一种早期筛选优良精液品质种公牛的方法及其试剂盒.pdf

《一种早期筛选优良精液品质种公牛的方法及其试剂盒.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种早期筛选优良精液品质种公牛的方法及其试剂盒.pdf（10页完整版）》请在专利查询网上搜索。

1、(10)申请公布号 CN 104357579 A (43)申请公布日 2015.02.18 CN 104357579 A (21)申请号 201410748811.X (22)申请日 2014.12.09 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 山东省农业科学院奶牛研究中心 地址 250100 山东省济南市历城区工业北路 159-1 号 (72)发明人 王长法 范利娟 尹苗 黄金明 鞠志花 王秀革 孙艳 姜强 杨春红 仲跻峰 侯明海 (74)专利代理机构 济南圣达知识产权代理有限 公司 37221 代理人 杨琪 崔苗苗 (54) 发明名称 。

2、一种早期筛选优良精液品质种公牛的方法及 其试剂盒 (57) 摘要 本发明公开了一种早期筛选优良精液品质种 公牛的方法， 步骤为， 提取种公牛基因组 DNA， 测 定公牛 PRM2 基因 SNP 位点 g.478AG， 根据种公牛 第 478 碱基的等位基因预测种公牛的精液品质 ： 当种公牛PRM2 基因 SNP 位点 g.478AG为 GG 基因 型时， 种公牛精液品质最好 ； 当种公牛 PRM2 基因 SNP 位点 g.478AG 为 AA 基因型时， 种公牛精液品 质最差。 此外， PRM2 基因 SNP 位点 g.478AG， 使氨 基酸序列发生变化， 该位点氨基酸由精氨酸 (R) 变为。

3、甘氨酸 (G)。本发明还提供了用于早期筛选 优良精液品质种公牛的引物及其含有该引物的检 测试剂盒。本发明首次阐明了公牛 PRM2 基因 SNP 位点与公牛精液品质的相关性， 减少种公牛饲养 的盲目性， 节约成本， 增加经济效益。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 1 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104357579 A CN 104357579 A 1/1 页 2 1.一种用于早期筛选优良精液品质种公牛的引物， 其特征在于， 引物具有如序。

4、列表SEQ ID NO.2 和 SEQ ID NO.3 所示的碱基序列。 2. 如权利要求 1 所述的一种用于早期筛选优良精液品质种公牛的引物， 其特征在于， 所述引物可以特异性扩增出含 PRM2 基因的 SEQ ID NO.1 所示序列。 3. 一种用于早期筛选种公牛精液品质优劣的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒中含有 权利要求 1 或 2 所述的用于早期筛选优良精液品质种公牛的引物。 4. 如权利要求 3 所述的一种用于早期筛选种公牛精液品质优劣的试剂盒， 其特征在 于， 所述试剂盒还包括PCR反应液和限制性内切酶 ； 所述PCR反应液为Taq PCR MasterMix， 所述限制性内。

5、切酶为限制性内切酶 PstI。 5. 如权利要求 3 所述的一种用于早期筛选种公牛精液品质优劣的试剂盒， 其特征在 于， 所述试剂盒为 100 头牛检测剂量， 试剂盒的组成如下 ： 100mol/L 的上游引物 20L ； 100mol/L 的下游引物 20L ； 2Taq PCR MasterMix 1mL ； ddH2O 1.2mL ； 所述上游引物序列为序列表中 SEQ ID NO.2 所示的碱基序列 ； 所述下游引物序列为序列表中 SEQ ID NO.3 所示的碱基序列。 6. 如权利要求 5 所述的一种用于早期筛选种公牛精液品质优劣的试剂盒， 其特征在 于， 所述试剂盒中还包括 PR。

