技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体地，涉及一对丽蚜小蜂特异性SCAR引物及 快速PCR检测方法和试剂盒。
背景技术
丽蚜小蜂Encarsia formosa Gahan，属膜翅目、蚜小蜂科、恩蚜小蜂属，是烟粉 虱、温室粉虱的主要寄生性天敌之一。丽蚜小蜂于1927年首次在英国发现并用于防 治温室粉虱，此后，欧洲各国便开始利用丽蚜小蜂防控温室粉虱的研究。如英国的 英格兰和威尔士地区，在1976年应用丽蚜小蜂防治温室粉虱的面积就已经达到139.4 ha.，约占当时温室种植番茄、黄瓜面积的72%，并取得了令人满意的结果，防效达 72~87%。我国于1978年由中国农业科学院生物防治研究室从英国引进丽蚜小蜂，之 后对该蜂的生物学和生态学习性及其与寄主之间的关系等进行了系列研究，丽蚜小 蜂的商品化生产技术、田间应用方法及效果评价模式等日臻成熟，并取得了很好的 防治效果。如，当温室粉虱种群密度为0.5头/株时，每平方千米释放15万头丽蚜小 蜂（分3-4次释放），其防治效果可达95.4%。由于丽蚜小蜂具有安全性能高、控害 效果好、适应能力强且成本低廉等特点，目前已成为世界广泛商品化的用于防治温 室作物粉虱不可或缺的重要寄生性天敌种类。
丽蚜小蜂体型微小，成虫体长0.59~0.68mm，与其他常见的寄生蜂种类如浅黄 恩蚜小蜂、海氏桨角蚜小蜂等形态相似，而且成虫前的各个虫态（包括卵、幼虫、 蛹）均在寄主体内度过。鉴于粉虱类害虫的寄生蜂种类较多，而丽蚜小蜂是其重要 寄生性天敌之一，因此快速准确地识别丽蚜小蜂是其寄主谱确定及其对不同种类粉 虱控制效果评价的必要前提。目前国际上用于丽蚜小蜂鉴定的方法主要有：1）形态 特征鉴定；2）AFLP技术等。但目前国内针对丽蚜小蜂尚没有标准的检测方法。
AFLP技术曾用于丽蚜小蜂及其近缘种鉴别。AFLP技术是RFLP技术与PCR技 术相结合的产物，亦即，先行利用限制性内切酶水解基因组DNA，使之产生不同大 小的DNA片段，然后再使双链人工接头的酶切片段相连接，并以此作为扩增反应 的模板DNA；之后，以人工接头的互补链作为引物进行预扩增；最后，在接头互补 链的基础上添加1~3个选择性核苷酸作为引物，并对模板DNA再次进行选择性扩 增，之后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测获得的DNA扩增片段，并根据扩增片 段长度的不同检测出多态性。SCAR-PCR技术检测是在RAPD技术的基础上发展起来 的特异序列扩增区域标记，是利用特异性的引物，根据预期DNA条带的有无来判断 检测结果，无需测序和序列比对，具有灵敏度高、特异性强、快速、简便且重现性 和稳定性强等优点。
发明内容
本发明的目的为提供一对丽蚜小蜂特异性SCAR引物。
本发明的再一目的为提供一种丽蚜小蜂特异性片段。
本发明的另一目的为提供一种丽蚜小蜂的特异性快速检测方法。
本发明的再一目的为提供一种丽蚜小蜂的特异性快速检测试剂盒。
本发明根据丽蚜小蜂的基因组DNA序列，设计一对种特异性引物，该引物只 对丽蚜小蜂具有扩增能力。是对丽蚜小蜂AFLP技术检测方法的补充和改进。同时， 本发明采用SCAR PCR技术，提高了检测的准确性和灵敏度，节约了检测时间，在 丽蚜小蜂监测检测方面具有重要的应用价值，可以试剂盒的形式在保护地及露地丽 蚜小蜂种类鉴别、寄主谱筛选及其有效利用中推广。
根据本发明的一对丽蚜小蜂特异性SCAR引物为：
引物EFZZF：5′-AATCGTCGTGTCAGGGAG-3′(SEQ ID No.1)；和
引物EFZZR：5′-GCCGTGGCGTTTAGTATG-3′(SEQ ID No.2)。
