本发明涉及含聚硫脲低聚物的药物制剂及使用方法。聚硫脲低 聚物是阴离子化合物，它尤其在抗人类免疫缺陷病毒活性方面是有 益的。并且因此使得这些低聚物可用于治疗获得性免疫缺陷综合症 (AIDS)。
本发明背景
为了发展对人类和动物病毒感染的治疗和治愈工作，目前，大 量研究正在进行中。人类AIDS和AIDS相关复征(ARC)的发病 率正以令人惊恐的速度显著增加。对于患AIDS的人来说，其五年 存活率是令人沮丧的并且由于感染使得免疫系统严重受损的AIDS 病人受到许多机会致病菌，包括Kaposis sarcoma和Pneumocystis carninii pneumonia的感染。还不知道怎样治愈AIDS并且通常的 治疗大多缺乏足够的有效证据，并具有许多不适宜的副作用。由于 对该病的恐惧，已引起社会对那些患病或怀疑患病者的排斥和歧 视。
在1990年10月31日发行的南非专利09/0094中已公开了一 种精制肝素，一种硫酸化多糖，通过相互作用结合到负责细胞认别 的病毒蛋白质上并且对宿主细胞感染提供有限的抑制作用。然而， 肝素引起某些副作用，明显的有出血和增加血凝时间以及血小板减 小。对于患有活动性出血，或患有血友病，紫癜，血小板减少症， 颅内内血，细菌性心内膜炎，活动性结核病，毛细血管通透性增加， 胃肠道溃疡性损伤，严重高血压，先兆流产或内脏癌的病人，禁忌 使用肝素。血友病患者尤其禁忌使用，而很多这样的个体是HIV 阳性。
很久以来已认识到，某些合成的水溶性聚合物表现出广泛的生 物活性〔R.M.Ottenbrite在“Biological Activities of Polymers” 中，Amer.Chem.Soc.Symp.Ser.,No.182,PP.205-220,eds.C.E. Carraher and C.G.Gebelein(1982)〕。尽管这种水溶性聚合物的 作用机理是未知的，一种假设为聚合物通过离子吸引结合到病毒的 膜上，因此使得病毒不能感染宿主细胞。不幸的是，这些聚合物极 端的毒性妨碍了它们的临床应用。这些聚合物也具有高分子量并且 不能通过肾膜。
通过合成低分子量(1,000-10,000)的脂肪族聚合物，已 经做了许多尝试来防止毒性的发生和排泄问题〔R.M.Ottenbrite 在“Biological Activities of Polymers”中，Amer,Chem.Soc. Symp.Ser.,No.182,PP.205-220,eds.C.E.Carraher and C.G. Gebelein(1982)〕。已经发现这些聚合物的毒性低，但抗病毒活性 大大降低。这些低分子量的脂肪聚合物可归类为“随机盘绕”聚合 物。由于骨架连接基团的柔韧性，使得这些聚合物具有不可预见的 构型。通常，将溶液中随机盘绕聚合物的构型描述为球形的。认为 这些随机盘绕聚合物的抗病毒活性降低是由于聚合物与病毒膜结 合亲和力低。
克服随机盘绕聚合物存在问题的一种方法是提供具有很少自 由度的刚性骨架的聚合物。
现已发现一些手性阴离子低聚物，它们抑制病毒的复制并无肝 素和已知聚合物所表现的副作用。这些阴离子低聚物具有有序的阴 离子间隔，具有刚性骨架并且是水溶性的。在1991年6月10日提 交的共同未决的美国专利申请710,370和1991年7月8日提交 的相应的PCT申请PCT/US91/04804中，已作为多分散混合物描 述了这种阴离子低聚物，将其中公开内容引入本文供参考。在 1992年1月9日提交的美国专利申请818,753中作为窄的多或单分 散低聚物描述了这种阴离子低聚物，将其中公开内容引入本文供参 考。
在同时提交的一申请中，描述了某些具有刚性骨架并且具有很 少自由度的非手性阴离子聚脲低聚物。
在1956年7月31日发布的比利时专利544,868中已经公开 了某些聚硫脲具有抗病毒活性。
