物50 g/L；D液中含有：六水氯化镁50 g/L、四水氯化亚铁5 g/L、二水氯化钙10 g/L和一水半胱氨酸盐酸50 g/L；E液中含有：二盐酸吡哆胺1 g/L、对氨基苯甲酸0.2 g/L、D-生物素0.1 g/L、维生素B12 0.1 g/L和维生素B1 0.2 g/L。

上述利用木薯渣发酵生产乙醇和氢气的方法中，步骤（2）所述的发酵培养基为稍作改变的MTC培养基，培养基主要成份为A、B、C、D、E液，5种成分按体积比45：2：1：1：1混合；A液为菌体生长所需的碳源，即40-120 g/L的木薯渣；B液中含有：柠檬酸三钾盐50 g/L、一水柠檬酸31.25 g/L、硫酸钠25 g/L、磷酸二氢钾25 g/L和碳酸氢钠62.5 g/L；C液中含有：氯化铵75 g/L、尿素250 g/L和酵母抽提物50 g/L；D液中含有：六水氯化镁50 g/L、四水氯化亚铁5 g/L、二水氯化钙10 g/L和一水半胱氨酸盐酸50 g/L；E液中含有：二盐酸吡哆胺1 g/L、对氨基苯甲酸0.2 g/L、D-生物素0.1 g/L、维生素B12 0.1 g/L和维生素B1 0.2 g/L。

上述利用木薯渣发酵生产乙醇和氢气的方法中，步骤（2）所述的重复抽真空和充氮气为抽真空和充0.01~0.04MPa的氮气3次。

上述利用木薯渣发酵生产乙醇和氢气的方法中，步骤（4）所述的酒精酵母是Saccharomyces cerevisiae。

本发明中的木薯渣是木薯淀粉工业中的废弃物，含有颗粒细小的淀粉和纤维素，具有较大的比表面积，有利于产酶微生物在不经过预处理的情况下直接利用和水解，不需外加酶水解即可用于能源酒精和氢气的集成发酵，而且具有负成本的特点。因此，以木薯渣发酵同时生产能源酒精和氢气不仅省去了淀粉和纤维素发酵生产酒精过程中原材料、预处理及酶的费用，具有经济可行性，而且可以变废为宝，解决木薯淀粉工业中的环境污染问题，具有极大的示范和推广价值。

本发明所述的方法具有以下优点：

1. 发酵所用的原料是木薯淀粉工业中的废弃物——木薯渣，含有颗粒细小的淀粉、纤维素，具有较大的比表面积，有利于产酶微生物在不经过预处理的情况下直接利用和水解，而且具有负成本的特点。

2. 木薯渣在不经过预处理和不外加酶的情况下即可被直接转化成氢气和可发酵性糖，进而转化为乙醇，可以有效降低生产成本。

3. 采用集成生物系统方法，在发酵过程中将能源酒精和氢气的生产结合起来，工艺非常简单，可以有效降低投资费用和生产成本。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式作进一步说明。

实施例1

利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法，具体过程如下：

（1）嗜热厌氧菌种子液的制备：将-80℃保存的Clostridium thermocellum经10mL西林瓶活化和100mL血清瓶放大，培养18小时制得OD600 ~0.6的种子液；其中培养基采用MTC培养基，培养基主要成份为A、B、C、D、E液，5种成分按45：2：1：1：1 ( V/V )用无菌注射器混合。A液为3 g/L的纤维素。B液：柠檬酸三钾盐50 g/L、一水柠檬酸31.25 g/L、硫酸钠25 g/L、磷酸二氢钾25 g/L、碳酸氢钠62.5 g/L；C液：氯化铵75 g/L、尿素250 g/L、酵母抽提物50 g/L；D液：六水氯化镁50 g/L、四水氯化亚铁5 g/L、二水氯化钙10 g/L、一水半胱氨酸盐酸50 g/L；E液：二盐酸吡哆胺1 g/L、对氨基苯甲酸0.2 g/L、D-生物素0.1 g/L、维生素B12 0.1 g/L、维生素B1 0.2 g/L。

