一种水稻矮缩病毒抗体的制备方法.pdf

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510396409.4 (22)申请日 2015.07.08 C07K 16/10(2006.01) (71)申请人 刘铮 地址 110168 辽宁省沈阳市浑南新区浑南中 路 19 号陆军总院分院东侧正大江南水 乡 6#761 (72)发明人 刘铮 (54) 发明名称 一种水稻矮缩病毒抗体的制备方法 (57) 摘要 一种水稻矮缩病毒抗体的制备方法属于病毒 抗体制备技术领域， 尤其涉及一种水稻矮缩病毒 抗体的制备方法。本发明提供一种解决了大分子 目的蛋白通常不易诱导问题的水稻矮缩病毒抗体 的制备方法。本发明包括以下步骤。1） 阳性菌株。

2、 按1:100接种于两管含氨苄青霉素和氯霉素的LB 液体培养基中， 摇菌 3-4h， 诱导培养 4-5h， 另一试 管中不添加 IPTG 作为对照 ； 取菌液并收集菌体， 经凝胶电泳分离后置于考马斯亮蓝染色液 ； 2） 诱 导 100ml 菌液， 收集菌体， 目的蛋白经凝胶电泳， 电泳后的凝胶经 KCL 预冷处理得到乳白色蛋白条 带， 将目的蛋白条带用刀片切割回收， 加入弗氏佐 剂研磨至乳化状， 保存备用。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 CN 106317223 A 2017.01.11 CN 106317223。

3、 A 1/1 页 2 1.一种水稻矮缩病毒抗体的制备方法， 其特征在于包括以下步骤 ： 1）阳性菌株按 1:100 接种于两管含氨苄青霉素和氯霉素的 LB 液体培养基中， 摇菌 3-4h， 诱导培养 4-5h， 另一试管中不添加 IPTG 作为对照 ； 取菌液并收集菌体， 经凝胶电泳分 离后置于考马斯亮蓝染色液 ； 2） 诱导 100ml 菌液， 收集菌体， 目的蛋白经凝胶电泳， 电泳后的凝胶经 KCL 预冷处理得 到乳白色蛋白条带， 将目的蛋白条带用刀片切割回收， 加入弗氏佐剂研磨至乳化状， 保存备 用 ； 3） 提取 SRBSDV 侵染的水稻病株和健康水稻植株总蛋白， 经凝胶电泳分离后转印。

4、到 PVDF 膜上， 室温摇床上封闭 1h 后， 用 PBST 洗三遍 ； 将 PVDF 膜置于 1:1000 稀释的 P6 抗血 清中孵育 ； 再用 PBST 洗三遍后， 放入 1:30000 稀释的抗体中孵育 1h ； 将 PVDF 膜用 PBST 洗 三遍后放入显色液中避光显色 ； 4） 取无毒白背飞虱飞虱若虫在 SRBSDV 侵染的水稻病株上饲毒 2d， 随后转到健康水稻 上饲养 ； 以荧光抗体和染料孵育 1h。 2.根据权利要求1所述一种水稻矮缩病毒抗体的制备方法， 其特征在于所述步骤1） 阳 性菌株按 1:100 接种于两管含氨苄青霉素和氯霉素的 LB 液体培养基中， 置于 37条。

5、件下 230rpm 摇菌 3-4h， 置于 28条件下 230rpm 诱导培养 4-5h， 另一试管中不添加 IPTG 作为对 照 ； 取 1mL 菌液并收集菌体， 经 12%SDS-PAGE 凝胶电泳分离后置于考马斯亮蓝染色液。 3.根据权利要求1所述一种水稻矮缩病毒抗体的制备方法， 其特征在于所述步骤2） 诱 导 100ml 菌液， 收集菌体， 目的蛋白经 12%SDS-PAGE 凝胶电泳， 电泳后的凝胶经 0.1mol/L 的 KCL 预冷处理 3-4min 得到乳白色蛋白条带， 将目的蛋白条带用刀片切割回收， 加入弗氏佐 剂研磨至乳化状， -20保存备用。 4.根据权利要求1所述一种水。