本发明概要
现已发现，聚硫脲低聚物具有抗人类免疫缺陷病毒活性并且因 此可用于治疗AIDS和ARC。该低聚物包括其可药用盐。
因此，本发明涉及水溶性、刚性骨架的聚硫脲低聚物，它包含 下式所示化合物衍生的重复部分：
H2N-X-NH2 (Ⅰ) 其中X为至少由一个磺酸基取代的二价芳香亚烃基。
本发明的低聚物在阴离子性磺酸基之间具有有序的阴离子间 隔。低聚物的数均分子量Mn小于10,000。 本发明详细描述
由下式表示本发明低聚物： 其中R为H,C1-C4烷基，苯基，或由0-2个R1基团和不超 过3个独立地选自氯或溴原子，或C1-C4烷基的取代基取代的苯 基；R1代表-SO3R2,-CO2R2,-PO3R2，或-OPO3R2；R2为H或在药学上适用的阳离子；R3为-R或-X-NHR，其中 R如上定义；X代表 Y代表-CO2-,-C≡C-,-N=N-， m为整数0或1，前提条件是，当m=0时，R1为氢原子，并且n 为3-50的整数。
如下为式Ⅰ优选的条件：
R和R3为4-甲基苯基；
m为1；
n为3-15；并且
X代表
术语“在药学上适用的阳离子”指适宜药用的阳离子。在为获 得需要的效应而给予的剂量下基本无毒并且不单独具有明显的药 物活性的那些阳离子包括在术语“在药学上适用的阳离子”范围 内。例如这些盐包括碱金属如钠和钾；碱土金属如钙和镁；铵；ⅢA 族轻金属包括铝；和有机伯、仲和叔胺如三烷基胺，包括三乙胺， 普鲁卡因，二苄胺，N,N’-二苄基乙二胺，二氢枞胺，N-(C1-C4)烷基哌啶和其它适宜的胺的盐。钠和钾盐是优选的。
术语“药学上适用的”指适于温血动物尤其是人类给药，并包 括非毒性的，例如适于药用并对温血动物无毒的。通过常规的离子 交换方法或通过用适宜的碱处理R1酸来制备本发明低聚物的药学 上适用的阳离子。
当本发明低聚物不是用作药物时，可使用不适于药用的其它 盐。该其它盐包括钡，锌和钛盐。
“有序间隔”或“阴离子基团间的规则间隔”指在聚合物的骨 架中阴离子磺酸基以所使用的起始物试剂决定的间隔出现，并且阴 离子基团的出现率可预控制。尽管不希望受任何理论的约束，但相 信该低聚物的磺酸基是结合到HIV和/或细胞膜上的部分并因此干 扰病毒的复制能力。
本文所使用的术语“低聚物”包含所有可能的n值，例如3 -50。优选的低聚物为n等于整数3-50，优选3-20，更优 选3-15的线性低聚物。当然，n值直接与得到的低聚物的分子 量相关。为了通过肾排泄膜，必需使这些低聚物的分子量足够低， 但又能够抑制HIV病毒。通过试剂的化学计算来控制平均分子量。 数均分子量(Mn)＜10,000，优选约500-10,000，并且最优选 约1,000-6,000。
对于本发明的目的，认为本文所述的低聚物和其在生理上适用 的盐是等同的。在生理上适用的盐指那些碱盐，其中的碱至少与R1 基的一个酸基形成盐并且当按本文所述的方法给药时不引起明显 的不良生理作用，例如，适宜的碱包括碱金属和碱土金属的氢氧化 物，碳酸盐和碳酸氢盐，如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸 钾、碳酸氢钠、碳酸镁等等；及氨，伯、仲和叔胺等等。特别优选 的碱是碱金属氢氧化物，碳酸盐和碳酸氢盐。通过常规的离子交换 方法或通过用适宜的碱处理R1酸可制备在生理上适用的盐。其它 盐的实例已在本文中描述。
本发明制剂是固体或液体剂型。这些制剂可以是药盒形式，这 样在使用前适宜的时间将组分混合。无论预先混合好或作为药盒形 式，通常该制剂都需要药学上适用的载体或佐剂。
本发明低聚物在水中和盐溶液中是可溶的，尤其在生理PH下 和在盐水溶液中是可溶的。因此本发明低聚物易于制成适宜的水性 药物剂型。给予本发明低聚物制剂后，低聚物在体内保持可溶性。