（2）发酵培养基的制备及灭菌：发酵培养基中添加40 g/L的木薯渣为碳源，其他成份同MTC培养基；将装有发酵培养基的血清瓶用胶塞和铝盖密封并重复抽真空和充0.01MPa的氮气3次，最后在115 ℃下灭菌40分钟；

（3）嗜热发酵及氢气的收集：将制备好的Clostridium thermocellum种子液以10%的接种量注射入灭菌后的发酵培养基中，厌氧嗜热发酵，发酵温度为55℃，摇床转速为150rpm，发酵72小时后，收集血清瓶上部的氢气，氢气含量达到2.71mmol。

（4）-80℃保存的酒精酵母Saccharomyces Cerevisiae经试管斜面、摇瓶逐级放大，制得细胞数达到108个/mL 的酵母醪液。其中培养基采用YPD培养基，即酵母粉10 g/L, 蛋白胨10 g/L，葡萄糖20 g/L；斜面时添加15 g/L琼脂；培养基初始pH为4.0；

（5）乙醇发酵：嗜热发酵结束后，将制备好的酵母种子液以10%的接种量接种至经嗜热发酵的培养液中，继续厌氧乙醇发酵，发酵温度为30℃，发酵12小时终止发酵，酒精含量达到7.12 g/L。

实施例2

利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法，具体过程如下：

（1）嗜热厌氧菌种子液的制备：将-20℃保存的Thermoanaerobacterium aotearoense经10mL西林瓶活化和100mL血清瓶放大，培养24小时制得OD600 ~0.8的种子液；其中培养基采用MTC培养基，培养基主要成份为A、B、C、D、E液，5种成分按45：2：1：1：1 ( V/V )用无菌注射器混合。A液为5 g/L的木糖。B液：柠檬酸三钾盐50 g/L、一水柠檬酸31.25 g/L、硫酸钠25 g/L、磷酸二氢钾25 g/L、碳酸氢钠62.5 g/L；C液：氯化铵75 g/L、尿素250 g/L、酵母抽提物50 g/L；D液：六水氯化镁50 g/L、四水氯化亚铁5 g/L、二水氯化钙10 g/L、一水半胱氨酸盐酸50 g/L；E液：二盐酸吡哆胺1 g/L、对氨基苯甲酸0.2 g/L、D-生物素0.1 g/L、维生素B12 0.1 g/L、维生素B1 0.2 g/L。

（2）发酵培养基的制备及灭菌：发酵培养基中添加40 g/L的木薯渣为碳源，其他成份同MTC培养基；将装有发酵培养基的血清瓶用胶塞和铝盖密封并重复抽真空和充0.02MPa的氮气3次，最后在121℃下灭菌30分钟；

（3）嗜热发酵及氢气的收集：将制备好的Thermoanaerobacterium aotearoense种子液以5%的接种量注射入灭菌后的发酵培养基中，厌氧嗜热发酵，发酵温度为50℃，摇床转速为100rpm，发酵96小时后，收集血清瓶上部的氢气，氢气含量达到2.01mmol。

（4）-20℃保存的酒精酵母Saccharomyces Cerevisiae经试管斜面、摇瓶逐级放大，制得细胞数达到108个/mL 的酵母醪液。其中培养基采用YPD培养基，即酵母粉10 g/L, 蛋白胨10 g/L，葡萄糖20 g/L；斜面时添加15 g/L琼脂；培养基初始pH为7.0；

（5）乙醇发酵：嗜热发酵结束后，将制备好的酵母种子液以15%的接种量接种至嗜热发酵培养液中，继续厌氧乙醇发酵，发酵温度为33℃，发酵24小时后终止发酵，酒精含量达到7.96 g/L。