6、稻矮缩病毒抗体的制备方法， 其特征在于所述步骤3） 提 取SRBSDV侵染的水稻病株和健康水稻植株总蛋白， 经12%SDS-PAGE凝胶电泳分离后转印到 PVDF 膜上， 3%BSA 室温摇床上封闭 1h 后， 用 PBST 洗三遍 ； 将 PVDF 膜置于 1:1000 稀释的 P6 抗血清中 37孵育 1h ； 再用 PBST 洗三遍后， 放入 1:30000 稀释的 anti-rabbitIgG-AP 抗体 中 37孵育 1h ； 将 PVDF 膜用 PBST 洗三遍后放入 BCIP/NBT 显色液中避光显色 ； 4） 取200头1-2龄的无毒白背飞虱飞虱若虫在SRBSDV侵染的水稻病株。

7、上饲毒2d， 随后 转到健康水稻上饲养 ； 以荧光抗体 P6-FITC、 P9-1-rhodamine 和 Actin 染料 phalloidin Alexa 孵育 1h。 权 利 要 求 书 CN 106317223 A 2 1/3 页 3 一种水稻矮缩病毒抗体的制备方法 技术领域 0001 本发明属于病毒抗体制备技术领域， 尤其涉及一种水稻矮缩病毒抗体的制备方 法。 背景技术 0002 南方水稻黑条矮缩病于 2001 年在广东省阳江市首次发现， 随后几年间逐渐向邻 近省份扩散。2009 年， 在中国南方 9 个省份大面积暴发， 受灾面积约 30 万 hm2， 同年该病在 越南北部 19 个。

8、省份普遍发生。2010 年， 中国南方 13 个省份超过 130 万 hm2 水稻受害， 同期 越南中部和北方 29 个省份约 6 万 hm2 水稻受害。2010 年在日本九州也发现该病的发生。 此外， 该病不仅可以危害水稻， 还可以危害玉米， 2009 年在山东、 广东、 广西和海南等省的玉 米上也检测到该病害， 给玉米造成植株矮缩和穗不育。因此， SRBSDV 引起的水稻病害已成 为我国南方稻区的重要病毒病之一。 0003 水稻病毒病主要由介体昆虫传播， 且一经发生即无药可治， 因此对田间介体昆虫 的防治及带毒情况监测至关重要。所以， 急需建立 SRBSDV 的大批量快速检测方法用于田间 。

9、白背飞虱带毒率的检测。 发明内容 0004 本发明就是针对上述问题， 提供一种解决了大分子目的蛋白通常不易诱导问题的 水稻矮缩病毒抗体的制备方法。 0005 为实现上述目的， 本发明包括以下步骤。 0006 1） 阳性菌株按1:100接种于两管含氨苄青霉素和氯霉素的LB液体培养基中， 摇菌 3-4h， 诱导培养 4-5h， 另一试管中不添加 IPTG 作为对照 ； 取菌液并收集菌体， 经凝胶电泳分 离后置于考马斯亮蓝染色液。 0007 2） 诱导 100ml 菌液， 收集菌体， 目的蛋白经凝胶电泳， 电泳后的凝胶经 KCL 预冷处 理得到乳白色蛋白条带， 将目的蛋白条带用刀片切割回收， 加入弗。

10、氏佐剂研磨至乳化状， 保 存备用。 0008 3） 提取 SRBSDV 侵染的水稻病株和健康水稻植株总蛋白， 经凝胶电泳分离后转印 到 PVDF 膜上， 室温摇床上封闭 1h 后， 用 PBST 洗三遍 ； 将 PVDF 膜置于 1:1000 稀释的 P6 抗 血清中孵育 ； 再用 PBST 洗三遍后， 放入 1:30000 稀释的抗体中孵育 1h ； 将 PVDF 膜用 PBST 洗三遍后放入显色液中避光显色。 0009 4） 取无毒白背飞虱飞虱若虫在 SRBSDV 侵染的水稻病株上饲毒 2d， 随后转到健康 水稻上饲养 ； 以荧光抗体和染料孵育 1h。 0010 作为一种优选方案， 本发明。