通过用挥发性弱酸的碱金属盐处理可将低聚物的挥发性胺的 铵盐溶液转化为更优选的学上适用的盐，如钠或钾盐。当通过蒸发 或冻干来浓缩溶液时；可除掉胺和弱酸，并且以碱金属盐分离低聚 物。在步骤中可转化的铵盐的实例为氨，单乙胺，三乙胺，三甲胺 或二甲胺的盐(本文称作“铵盐”)。碱金属盐的实例为钠或钾的 氢氧化物，碳酸氢盐，醋酸盐，甲酸盐或丙酸盐。 阴离子低聚物的制备
用两种方法来制备阴离子低聚物。第一种方法产生低聚物的多 分散混合物的非特异性方法，它包括将二胺与硫脲前体如硫光气或 硫代羰基二咪唑结合。可有可无的是单官能团封端剂，控制反应 PH的酸中和剂，和水不混溶溶剂。也描述了一种方法，利用单官 能团胺反应性试剂，或通过将未封端聚合物与含胺单官能团封端剂 和硫脲前体结合，将带有胺端的未封端的聚硫脲转化为封端的聚合 物。
第二种方法包括，通过连续加入双异硫氰酸酯和二胺，逐步增 加聚合物链。尽管该方法更费时，但得到具有窄分散度的聚硫脲。
如下进一步说明制备聚硫脲的方法。
二胺：本发明二胺主要是芳香族的，具有前面所描述的化学 式。该二胺至少被一个在中性条件下带电的基团取代，优选磺酸。 单价脂肪族取代基是容许的。可以使用一小类将芳香基连在一起的 脂肪族连接基，如反式取代的乙烯和乙炔。优选的二胺为其中碳- 氮键相平行的那些，如2,5-二氨基-1,4-苯二磺酸，4, 4’-二氨基-(1,1’-联苯)-2,2’-二磺酸，反式-2,2’ -(1,2-乙烯二基)双(5-氨基苯磺酸)和2,5-二氨基 苯磺酸。
硫脲前体：可以使用各种硫脲前体或双官能团亲电子试剂如硫 光气(二氯硫化碳)，二溴硫化碳和其它脲的前体如硫代羰基二咪 唑，六氯丙硫酮，Cl3CSCO2CCl3,CCl3CSCl，和Cl3OCSCl。
酸中和剂：可以使用各种有机碱，如碱金属或二价金属的氢氧 化物，碳酸盐，碳酸氢盐，磷酸盐。在加入二官能团的亲电子试剂 前加入所有的碱时，具有缓冲能力的酸中和剂是优选的。可以使用 有机碱如三烷基胺，但不是优选的。
单官能团封端试剂：可以使用各种分子量限定试剂。该试剂可 以是与二胺或二官能团亲电子试剂反应的脂肪族或芳香族化合 物。适宜的单官能团试剂的实例为胺如苯胺，甲苯胺，甲胺，乙胺， 丁胺，二乙胺，氨和N-甲苯胺。单官能团胺反应性试剂的实例为 苯甲酰氯，甲基苯甲酰氯，乙酰氯，异氰酸甲酯，异硫氰酸甲酯， 并氰酸苯酯，异硫氰酸苯酯，异硫氰酸对甲苯酯和氯甲酸苯酯。这 些封端试剂也可以含带电荷的取代基，例如2-磺基苯酚钾或4- 磺基苯胺钾。
其它添加剂：加入表面活性剂是不必要的或不优选的，并且可 能使分离过程复杂化。
溶剂：在反应温度下，当二官能团亲电子试剂是液体时，单一 的溶剂-水是优选的。这种二官能团亲电子试剂的实例为硫光气。 当使用固体、水不溶性反应物时，需要少量水不混溶性共溶剂。该 水不混溶性共溶剂的实例为氯仿，四氯化碳，甲苯和二氯甲烷。典 型地，有机溶剂与水性溶剂的比率为0到1。优选0到0.1。
在允许反应进行的温度下，典型地为0-100℃下进行反应。 优选反应温度为0-25℃，当使用硫光气时，充分搅拌是重要的。 在手工操作的简单的玻璃装置MixxorTM中可进行小型实验室规模 的试验，其中可通过狭窄的管道使反应物来回流动。压力是不重要 的并且典型地使用大气压。为保证最适的反应过程，必须小心地维 持反应的PH。一种考虑是，在小于4的酸性PH值条件下，带电 荷的二胺具有有限的溶解度。在低PH(＜6)下反应也是很慢的， 同时在高PH(＞10)下，二官能团亲电子试剂受氢氧化物或其它碱进 攻而不稳定。在高PH下聚硫脲也可以发生降解。优选PH保持在 6-9之间。