实施例3

利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法，具体过程如下：

（1）嗜热厌氧菌种子液的制备：将-196℃保存的Clostridium thermocellum和Thermoanaerobacterium aotearoense经10mL西林瓶活化和100mL血清瓶放大，分别制得在培养48小时黄色物质明显的Clostridium thermocellum种子液以及OD600 ~1.1的Thermoanaerobacterium aotearoense种子液；其中培养基采用MTC培养基，培养基主要成份为A、B、C、D、E液，5种成分按45：2：1：1：1 ( V/V )用无菌注射器混合。菌种Clostridium thermocellum和Thermoanaerobacterium aotearoense的A液分别为3 g/L的纤维素或5 g/L的木糖。B液：柠檬酸三钾盐50 g/L、一水柠檬酸31.25 g/L、硫酸钠25 g/L、磷酸二氢钾25 g/L、碳酸氢钠62.5 g/L；C液：氯化铵75 g/L、尿素250 g/L、酵母抽提物50 g/L；D液：六水氯化镁50 g/L、四水氯化亚铁5 g/L、二水氯化钙10 g/L、一水半胱氨酸盐酸50 g/L；E液：二盐酸吡哆胺1 g/L、对氨基苯甲酸0.2 g/L、D-生物素0.1 g/L、维生素B12 0.1 g/L、维生素B1 0.2 g/L。

（2）发酵培养基的制备及灭菌：发酵培养基中添加40 g/L的木薯渣为碳源，其他成份同MTC培养基；将装有发酵培养基的血清瓶用胶塞和铝盖密封并重复抽真空和充0.04MPa的氮气3次，最后在130℃下灭菌20分钟；

（3）嗜热发酵及氢气的收集：将制备好的Clostridium thermocellum和Thermoanaerobacterium aotearoense种子液以1:1的比例，15%的总接种量注射入至灭菌后的发酵培养基中，厌氧嗜热发酵，发酵温度为60℃，摇床转速为200rpm，发酵96小时后，收集血清瓶上部的氢气，氢气含量达到4.55mmol。

（4）-196℃保存的酒精酵母Saccharomyces Cerevisiae经试管斜面、摇瓶逐级放大，制得细胞数达到108个/mL 的酵母醪液。其中培养基采用YPD培养基，即酵母粉10 g/L, 蛋白胨10 g/L，葡萄糖20 g/L；斜面时添加15 g/L琼脂；培养基初始pH为5.0；

（5）乙醇发酵：嗜热发酵结束后，将制备好的酵母种子液以5%的接种量接种至嗜热发酵培养液中，继续厌氧乙醇发酵，发酵温度为37℃，发酵20小时后终止发酵，酒精含量达到8.93 g/L。

实施例4

利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法，具体过程如下：

（1）嗜热厌氧菌种子液的制备：将-80℃保存的Clostridium thermocellum和Thermoanaerobacterium aotearoense经10mL西林瓶活化和100mL血清瓶放大，分别制得在培养36小时黄色物质明显的Clostridium thermocellum种子液以及OD600 ~1.0的Thermoanaerobacterium aotearoense种子液；其中培养基采用MTC培养基，培养基主要成份为A、B、C、D、E液，5种成分按45：2：1：1：1 ( V/V )用无菌注射器混合。菌种Clostridium thermocellum和Thermoanaerobacterium aotearoense的A液分别为3 g/L的纤维素或5 g/L的木糖。B液：柠檬酸三钾盐50 g/L、一水柠檬酸31.25 g/L、硫酸钠25 g/L、磷酸二氢钾25 g/L、碳酸氢钠62.5 g/L；C液：氯化铵75 g/L、尿素250 g/L、酵母抽提物50 g/L；D液：六水氯化镁50 g/L、四水氯化亚铁5 g/L、二水氯化钙10 g/L、一水半胱氨酸盐酸50 g/L；E液：二盐酸吡哆胺1 g/L、对氨基苯甲酸0.2 g/L、D-生物素0.1 g/L、维生素B12 0.1 g/L、维生素B1 0.2 g/L。

（2）发酵培养基的制备及灭菌：发酵培养基中添加40 g/L的木薯渣为碳源，其他成份同MTC培养基；将装有发酵培养基的血清瓶用胶塞和铝盖密封并重复抽真空和充0.04MPa的氮气的过程3次，最后在121℃下灭菌30分钟；