11、所述步骤 1）阳性菌株按 1:100 接种于两管含氨苄 青霉素和氯霉素的 LB 液体培养基中， 置于 37条件下 230rpm 摇菌 3-4h， 置于 28条件 下 230rpm 诱导培养 4-5h， 另一试管中不添加 IPTG 作为对照 ； 取 1mL 菌液并收集菌体， 经 12%SDS-PAGE 凝胶电泳分离后置于考马斯亮蓝染色液。 说 明 书 CN 106317223 A 3 2/3 页 4 0011 作为另一种优选方案， 本发明所述步骤 2） 诱导 100ml 菌液， 收集菌体， 目的蛋白经 12%SDS-PAGE凝胶电泳， 电泳后的凝胶经0.1mol/L的KCL预冷处理3-4min得。

12、到乳白色蛋白 条带， 将目的蛋白条带用刀片切割回收， 加入弗氏佐剂研磨至乳化状， -20保存备用。 0012 另外， 本发明所述步骤 3） 提取 SRBSDV 侵染的水稻病株和健康水稻植株总蛋白， 经 12%SDS-PAGE 凝胶电泳分离后转印到 PVDF 膜上， 3%BSA 室温摇床上封闭 1h 后， 用 PBST 洗 三遍 ； 将 PVDF 膜置于 1:1000 稀释的 P6 抗血清中 37孵育 1h ； 再用 PBST 洗三遍后， 放入 1:30000 稀释的 anti-rabbitIgG-AP 抗体中 37孵育 1h ； 将 PVDF 膜用 PBST 洗三遍后放入 BCIP/NBT 显。

13、色液中避光显色。 0013 4）取 200 头 1-2 龄的无毒白背飞虱飞虱若虫在 SRBSDV 侵染的水稻病株上饲 毒 2d， 随后转到健康水稻上饲养 ； 以荧光抗体 P6-FITC、 P9-1-rhodamine 和 Actin 染料 phalloidinAlexa 孵育 1h。 0014 本发明有益效果。 0015 本发明针对 SRBSDV 侵染后复制过程中必需的 P6 蛋白， 通过原核表达 65P6 蛋白 N 端部分氨基酸制备了 P6 的多克隆抗体， 通过免疫荧光标记方法检测 P6 在白背飞虱体内的 分布， 建立了大批量快速准确检测介体白背飞虱带毒率的方法， 为南方水稻黑条矮缩病的 田。

14、间监测和预测预报奠定了基础。 0016 本发明以原核表达P6蛋白N端氨基酸片段所制备的P6抗体， 可用于Westernblot 实验检测 SRBSDV 侵染水稻产生的 P6 蛋白以及免疫荧光标记检测昆虫体内的病毒蛋白， 表 明 P6 抗体可作为 SRBSDV 检测的特异性抗体， 同时表明通过原核表达目的蛋白的小片段即 可作为抗原用于制备蛋白的多克隆抗体， 解决了大分子目的蛋白通常不易诱导表达的技术 瓶颈。 具体实施方式 0017 本发明包括以下步骤。 0018 1） 阳性菌株按1:100接种于两管含氨苄青霉素和氯霉素的LB液体培养基中， 摇菌 3-4h， 诱导培养 4-5h， 另一试管中不添加。

15、 IPTG 作为对照 ； 取菌液并收集菌体， 经凝胶电泳分 离后置于考马斯亮蓝染色液。 0019 2） 诱导 100ml 菌液， 收集菌体， 目的蛋白经凝胶电泳， 电泳后的凝胶经 KCL 预冷处 理得到乳白色蛋白条带， 将目的蛋白条带用刀片切割回收， 加入弗氏佐剂研磨至乳化状， 保 存备用。 0020 3） 提取 SRBSDV 侵染的水稻病株和健康水稻植株总蛋白， 经凝胶电泳分离后转印 到 PVDF 膜上， 室温摇床上封闭 1h 后， 用 PBST 洗三遍 ； 将 PVDF 膜置于 1:1000 稀释的 P6 抗 血清中孵育 ； 再用 PBST 洗三遍后， 放入 1:30000 稀释的抗体中孵。