当使用非封端试剂时，可通过小心地调节反应物的化学计量或 通过使用第二种操作来控制分子量。二胺或二官能团亲电子试剂都 可以过量使用，例如过量1-100％摩尔。这种化学计量法必须考 虑任何在与二胺反应前通过水解破坏的二官能团亲电子试剂。例 如，当在高PH下使用硫光气时，要求用大量过量的硫光气来补偿 与破坏它的氢氧化物的快速反应。由于该副反应的程度难于控制， 优选使用单官能团封端试剂来控制分子量。当使用第一种方法时， 尽管可使用所提到的技术来控制数均分子量，但产物是具有某种分 布形式的几种分子量聚合物的混合物。
反应物的加入顺序是不重要的。然而，优选顺序是先加入二官 能团亲电子试剂。当使用非缓冲剂性的酸中和剂时，如氢氧化物， 最优选的方法是开始先加入一部分以便获得需要的PH，然后其余 部分与二官能团亲电子试剂同时加入。
浓度是不重要的，可以为0.5-50wt％，(以二胺的重量与 溶剂的重量比表示)。优选的范围为0.5-5wt％。
下面描述为生产具有窄分散度聚硫脲所设计的第二种方法。在 该方法中，链长每次增加两个重复单位，重复这种二步循环。为了 说明，考虑起始物质是简单的二胺的情况(在上式中‘n’=0)。 用硫脲前体如硫光气将二胺转化为双-异硫氰酸酯(在中式中 ‘n’=0)。用过量的二胺处理双-异硫氰酸酯，得到具有2个 重复单位的硫脲低聚物(在下式中‘n’=2)。为了增加链的长 度，按0,2,4,6等等的顺序重复该系列操作。
在该方法中，每步的条件与上述产生多分散聚硫脲的第一种方 法中所描述的条件相似。主要的区别在于在前面的方法中，反应物 的化学量接近1∶1。在该方法中，加入大量过量的试剂(在第一 步中的硫脲和在第二步中的二胺)。增长链与所加入试剂的摩尔比 大致为1∶3-1∶50，优选的范围为1∶5-1∶10。
在任何步骤，都不必将生长的链分离出来。优选的方法是用过 量的硫脲前体将二胺(或具有胺端的低聚物)处理足够的时间，以 便将胺端全部转化为异硫氰酸酯。然后，通过萃取到与水不混溶的。 溶剂如二氯甲烷中，除去过量的硫脲前体。用过量的二胺处理双- 异硫氰酸酯的水溶液。然而，按照实施例中所描述的一个具体例子 中所做的那样，将双-异硫氰酸酯分离是可能的。
可通过在与水混溶但对于产物是不良溶剂的溶剂中沉淀反应 溶液来分离产物。该溶剂的实例为丙酮，甲醇，乙醇，异丙醇。 制剂及其使用方法
可使用抗HIV的阴离子低聚物来抑制被HIV-I病毒或其它 相关的、具有gp120表面蛋白的病毒感染的细胞中合胞体的形成。 可使用抗HIV的阴离子低聚物来治疗AIDS和ARC以及其它由逆 转录病毒HIV-I或其它具有gp120表面蛋白的相关病毒所引起的 疾病。
抑制HIV感染细胞中合胞体形成所必需的抗HIV阴离子低聚 物的量可以是任何有效的量。通过实验测定发现，当使用浓度为 10μg/ml的水性制剂时，抗HIV的阴离子低聚物可完全抑制合胞体 的形成，以及将P24抗原(病毒复制指示剂)的量减小到300pg/ml 以下。治疗AIDS或ARC或其它由HIV感染引起的疾病时所给予 的抗HIV阴离子低聚物的量可根据所使用的特定剂量单位，治疗 历时，病人的年龄和性别，疾病的性质和程度，和医学领域的人员 所公知的因素，在较宽的范围内变化。而且，抗HIV低聚物可以 与已知用于治疗逆转录病毒疾病的其它药物和已知用于治疗与逆 转录病毒引起的疾病有关的症状和并发症的药物联合使用。
根据本发明，所给予的抗HIV阴离子低聚物的抗HIV有效量 通常为病人体重的约0.1mg/kg到500mg/kg，并且每天可给予一次 或多次。
可使用常规剂量单位形式，口服或非肠道给予抗HIV阴离子 低聚物和药用载体。