根据本发明的丽蚜小蜂种特异性检测方法包括使用上述SCAR引物进行PCR扩 增的步骤；或者包括使用探针与上述特异性片段进行杂交的步骤。
根据本发明的丽蚜小蜂种特异性检测试剂盒包括上述丽蚜小蜂特异性SCAR引 物，和/或用于检测上述特异性片段的探针。本领域普通技术人员利用分子杂交技术 进行丽蚜小蜂种特异性检测时，可以根据本领域的公知常识设计与本申请的丽蚜小 蜂特异性片段（SEQ ID No.3所示）特异性杂交的探针。
本发明的丽蚜小蜂种特异性SCAR引物及快速检测方法，用于快速检测丽蚜小 蜂。与国际现有方法相比，本发明具有以下的技术优势：
1）检测准确性高。本发明根据丽蚜小蜂种特异性SCAR标记设计的引物EFZZF 和EFZZR，在PCR快速检测丽蚜小蜂时，可扩增出287bp的片段，不仅对丽蚜小 蜂的单头成虫、蛹和3龄幼虫可以进行检测，对于单粒卵也能准确检测。
2）操作简便快捷。本发明采用PCR技术，操作过程简单、快速、高效。一般 整个过程可在5个小时内完成。
3）特异性强。本发明设计的引物可特异性检测丽蚜小蜂，在其近缘种、属蚜小 蜂及其主要粉虱类寄主昆虫中无扩增产物。
因此本方法实用性强，可满足自然资源保护及寄生蜂监测/检测的需要。
附图说明
图1为引物EFZZF/EFZZR对丽蚜小蜂及其近缘种属蚜小蜂和主要粉虱类（包 括不同生物型（B型、Q型、ZHJ-1型、ZHJ-2型）的烟粉虱、温室粉虱和黑刺粉虱 等）寄主害虫的SCAR PCR扩增结果，
M:分子量标准Trans2K；1:丽蚜小蜂Encarsia formosa Gahan；2:浅黄恩蚜小 蜂；3:海氏桨角蚜小蜂；4:本地种桨角蚜小蜂Eretmocerus sp.；5:蒙氏桨角蚜小蜂； 6:刺粉虱黑蜂；7:B型烟粉虱；8:Q型烟粉虱；9:ZHJ-1型烟粉虱；10:ZHJ-2型烟 粉虱；11:温室粉虱；12:黑刺粉虱；13:阴性对照（超纯水）。
图2为引物EFZZF/EFZZR对丽蚜小蜂不同虫态的SCAR PCR扩增结果，
M:分子量标准Trans2K；1:雌性成虫；2:蛹；3:三龄幼虫；4:单粒卵；8:阴 性对照（超纯水）。
图3为引物EFZZF/EFZZR对丽蚜小蜂检测阈值的测定，
M:分子量标准Trans2K；1-9分别为1:1/100;2:1/200;3:1/400;4:1/800;5: 1/1600;6:1/3200;7:1/6400;8:1/12800;9:1/25600;10:阴性对照（超纯水）。
具体实施方式
实施例1：引物EFZZF/EFZZR对丽蚜小蜂的扩增效果
1）丽蚜小蜂DNA的制备
将单头蚜小蜂置于滴有20μL提取缓冲液（50mM Tris-HCl、lmM EDTA、1% SDS、20mMNaCl,pH 8.0）的parafilm膜上,以0.2mL的PCR管底部作为匀浆器充分 研磨，匀浆液以微量移液器移入1.5mL离心管；然后以200μL缓冲液分2次清洗匀 浆器，移入同一离心管，混匀，加入5μL蛋白酶K(20mg/mL)，充分混匀后于60°C 水浴1h(中途混匀1次)；然后沸水浴5min，加入220μL氯仿/异戊醇（V:V=24:1） 抽提液，轻柔混匀数十次后，冰上放置30min；4°C、12000r/min离心20min，取 上清液，加入440μL预冷的无水乙醇，轻轻混匀，待出现少量絮状沉淀后于-30°C 放置30min；4°C、12000r/min离心15min，小心弃去上清液。加入500μL预冷 的75%乙醇洗涤，4°C、12000r/min离心15min，小心弃去上清液；然后将离心管 倒扣于洁净滤纸上，自然干燥20min后每管加入20μL超纯水，充分溶解后于-30 °C保存备用。
2）检验丽蚜小蜂的特异性引物的合成
Primer EFZZF：5′-AATCGTCGTGTCAGGGAG-3′