6、M2 基因中 SNP 位点 g.478AG 通过创造酶切位点法产生的限制 性内切酶 PstI。 7. 一种早期筛选优良精液品质种公牛的方法， 其特征在于， 提取种公牛基因组 DNA， 测 定公牛PRM2基因SNP位点g.478AG， 根据种公牛第478碱基的等位基因预测种公牛的精液 品质 ： 当种公牛PRM2基因SNP位点g.478AG为GG基因型时， 种公牛精液品质最好 ； 当种公 牛 PRM2 基因 SNP 位点 g.478AG 为 AA 基因型时， 种公牛精液品质最差。 8. 如权利要求 7 所述的早期筛选优良精液品质种公牛的方法， 其特征在于， 确定种公 牛第 478 位碱基基因型的具。

7、体步骤为 ： (1) 提取种公牛基因组 DNA， DNA 样品被稀释成 50ng/L， 备用 ； (2) 检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性 ： g.478AG ； (3) 针对 478 碱基单核苷酸多态位点 A/G， 设计公牛 PRM2 基因特异性引物， 进行 PCR 反 应， 扩增产物的序列如序列表SEQ ID NO ： 1所示 ； 所述的基因特异性引物具有如序列表SEQ ID NO ： 2 和 SEQ ID NO ： 3 所示的序列， 所述的扩增产物长度为 241bp ； (4)检测扩增产物的PstI单核苷酸多态位点A/G的多态性 ： 限制性内切核酸酶PstI酶 切所述扩增产物， 。

8、若得到216bp和25bp片段， 其基因型为AA纯合体 ； 若得到241bp、 216bp和 25bp 三个酶切片段时， 其基因型为 AG 杂合体 ； 若得到 241bp 片段， 其基因型为 GG 纯合体。 9. 一种用于早期筛选优良精液品质种公牛的 SNP 位点， 其特征在于， 所述 SNP 位点为 g.478AG， 位于公牛 PRM2 基因第 478 位碱基。 10. 权利要求 9 所述的 SNP 位点在制备筛选种公牛精液品质优劣的试剂盒中的应用。 权 利 要 求 书 CN 104357579 A 2 1/6 页 3 一种早期筛选优良精液品质种公牛的方法及其试剂盒 技术领域 0001 本发。

9、明涉及一种早期筛选优良精液品质种公牛的方法及其试剂盒， 具体涉及一种 早期筛选优良精液品质种公牛的 PRM2 基因 SNP 位点、 应用方法及试剂盒 , 属于家畜繁殖育 种分子生物学技术领域。 背景技术 0002 奶牛业发展水平是一个国家畜牧业发展水平高低的重要标志。 加快奶牛种群改良 是促进奶牛事业发展的重要举措。随着人工授精和冷冻精液的日益普及， 在现代奶牛群体 改良体系中， 种公牛是影响奶牛群遗传品质的主要因素。而种公牛精液品质的优劣直接影 响牛群的繁殖效率。公牛的采精量、 鲜精活力、 冻精解冻后活力、 鲜精密度和精子畸形率是 国际公认的衡量种公牛精液品质的重要指标。公牛的精液品质是重要。

10、的经济性状， 也是复 杂的数量性状， 在受微效多基因控制的同时， 也受一个或几个主基因控制， 因此， 筛选鉴定 影响公牛精液品质性状的主基因并阐明其对精子发育的调控作用和作用机制， 对于筛选优 良精液品质的公牛具有重要的意义。 通过标记辅助选择(marker assisted selected,MAS) 育种， 可以为培育优良精液品质的优质种公牛提供参考。 0003 鱼精蛋白 (Proteomics,PRMs) 是精细胞中主要的核蛋白， 存在于精子头部， 对精 子表型分化起到重要的遗传调控作用， 对精子 DNA 的正确包裹和精子正常功能的维持至关 重要。研究发现， 小鼠 PRM 表达量不足会导。