对于口服给药，可将抗HIV阴离子低聚物制成固体或液体制 剂如胶囊剂，丸剂，片剂，糖锭剂，锭剂，含片(melt)，粉剂， 溶液，悬浮液或乳浊液。固体单位剂量形式可以是普通的硬或软壳 明胶型的胶囊，它包含例如表面活性剂，润滑剂和惰性填充剂如乳 糖，蔗糖，山梨糖醇，磷酸钙和玉米淀粉。在另一实施方案中，本 发明阴离子低聚物可以用常规的片剂基质如乳糖、蔗糖和玉米淀粉 与赋形剂结合制片，所述赋形剂包括粘合剂如阿拉伯胶，玉米淀粉 或明胶；给药后有助于片剂崩解和溶解的崩解剂如马铃薯淀粉，藻 酸，玉米淀粉和胍耳胶；改善片剂颗粒的流动并抑制片剂原料粘着 到片剂冲摸和冲头表面上的润滑剂，例如滑石粉，硬脂酸或硬脂酸 镁、钙或锌，增强片剂的美观并使得它们更易于被病人接受的染 料、着色剂和矫味剂。在口服液体剂量形式中所使用的适宜的赋形 剂包括稀释剂如水和醇，例如乙醇，苯甲醇和聚乙二醇，和(或不) 加入药学上适用的表面活性剂，悬浮剂或乳化剂。
本发明抗-HIV阴离子低聚物可以以在生理适用稀释剂和药 物载体中阴离子低聚物的可注射剂型通过非肠道途径，即皮下、静 脉内，肌内或腹膜内给药，其中所述稀释剂和载体可以为无菌液 体或液体混合物如水，盐水，葡萄糖水溶液和相关的糖溶液，醇如 乙醇，异丙醇或十六醇，二醇如丙二醇或聚乙二醇，油酮缩醇如2， 2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-甲醇，醚如聚(乙二醇)400， 油，脂肪酸，脂肪酸酯或甘油酯，或乙酰化的脂肪酸甘油酯，其中 加入(或不加入)药学适用的表面活性剂，如皂或洗涤剂，悬浮剂 如果胶，carbomers，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，或羧甲基 纤维素，或乳化剂和其它药物佐剂。
可用于本发明非肠道制剂中的油的实例为来源于石油、动物、 蔬菜或合成油的那些油，例如花生油、豆油、芝麻油、棉子油、玉 米油、榄橄油、凡土材和矿物油。适宜的脂肪酸包括油酸，硬脂酸， 异硬脂酸。适宜的脂肪酸酯例如为油酸乙酯和肉豆蔻酸并丙酯。适 宜的皂包括脂肪酸的碱金属、铵和三乙醇胺的盐，适宜的洗涤剂包 括阳离子洗涤剂，例如二甲基二烷基卤化铵，烷基卤化吡啶鎓和烷 基胺乙酸盐；阴离子洗涤剂，例如烷基、芳基和烯属磺酸盐，烷基， 烯烃、醚和单甘油酯硫酸盐和磺基琥珀酸盐；非离子型洗涤剂，例 如脂肪族胺氧化物，脂肪酸链烷醇酰胺，和聚氧乙烯聚丙烯共聚 物；和两性洗涤剂，例如烷基-β-氨基丙酸酯，2-烷基咪唑啉 季铵盐及其混合物。典型地，本发明非肠道给药组合物溶液将包含 约0.5-25％(重量)的抗HIV阴离子低聚物。也可有利地使用 防腐剂和缓冲剂。为了减少或消除注射部位的刺激，该组合物中可 以包含具有约12-17亲水亲油平衡值(HLB)的非离子型表面 活性剂。在该制剂中，表面活性剂的量约为5-15％(重量)。 表面活性剂可以是具有上述HLB的单一组分或者可以是两种或多 种组分具有所需HLB的混合物。在非肠道给药制剂中所应用的表 面活性剂的实例为聚乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯类，例如，脱水山梨 醇单油酸酯。
本发明阴离子低聚物也可以用于预防，即预防病毒从感染个体 传染给未感染个体。病毒不但通过血液交换成比例地传播，而且也 可以通过其它体液交换传播。因此，可以将本发明阴离子低聚物配 制成标准的洗涤剂产物供洗涤用，尤其供处理感染个体血液产品的 研究室和临床实验室以及医院使用。含有本发明低聚物的制剂可用 于洗涤医疗/手术设备和器皿以及卫生工作者的手和其它皮肤区 域。本发明低聚物也可以以液体或粉剂的形式由避孕用具的使用者 或者在出售前由生产者应用于避孕用具如避孕套的表面。本发明低 聚物也可以配制成灌洗组合物供女性在与感染个体进行性接触前 后使用。本发明低聚物也可以制成润滑剂和使精子成酸性的凝胶剂 和洗液。最后，本发明低聚物可配制为组合物，加到热浴盆、旋涡 浴和游泳池中灭活可能存在的病毒活性。
本发明可以由下列实施例进一步说明，其中所述实施例仅为本 发明的范例。 定义