16、育 1h ； 将 PVDF 膜用 PBST 洗三遍后放入显色液中避光显色。 0021 4） 取无毒白背飞虱飞虱若虫在 SRBSDV 侵染的水稻病株上饲毒 2d， 随后转到健康 水稻上饲养 ； 以荧光抗体和染料孵育 1h。 0022 所述步骤 1） 阳性菌株按 1:100 接种于两管含氨苄青霉素和氯霉素的 LB 液体培养 基中， 置于 37条件下 230rpm 摇菌 3-4h， 置于 28条件下 230rpm 诱导培养 4-5h， 另一试 管中不添加 IPTG 作为对照 ； 取 1mL 菌液并收集菌体， 经 12%SDS-PAGE 凝胶电泳分离后置于 说 明 书 CN 106317223 A 4。

17、 3/3 页 5 考马斯亮蓝染色液。 0023 所述步骤 2） 诱导 100ml 菌液， 收集菌体， 目的蛋白经 12%SDS-PAGE 凝胶电泳， 电泳 后的凝胶经 0.1mol/L 的 KCL 预冷处理 3-4min 得到乳白色蛋白条带， 将目的蛋白条带用刀 片切割回收， 加入弗氏佐剂研磨至乳化状， -20保存备用。 0024 所述步骤3） 提取SRBSDV侵染的水稻病株和健康水稻植株总蛋白， 经12%SDS-PAGE 凝胶电泳分离后转印到 PVDF 膜上， 3%BSA 室温摇床上封闭 1h 后， 用 PBST 洗三遍 ； 将 PVDF 膜置于 1:1000 稀释的 P6 抗血清中 37孵。

18、育 1h ； 再用 PBST 洗三遍后， 放入 1:30000 稀释的 anti-rabbitIgG-AP 抗体中 37孵育 1h ； 将 PVDF 膜用 PBST 洗三遍后放入 BCIP/NBT 显色 液中避光显色。 0025 4）取 200 头 1-2 龄的无毒白背飞虱飞虱若虫在 SRBSDV 侵染的水稻病株上饲 毒 2d， 随后转到健康水稻上饲养 ； 以荧光抗体 P6-FITC、 P9-1-rhodamine 和 Actin 染料 phalloidinAlexa 孵育 1h。 0026 以提取的 SRBSDV 水稻病株总 RNA 为模板， 经 RT-PCR 扩增获得 SRBSDVP6 基。

19、因 开放阅读框 N 端 bp 片段。目的基因片段与 pDONR221 进行 BP 重组反应获得中间载体 pDONR221-P6， 中间载体再与 pDEST17 载体进行 LR 重组反应获得表达载体 pDEST17-P6， 经 PCR 和测序鉴定表明已获得 P6 蛋白的原核表达载体。 0027 为了检测通过原核表达蛋白免疫注射兔子所获得多克隆抗体的特异性， 以 SRBSDV 侵染的水稻和健康水稻总蛋白为样品， 经 12% 的 SDS-PAGE 凝胶电泳后， 用 P6 抗血清为一抗 进行 Westernblot 检测。结果显示 P6 抗血清能特异性识别 SRBSDV 侵染水稻病株中的 kDa 蛋白， 与预测的 P6 蛋白大小相符， 而在健康水稻中未检测到对应条带。 0028 以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明作的进一步详细说明， 不能认定本 发明的具体实施只局限于这些说明， 对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说， 在不 脱离本发明构思的前提下， 还可以做出若干简单推演或替换， 都应当视为属于本发明所提 交的权利要求书确定的保护范围。 说 明 书 CN 106317223 A 5 。