11、致染色体异常包裹和雄性不育。表明 PRM 基因 可作为候选基因用来选择公畜精液品质的优劣。但目前尚没有针对种公牛的 PRM2 基因进 行研究以筛选具有优良精液品质的种公牛的报道。 发明内容 0004 针对上述现有技术， 本发明的目的是提供一种应用公牛PRM2基因SNP分子标记筛 选精液品质优劣的方法。 0005 本发明的另一目的是通过此分子标记与种公牛精液品质的关系， 进而提供一种新 的筛选优质精液品质种公牛的试剂盒， 可对优良精液品质的种公牛进行早期筛选。 0006 为实现上述目的， 本发明采用如下技术方案 ： 0007 一种用于早期筛选优良精液品质种公牛的SNP位点， 所述SNP位点为g.。

12、478AG， 位 于公牛 PRM2 基因第 478 位碱基， 公牛 PRM2 基因第 478 位为 A 等位基因。核苷酸位置的编 号基于 GenBank 索引号 ： GenBank Accession No NC_007326.5(11051633-11052382)， 起始 密码子 ATG 作为 +1。 0008 本发明提出的新的公牛 PRM2 基因的功能性分子标记 g.478 AG， 是检测公牛自 GenBank Accession No NC_007326.5(11051633-11052382， 起始密码子 ATG 作为 +1) 中的 第478位脱氧核糖核苷酸是A还是G， 并且采用分子。

13、生物学相关技术鉴别种公牛在这个位点 的基因型。利用该 SNP 与种公牛精液品质性状的关联分析表明该 SNP 与种公牛精液品质性 状有关， 选择有利的 GG 基因型个体留种。 说 明 书 CN 104357579 A 3 2/6 页 4 0009 该种公牛的 SNP 位点可以应用于制备筛选种公牛精液品质优劣的试剂盒。 0010 一种应用公牛PRM2基因SNP分子标记早期筛选精液品质优劣的方法， 提取种公牛 基因组 DNA， 测定公牛 PRM2 基因 SNP 位点 g.478 AG， 根据种公牛第 478 碱基的等位基因预 测种公牛的精液品质 ： 当种公牛 PRM2 基因 SNP 位点 g.478。

14、 AG 为 GG 基因型时， 种公牛精液 品质最好 ； 当种公牛 PRM2 基因 SNP 位点 g.478 AG 为 AA 基因型时， 种公牛精液品质最差。 0011 一种用于早期筛选优良精液品质种公牛的引物， 具有如序列表SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3 所示的碱基序列 ； 所述引物可以特异性扩增出含 PRM2 基因的 SEQ ID NO.1 所示序 列。 0012 一种早期筛选优良精液品质种公牛的试剂盒， 该试剂盒含有可以特异性扩增出含 PRM2 基因的引物序列。 0013 所述试剂盒还包括 PCR 反应液和限制性内切酶 ； 所述 PCR 反应液为 Taq PCR Maste。

15、rMix， 所述限制性内切酶为 PstI。该限制性内切酶 PstI 酶切位点是通过人工创造的 方法获得的， 当第 474 位点 A 变为 C 后新产生的。 0014 具体的， 用于早期筛选种公牛精子活力高低的试剂盒， 为 100 头牛检测剂量， 试剂 盒的保存温度为 -20， 试剂盒的组成如下 ： 0015 100mol/L 的上游引物 20L ； 0016 100mol/L 的下游引物 20L ； 0017 2Taq PCR MasterMix 1mL ； 0018 ddH2O 1.2mL ； 0019 所述上游引物序列为序列表中 SEQ ID NO.2 所示的碱基序列 ； 0020 所述下。

16、游引物序列为序列表中 SEQ ID NO.3 所示的碱基序列 ； 0021 所述试剂盒中还包括 PRM2 基因中 SNP 位点 g.478 AG 通过创造酶切位点法 ( 第 474 位点 A 变为 C) 产生的限制性内切酶 PstI。 0022 本发明还提供了一种 PRM2 基因 SNP 位点 g.478 AG 筛选分型方法， 包括以下步 骤 ： 0023 (1) 采集种公牛血液或精液， 利用高盐法提取血液或精液基因组 DNA， DNA 样品被 稀释成 50ng/L， 备用 ； 0024 (2)检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性 ： g.478 AG， 其中， 核苷酸位置 编号基于 Ge。