（3）嗜热发酵及氢气的收集：将制备好的Clostridium thermocellum和Thermoanaerobacterium aotearoense种子液以1:2的比例，10%的总接种量注射入至灭菌后的发酵培养基中，厌氧嗜热发酵，发酵温度为55℃，摇床转速为250rpm，发酵84小时后，收集血清瓶上部的氢气，氢气含量达到4.35mmol。

（4）-80℃保存的酒精酵母Saccharomyces Cerevisiae经试管斜面、摇瓶逐级放大，制得细胞数达到108个/mL 的酵母醪液。其中培养基采用YPD培养基，即酵母粉10 g/L, 蛋白胨10 g/L，葡萄糖20 g/L；斜面时添加15 g/L琼脂；培养基初始pH为5.5；

（5）乙醇发酵：嗜热发酵结束后，将制备好的酵母种子液以10%的接种量接种至嗜热发酵培养液中，继续厌氧乙醇发酵，发酵温度为37℃，发酵24小时后终止发酵，酒精含量达到8.80 g/L。

实施例5

利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法，具体过程如下：

（1）嗜热厌氧菌种子液的制备：将-80℃保存的Clostridium thermocellum和Thermoanaerobacterium aotearoense经10mL西林瓶活化和100mL血清瓶放大，分别制得在培养24小时黄色物质明显的Clostridium thermocellum种子液以及OD600 ~0.8的Thermoanaerobacterium aotearoense种子液；其中培养基采用MTC培养基，培养基主要成份为A、B、C、D、E液，5种成分按45：2：1：1：1 ( V/V )用无菌注射器混合。菌种Clostridium thermocellum和Thermoanaerobacterium aotearoense的A液分别为3 g/L的纤维素或5 g/L的木糖。B液：柠檬酸三钾盐50 g/L、一水柠檬酸31.25 g/L、硫酸钠25 g/L、磷酸二氢钾25 g/L、碳酸氢钠62.5 g/L；C液：氯化铵75 g/L、尿素250 g/L、酵母抽提物50 g/L；D液：六水氯化镁50 g/L、四水氯化亚铁5 g/L、二水氯化钙10 g/L、一水半胱氨酸盐酸50 g/L；E液：二盐酸吡哆胺1 g/L、对氨基苯甲酸0.2 g/L、D-生物素0.1 g/L、维生素B12 0.1 g/L、维生素B1 0.2 g/L。

（2）发酵培养基的制备及灭菌：发酵培养基中添加40 g/L的木薯渣为碳源，其他成份同MTC培养基；将装有发酵培养基的血清瓶用胶塞和铝盖密封并重复抽真空和充0.04MPa的氮气3次，最后在121℃下灭菌30分钟；

（3）嗜热发酵及氢气的收集：将制备好的Clostridium thermocellum和Thermoanaerobacterium aotearoense种子液以1:4的比例，10%的总接种量注射入至灭菌后的发酵培养基中，厌氧嗜热发酵，发酵温度为55℃，摇床转速为150rpm，发酵72小时后，收集血清瓶上部的氢气，氢气含量达到4.47mmol。

（4）-80℃保存的酒精酵母Saccharomyces Cerevisiae经试管斜面、摇瓶逐级放大，制得细胞数达到108个/mL 的酵母醪液。其中培养基采用YPD培养基，即酵母粉10 g/L, 蛋白胨10 g/L，葡萄糖20 g/L；斜面时添加15 g/L琼脂；培养基初始pH为5.5；

（5）乙醇发酵：嗜热发酵结束后，将制备好的酵母种子液以10%的接种量接种至嗜热发酵液中，继续厌氧酒精发酵，发酵温度为37℃，发酵24小时后终止发酵，酒精含量达到9.14 g/L。