Primer EFZZR：5′-GCCGTGGCGTTTAGTATG-3′由上海生工生物工程技术服 务有限公司合成。
3）PCR扩增反应
反应体系为20μL，其中10×PCR buffer 2.0μL、dNTP(10mM)1.6μL、MgCl2(2.5mM)1.2μL、Taq聚合酶(5U/μL)0.1μL、上游引物和下游引物(10μM)各0.5 μL、模板DNA 1.0μL、超纯水13.1μL。
4）PCR扩增程序
94°C预变性5min；30个循环：94°C 30sec、58°C 30sec、72°C 50sec；最 后72°C延伸5min。
5）PCR产物的鉴定
取4μL PCR产物用1.5%（重量/体积）琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色 后于凝胶成像系统根据扩增产物的大小判定结果。
结果
利用引物EFZZF/EFZZR以丽蚜小蜂基因组DNA为模板，以浅黄恩蚜小蜂、 海氏桨角蚜小蜂、本地种桨角蚜小蜂Eretmocerus sp.、蒙氏桨角蚜小蜂、刺粉虱黑蜂 等5种其他常见种类的蚜小蜂，以及烟粉虱（包括：B型、Q型、ZHJ-1型、ZHJ-2 型）、温室粉虱和黑刺粉虱等主要粉虱类寄主昆虫为对照，进行SCAR PCR扩增。在 1泳道的丽蚜小蜂中扩增出了287bp的目的条带（见附图1的1泳道），在其他5种 近缘种、属的蚜小蜂及其主要粉虱类寄主昆虫中均无扩增产物。说明我们所筛选的 来自丽蚜小蜂基因组DNA的特异性SCAR PCR扩增引物的特异性强。
SEQ ID No.3：
aatcgtcgtg tcagggagcg aggaataaaa aaaggcagag acaagacgca cggtagctgc 60
gtcttcattc ttaaatggat ttttaataca cattcctgag gggagagaat gaaaaaataa 120
atggattcgt agctacgata agtggagcaa ggtcaatgtt tccgagtcga tctagagatc 180
caggattgac gggtctggaa gatacggatg ctttgttttt aatcgcgtcg ttcgaattaa 240
tttacacaaa tttgagccta cgagtctcac atactaaacg ccacggc 287
实施例2：引物EFZZF/EFZZR对丽蚜小蜂不同虫态的扩增效果
1）丽蚜小蜂模板DNA的制备
将不同虫态的单头/单粒丽蚜小蜂置于滴有20μL提取缓冲液(50mM Tris-HCl、l mM EDTA、1%SDS、20mMNaCl,pH 8.0)的parafilm膜上,以0.2mL的 PCR管底部作为匀浆器充分研磨，匀浆液以微量移液器移入1.5mL离心管；然后以200 μL缓冲液分2次清洗匀浆器，移入同一离心管，混匀，加入5μL蛋白酶K(20 mg/mL)，充分混匀后于60°C水浴1h(中途混匀1次)；然后沸水浴5min，加入220 μL氯仿/异戊醇（V:V=24:1）抽提液，轻柔混匀数十次后，冰上放置30min；4°C、 12000r/min离心20min，取上清液，加入440μL预冷的无水乙醇，轻轻混匀，待 出现少量絮状沉淀后于-30°C放置30min；4°C、12000r/min离心15min，小心 弃去上清液。加入500μL预冷的75%乙醇洗涤，4°C、12000r/min离心15min， 小心弃去上清液；然后将离心管倒扣于洁净滤纸上，自然干燥20min后每管加入20 μL超纯水，充分溶解后于-20°C保存备用。
2）检验丽蚜小蜂的特异性引物的合成
Primer EFZZF：5′-AATCGTCGTGTCAGGGAG-3′
Primer EFZZR：5′-GCCGTGGCGTTTAGTATG-3′由上海生工生物工程技术服 务有限公司合成。