17、nBank 索引号 ： GenBank Accession No NC_007326.5(11051633-11052382), 起 始密码子 ATG 作为 +1)。 0025 (3) 针对 478 碱基单核苷酸多态位点 A/G， 设计公牛 PRM2 基因特异性引物， 进行 PCR 反应， 得到特定片段 ( 如序列表 SEQ ID NO ： 1 所示 ) 的扩增产物 1 ； 所述的基因特异性 引物具有如序列表 SEQ ID NO ： 2 和序列表 SEQ ID NO ： 3 所示的序列， 所述的扩增产物长度 为 241bp。 0026 (4) 检测扩增产物 1 的 PstI 单核苷酸多态位点 。

18、A/G 的多态性 ： 限制性内切核酸 酶 PstI 酶切所述扩增产物 1， 若得到 216bp 和 25bp 片段， 其基因型为 AA 纯合体 ； 若得到 241bp、 216bp 和 25bp 三个酶切片段时， 其基因型为 AG 杂合体 ； 若得到 241bp 片段， 其基因 型为 GG 纯合体。( 其中 25bp 片段在琼脂糖凝胶中未能显现出来 ) 0027 本发明的有益效果 ： 说 明 书 CN 104357579 A 4 3/6 页 5 0028 (1) 本发明在公牛 PRM2 基因 478 位鉴定出 1 个突变位点， 经国际基因组数据库和 文献专利检索， 证明为新的 SNP 位点。 。

19、0029 (2) 经将上述的 SNP 位点 g.478 AG 与 500 头中国荷斯坦种公牛个体的精液品质 性状进行相关性分析， GG 基因型个体的种公牛精液品质性状高于其他基因型个体， 因此可 以用于种公牛的早期筛选， 从而减低饲养成本， 增加产品的附加值。 0030 (3) 公牛 PRM2 基因的 SNP 位点 g.478 AG， 导致氨基酸序列发生变化， 该位点氨基 酸由精氨酸变为甘氨酸。 0031 (4) 本发明还提供了一种新型的应用性试剂盒， 利用公牛 PRM2 基因第 478 位 SNP 位点对种公牛精子活力的高低进行筛选， 可用于种公牛的早期检测， 提高了检测效率， 降低 了检测。

20、成本， 减少种公牛饲养的盲目性。 附图说明 0032 图 1 公牛 PRM2 基因 SNP 位点 g.478 AG 扩增产物经 PstI 酶切结果 ； 0033 图 2 公牛 PRM2 基因 SNP 位点 g.478 AG 氨基酸变化结果， 该突变导致原编码的精 氨酸突变为甘氨酸。 具体实施方式 0034 结合实施例对本发明作进一步的说明， 应该说明的是， 下述说明仅是为了解释本 发明， 并不对其内容进行限定。 0035 下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件， 如 Sambrook 等 人， 分子克隆 ： 实验手册(New York ： Cold Spring Harbor。

21、 Laboratory Press， 1989)中所述 的条件或按照制造厂商所建议的条件。 0036 实施例 1 ： 突变位点的确定 0037 本发明采用 PCR 测序和 PCR-RFLP 技术对奶牛 PRM2 基因突变进行筛查， 通过酶切 电泳条带及测序结果比对， 确定了第 478 位突变位点。 0038 1.1 采集种公牛精液 0039 本发明所使用的种公牛精液取自北京奶牛中心、 上海光明荷斯坦牧业有限公司、 山东奥克斯种公牛站等， 依照高盐法提取精液基因组 DNA， DNA 样品被稀释成 50ng/L 备 用。实验牛共 500 头。 0040 1.2 引物设计 0041 根据 GenBa。