实施例6

利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法，具体过程如下：

（1）嗜热厌氧菌种子液的制备：将-80℃保存的Clostridium thermocellum和Thermoanaerobacterium aotearoense经10mL西林瓶活化和100mL血清瓶放大，分别制得在培养24小时黄色物质明显的Clostridium thermocellum种子液以及OD600 ~0.8的Thermoanaerobacterium aotearoense种子液；其中培养基采用MTC培养基，培养基主要成份为A、B、C、D、E液，5种成分按45：2：1：1：1 ( V/V )用无菌注射器混合。菌种Clostridium thermocellum和Thermoanaerobacterium aotearoense的A液分别为3 g/L的纤维素或5 g/L的木糖。B液：柠檬酸三钾盐50 g/L、一水柠檬酸31.25 g/L、硫酸钠25 g/L、磷酸二氢钾25 g/L、碳酸氢钠62.5 g/L；C液：氯化铵75 g/L、尿素250 g/L、酵母抽提物50 g/L；D液：六水氯化镁50 g/L、四水氯化亚铁5 g/L、二水氯化钙10 g/L、一水半胱氨酸盐酸50 g/L；E液：二盐酸吡哆胺1 g/L、对氨基苯甲酸0.2 g/L、D-生物素0.1 g/L、维生素B12 0.1 g/L、维生素B1 0.2 g/L。

（2）发酵培养基的制备及灭菌：发酵培养基中添加60 g/L的木薯渣为碳源，其他成份同MTC培养基；将装有发酵培养基的血清瓶用胶塞和铝盖密封并重复抽真空和充0.04MPa的氮气3次，最后在121℃下灭菌30分钟；

（3）嗜热发酵及氢气的收集：将制备好的Clostridium thermocellum和Thermoanaerobacterium aotearoense种子液以1:9的比例，10%的总接种量注射入至灭菌后的发酵培养基中，厌氧嗜热发酵，发酵温度为55℃，摇床转速为150rpm，发酵84小时后，收集血清瓶上部的氢气，氢气含量达到4.53mmol。

（4）-80℃保存的酒精酵母Saccharomyces Cerevisiae经试管斜面、摇瓶逐级放大，制得细胞数达到108个/mL 的酵母醪液。其中培养基采用YPD培养基，即酵母粉10 g/L, 蛋白胨10 g/L，葡萄糖20 g/L；斜面时添加15 g/L琼脂；培养基初始pH为5.5；

（5）乙醇发酵：嗜热发酵结束后，将制备好的酵母种子液以10%的接种量接种至嗜热发酵培养液中，继续厌氧乙醇发酵，发酵温度为37℃，发酵24小时后终止发酵，酒精含量达到10.26 g/L。

实施例7

利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法，具体过程如下：

（1）嗜热厌氧菌种子液的制备：将-80℃保存的Clostridium thermocellum和Thermoanaerobacterium aotearoense经10mL西林瓶活化和100mL血清瓶放大，分别制得在培养24小时黄色物质明显的Clostridium thermocellum种子液以及OD600 ~1.0的Thermoanaerobacterium aotearoense种子液；其中培养基采用MTC培养基，培养基主要成份为A、B、C、D、E液，5种成分按45：2：1：1：1 ( V/V )用无菌注射器混合。菌种Clostridium thermocellum和Thermoanaerobacterium aotearoense的A液分别为3 g/L的纤维素或5 g/L的木糖。B液：柠檬酸三钾盐50 g/L、一水柠檬酸31.25 g/L、硫酸钠25 g/L、磷酸二氢钾25 g/L、碳酸氢钠62.5 g/L；C液：氯化铵75 g/L、尿素250 g/L、酵母抽提物50 g/L；D液：六水氯化镁50 g/L、四水氯化亚铁5 g/L、二水氯化钙10 g/L、一水半胱氨酸盐酸50 g/L；E液：二盐酸吡哆胺1 g/L、对氨基苯甲酸0.2 g/L、D-生物素0.1 g/L、维生素B12 0.1 g/L、维生素B1 0.2 g/L。