3）PCR扩增反应
反应体系为20μL，其中10×PCR buffer 2.0μL、dNTP(10mM)1.6μL、MgCl2(2.5mM)1.2μL、Taq聚合酶(5U/μL)0.1μL、上游引物和下游引物(10μM)各0.5 μL、模板DNA 1.0μL、超纯水13.1μL。
4）PCR扩增程序
94°C预变性5min；30个循环：94°C 30sec、58°C 30sec、72°C 50sec；最 后72°C延伸5min。
5）PCR产物的鉴定
取4μL PCR产物用1.5%（重量/体积）琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色 后于凝胶成像系统根据扩增产物的大小判定结果。
结果
利用引物EFZZF/EFZZR以不同虫态的丽蚜小蜂基因组DNA为模板进行PCR 扩增。丽蚜小蜂的雌性成虫扩增出了287bp的目的条带（见附图2的1泳道）；同时 丽蚜小蜂的蛹、单头三龄幼虫和单粒卵也扩增出了287bp的目的条带（见附图2的 2、3、4泳道），说明我们所筛选的丽蚜小蜂的种特异性SCARPCR扩增引物的准确 性高。
实施例3：引物EFZZF/EFZZR对丽蚜小蜂检测阈值的测定
1）丽蚜小蜂模板DNA的制备
将单头丽蚜小蜂雌性成虫置于滴有20μL提取缓冲液(50mM Tris-HCl、lmM EDTA、1%SDS、20mMNaCl,pH 8.0)的parafilm膜上,以0.2mL的PCR管底部作为 匀浆器充分研磨，匀浆液以微量移液器移入1.5mL离心管；然后以200μL缓冲液分2 次清洗匀浆器，移入同一离心管，混匀，加入5μL蛋白酶K(20mg/mL)，充分混匀 后于60°C水浴1.5h(中途混匀1次)；然后沸水浴5min，加入220μL氯仿/异戊 醇（V:V=24:1）抽提液，轻柔混匀数十次后，冰上放置30min；4°C、12000r/min离 心20min，取上清液，加入440μL预冷的无水乙醇，轻轻混匀，待出现少量絮状沉 淀后于-30°C放置30min；4°C、12000r/min离心15min，小心弃去上清液。加 入500μL预冷的75%乙醇洗涤，4°C、12000r/min离心15min，小心弃去上清液； 然后将离心管倒扣于洁净滤纸上，自然干燥20min后每管加入20μL超纯水。原 模板溶液稀释为1/100头后以2倍进行递减梯度继续稀释至1/25600头，取1μL作为 PCR扩增的模板，直接加到PCR反应体系中。
2）检验丽蚜小蜂的特异性引物的合成
Primer EFZZF：5′-AATCGTCGTGTCAGGGAG-3′
Primer EFZZR：5′-GCCGTGGCGTTTAGTATG-3′由上海生工生物工程技术服 务有限公司合成。
3）PCR扩增反应
反应体系为20μL，其中10×PCR buffer 2.0μL、dNTP(10mM)1.6μL、MgCl2(2.5mM)1.2μL、Taq聚合酶(5U/μL)0.1μL、上游引物和下游引物(10μM)各0.5 μL、模板DNA 1.0μL、超纯水13.1μL。
4）PCR扩增程序
94°C预变性5min；30个循环：94°C 30sec、58°C 30sec、72°C 50sec；最 后72°C延伸5min。
5）PCR产物的鉴定
取4μL PCR产物用1.5%（重量/体积）琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色 后于凝胶成像系统根据扩增产物的大小判定结果。
结果
利用引物primer EFZZF/EFZZR做最低检出量的测定，以不同稀释倍数的丽蚜 小蜂基因组DNA为模板进行PCR扩增，能检测到的最低模板DNA浓度为1/1600 头雌性成虫（见附图3）。