22、nk 登陆号为 NC_007326.5(11051633-11052382) 的 PRM2 的基因序列， 用Primer Premier5.0软件设计引物， 以公牛精液DNA为模板， 扩增PRM2基因的编码区。 所 设计引物的序列如下 0042 F:GATGAGGAGGAGGAGGAGGAGCTGC( 如序列表中 SEQ ID NO.2 所示 ) 0043 R:CCCGTGGGGAACAGAAGCTA( 如序列表中 SEQ ID NO.3 所示 ) 0044 1.3PCR 扩增 0045 25L 的反应体系 ： 模板 (50ng/L)1L， 10mol/L 上下游引物各 1L， 2Taq PC。

23、R MasterMix 12.5L， ddH2O 4.5L。 0046 PCR反应条件 ： 94变性5min， 94变性30s， 57退火30s， 72延伸14s， 35个循 说 明 书 CN 104357579 A 5 4/6 页 6 环 ； 72延伸 10min， 4保存。 0047 1.4SNP 的检测和分型 0048 PCR 产物经纯化后， 用 ABI 3730 DNA 测序仪进行序列的判读和 SNP 确认。通过创 造酶切位点法 ( 第 474 位点 A 变为 C)， 478 位点的 A/G 突变产生 PstI 单核苷酸多态。酶切 反应体系为 ： PCR 扩增产物 5L ； 10Fas。

24、tDigest Buffer 2L ； FastDigest 限制酶 PstI 1L ； ddH2O 12L， 酶切反应条件为 ： 37消化 30min。478 位点的 PstI 单核苷酸多态发现 3 种基因型， 分别为 AA(216bp+25bp) 型、 AG(241bp+216bp+25bp) 型和 GG(241bp) 型。 0049 采用 3.5的琼脂糖凝胶电泳检测， 用 UVP 凝胶成像系统检测进行基因分型， 根据 琼脂糖凝胶电泳得到的条带区分不同的基因型， 结果如图 1 所示， 分析位点的多态性情况 ( 其中 25bp 片段较小， 在琼脂糖凝胶中未显示出 )。 0050 实施例 2P。

25、RM2 基因 SNP 分子标记 g.478 AG 与种公牛精液品质性状的相关性分析 0051 试验公牛均具有完整的精液品质检测结果， 检测指标包括 ： 鲜精活力、 鲜精密度、 冻后活力以及精子畸形率等。 0052 采用 SAS 9.0 统计软件， 调用 GLM 程序， 运用最小二乘法拟合线性模型， 比较公牛 基因型与精液性状 ( 鲜精密度、 鲜精活力、 冻后活力 ) 的相关性。其模型为 ： 0053 Yijk +Gi+Yj+Hk+eijk 0054 Yijk为公牛精子各种性状的观察值 ； 为群体平均值 ； Gi: 基因型的固定效应 ； Hk： 场次的固定效应 ； Yj： 季节的固定效应 ； e。

26、ijk： 随机残差效应。 0055 对 PRM2 基因的 SNP 位点 g.478 AG 不同基因型与公牛精液品质性状进行关联分 析， 结果见表1， 结果表明 ： g.478 AG位点AA基因型个体的鲜精活力、 冻后活力和鲜精密度 显著低于 GG 和 AG(P 0.05)， GG 基因型畸形率显著低于 AA 和 AG(P 0.05)， GG 基因型为 精液品质优良基因型。 0056 表 1PRM2 基因不同基因型的精液品质的最小二乘均值及标准误 0057 0058 注 ： 不同小写字母的平均值间差异极显著 (P 0.05)。 0059 由表 1 可知， 具有 PRM2 基因 GG 基因型的种公。

27、牛个体精液品质性状显著高于具有 其他基因型的个体 (P 0.05)。这在种公牛选育和品种改良上具有潜在的应用价值。通过 对种公牛 PRM2 基因 g.478 AG 位点进行基因定型， 若发现某个个体携带 GG 基因型， 则该个 体与携带其他基因型的个体相比期望有更优的精液品质性状。据此， 育种工作者可以指导 牛的早期筛选， 从而降低饲养成本， 增加产品的附加值。可见， 公牛 PRM2 基因分子标记在公 牛的标记辅助选种和选配中有重要的应用前景。 说 明 书 CN 104357579 A 6 5/6 页 7 0060 实施例 3 检测试剂盒 0061 基于 PRM2 基因 SNP 分子标记筛选种。