（2）发酵培养基的制备及灭菌：发酵培养基中添加80 g/L的木薯渣为碳源，其他成份同MTC培养基；将装有发酵培养基的血清瓶用胶塞和铝盖密封并重复抽真空和充0.04MPa的氮气3次，最后在115℃下灭菌40分钟；

（3）嗜热发酵及氢气的收集：将制备好的Clostridium thermocellum和Thermoanaerobacterium aotearoense种子液以4:1的比例，10%的总接种量注射入至灭菌后的发酵培养基中，厌氧嗜热发酵，发酵温度为55℃，摇床转速为150rpm，发酵84小时后，收集血清瓶上部的氢气，氢气含量达到4.61mmol。

（4）-80℃保存的酒精酵母Saccharomyces Cerevisiae经试管斜面、摇瓶逐级放大，制得细胞数达到108个/mL 的酵母醪液。其中培养基采用YPD培养基，即酵母粉10 g/L, 蛋白胨10 g/L，葡萄糖20 g/L；斜面时添加15 g/L琼脂；培养基初始pH为5.0；

（5）乙醇发酵：嗜热发酵结束后，将制备好的酵母种子液以8%的接种量接种至嗜热发酵培养液中，继续厌氧乙醇发酵，发酵温度为37℃，发酵24小时后终止发酵，酒精含量达到10.93 g/L。

实施例8

利用木薯渣同时发酵生产乙醇和氢气的方法，具体过程如下：

（1）嗜热厌氧菌种子液的制备：将-80℃保存的Clostridium thermocellum和Thermoanaerobacterium aotearoense经10mL西林瓶活化和100mL血清瓶放大，分别制得在培养36小时黄色物质明显的Clostridium thermocellum种子液以及OD600 ~1.0的Thermoanaerobacterium aotearoense种子液；其中培养基采用MTC培养基，培养基主要成份为A、B、C、D、E液，5种成分按45：2：1：1：1 ( V/V )用无菌注射器混合。菌种Clostridium thermocellum和Thermoanaerobacterium aotearoense的A液分别为3 g/L的纤维素或5 g/L的木糖。B液：柠檬酸三钾盐50 g/L、一水柠檬酸31.25 g/L、硫酸钠25 g/L、磷酸二氢钾25 g/L、碳酸氢钠62.5 g/L；C液：氯化铵75 g/L、尿素250 g/L、酵母抽提物50 g/L；D液：六水氯化镁50 g/L、四水氯化亚铁5 g/L、二水氯化钙10 g/L、一水半胱氨酸盐酸50 g/L；E液：二盐酸吡哆胺1 g/L、对氨基苯甲酸0.2 g/L、D-生物素0.1 g/L、维生素B12 0.1 g/L、维生素B1 0.2 g/L。

（2）发酵培养基的制备及灭菌：发酵培养基中添加120 g/L的木薯渣为碳源，其他成份同MTC培养基；将装有发酵培养基的血清瓶用胶塞和铝盖密封并重复抽真空和充0.04MPa的氮气3次，最后在115℃下灭菌30分钟；

（3）嗜热发酵及氢气的收集：将制备好的Clostridium thermocellum和Thermoanaerobacterium aotearoense种子液以9:1的比例，10%的总接种量注射入至灭菌后的发酵培养基中，厌氧嗜热发酵，发酵温度为55℃，摇床转速为300rpm，发酵108小时后，收集血清瓶上部的氢气，氢气含量达到4.72mmol。

（4）-80℃保存的酒精酵母Saccharomyces Cerevisiae经试管斜面、摇瓶逐级放大，制得细胞数达到108个/mL 的酵母醪液。其中培养基采用YPD培养基，即酵母粉10 g/L, 蛋白胨10 g/L，葡萄糖20 g/L；斜面时添加15 g/L琼脂；培养基初始pH为5.5；

乙醇发酵：嗜热发酵结束后，将制备好的酵母种子液以5%的接种量接种至嗜热发酵培养液中，继续厌氧乙醇发酵，发酵温度为37℃，发酵24小时后终止发酵，酒精含量达到10.64 g/L。