28、公牛的试剂盒， 如实施例 1 所述， NC_007326.5 中的 g.478 AG 突变与种公牛的精液品质性状密切相关。因此， 可基于这个 SNP 位点设计 PRM2 基因特异性引物进行扩增和检测。 0062 制备用于种公牛精液品质性状优劣检测的试剂盒 (100 次 )， 详细成分如表 2 所 示 ： 0063 表 2 检测试剂盒组成 0064 0065 采集种公牛血液或精液， 提取总 DNA， 按实施例 1 所述方法进行反应。将试剂盒中 的 PCR 引物稀释到 10mol/L， 以所提取的 DNA 为模板用上述试剂盒进行 PCR 反应。PCR 反 应条件 ： 94变性 5min， 94变性。

29、 30s， 57退火 30s， 72延伸 14s， 35 个循环 ； 72延伸 10min， 4保存。25L 的反应体系 ： 模板 (50ng/L)1L， 10mol/L 上下游引物各 1L， 2Taq PCR MasterMix 12.5L， ddH2O 4.5L。 0066 按实施例1所述方法对PCR扩增产物进行酶切分型进行确认。 PCR扩增产物5L ； 10FastDigest Buffer 2L ； FastDigest 限制酶 PstI 1L ； ddH2O 12L。酶切反应 条件为 ： 37消化 30min。478 位点的 PstI 单核苷酸多态发现 3 种基因型， 分别为分别为 。

30、AA(216bp+25bp) 型、 AG(241bp+216bp+25bp) 型和 GG(241bp) 型。采用 3.5的琼脂糖凝胶 电泳检测， 用 UVP 凝胶成像系统检测进行基因分型， 根据琼脂糖凝胶电泳得到的条带区分 不同的基因型， 分析位点的多态性情况 ( 其中 25bp 片段较小， 在琼脂糖凝胶中未显示出 )。 再进一步按所测种公牛的基因型， 最终判断所测种公牛的精液品质性状优劣， 决定留种与 否。 0067 根据本发明提供的标记方法， 如果直接测序也可以检测出 NC_007326.5 中第 478 位 A G 突变。但是通过直接测序的成本高， 操作偏于复杂， 仅适用小批量样品的检测。

31、。本 实施例所发明的试剂盒则可以很好的解决这个问题。 0068 本发明具有实用性的例证 ： 0069 1) 本发明的 PRM2 基因多态性的检测方法可用于分析牛 25 号染色体的 PRM2 基因 上的 1 个 SNP 位点， 应用于种公牛精液品质优劣的早期诊断， 以利于培育高繁殖力的种公 牛。 0070 2) 本发明建立的检测 PRM2 基因多态性的核苷酸序列和种公牛精液品质优劣相关 位点， 可高灵敏度、 特异性地应用于与种公牛精液品质性状相关基因诊断的试剂盒。 说 明 书 CN 104357579 A 7 6/6 页 8 0071 如上所述， 得出结论， PRM2 基因 SNP 位点 g.4。

32、78 AG 的多态性与种公牛精液品质 优劣具显著相关性。因此， 根据本发明， 测定此多态性可用于进行基因诊断。 0072 本发明叙述了 PRM2 基因种公牛精液品质优劣相关的新突变位点， 并提供了一种 测定 PRM2 基因多态性的方法。而且， 根据本发明， 只需要少量 DNA 样品就足以测定 PRM2 基 因多态性。结果， 本发明提供了一种测定种公牛精液品质优劣相关 SNP 分子标记的基因诊 断方法。 0073 上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述， 但并非对本发明保护范 围的限制， 所属领域技术人员应该明白， 在本发明的技术方案的基础上， 本领域技术人员不 需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。 说 明 书 CN 104357579 A 8 1/1 页 9 0001 序 列 表 CN 104357579 A 9 1/1 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104357579 A 10 。