除非另有说明，如下定义本发明实施例中所使用的术语，而且 举出适宜的装置或树脂的例子，但也可以使用类似的装置或不同的 参数或树脂：
TCID50-组织培养感染剂量，即在感染后7天使50％细胞 感染有效的培养液的量(50％细胞致病作用)
MTT-四唑鎓还原剂；
3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑 鎓溴化物；
RPMI=一种细胞培养基；
RF和GB8指HIV-1病毒株；
MT4,C8 166和TM为细胞系；
P24 test-Abbott指用通常由Abbott销售的检测试剂盒来测 定病毒核心抗原的试验。
实施例1A 用特定的方法制备聚硫脲 制备双-异硫氰酸酯
将4,4’-二氨基联苯-2,2’-二磺酸(1.2g,3.48mmol) 与15ml水和600μL硫光气一起剧烈搅拌3小时。另外加入硫光气 (250μL)，并将反应物再搅拌14小时。通过用中等孔率的烧结 玻璃过滤漏斗过滤来分离产物，得到70mg不溶性单体残渣。在大 约10mmHg下和低于50℃下，蒸发澄清的红紫色滤液，真空干燥 3小时，得到1.35g,31.5mmol双并硫氰酸酯二水合物的淡紫色， 易潮解固体。通过质子和碳核磁共振及燃烧分析来确定产物的特 性。 制备未封端的聚硫脲
将过量4,4’-二氨基联苯-2,2’-二磺酸(6.0g, 46.5mmol)与2当量NaHCO3(8.2g,97.6mmol)混合，使PH升至 7.5.在10分钟内，向该搅拌的溶液中加入以上制备的双-异硫氰 酸酯(2.17g,4.67mmol,PH 1.5)的溶液(30ml)。加完后， PH降至6.5并且将反应物搅拌14小时。然后用12M HCl将PH调 至1.8，并在8小时后将形成的白色固体过滤，并用25ml冷的0.1M HCl洗涤。将固体真空干燥，得到12.0g来反应起始物(4,4’- 二氨基-联苯-2,2’-二磺酸)的白色固体。蒸发滤液，得到 10.0g暗紫红色固体。通过光谱学方法鉴别该滤液为几乎纯的聚硫 脲(Ⅱ,n=0，有少量起始二胺(4,4’-二氨基-联苯-2， 2’-二磺酸)和NaCl污染)。 未封端聚硫脲的纯化
让115g Pharmacia Sephadex_G-10(40-120μm大小的珠状物) 树脂在大约500ml蒸馏水中膨胀1小时，准备凝胶过滤柱。将悬浮 液在1L量筒中沉降后，从树脂混合物中倾析澄清液。将玻璃柱用 树脂按淤浆填充法填充并且将500ml蒸馏水通过柱子，得到2.5× 50cm的树脂床。使用Gilson Minipuls蠕动泵保持恒定的流速通过 柱子(流速大约为3-4ml/min)。在310nm(lsco型UA-5 紫外检测器监测洗脱液中产物的存在。
将上述制备的50mg聚硫脲低聚物溶解在2.5ml蒸馏水中并小 心地加到柱子的顶端。用蒸馏水洗脱柱子并收集三份产物流份(每 份15ml)。通过HPLC分析流份表明第一流份中含聚硫脲，其中 不含起始物二胺和盐。 实施例1B-按照非特异性方法，用硫光气来制备未封端的聚硫脲
将4,4’-二氨基联苯-2,2’-二磺酸样品(100mg, 0.29mmol)加到50mL水中并缓慢加入大约4ml 0.1M NaOH来溶 解固体。溶液的PH升至6.8。将该溶液加到MixxorTM(便于不混 溶液体充分混合的装置)中，并加入2.21ml(0.29mmol的硫光气) 硫光气(100μL)在100ml氯仿中的贮备液。混合2分钟后，通 过加入大约2.5ml 0.1M NaOH将溶液的PH调至6-7。在45 油浴中，将溶液加热16小时，并蒸发掉溶剂。通过HPLC分析生 成物固体表明产生了聚硫脲低聚物的混合物。
实施例1C 用硫羰基-二味唑来制备未封端的聚硫脲
将重结晶的4,4’-二氨基联苯-2,2’-二磺酸(1.00g, 2.91mmol)加到50ml水中形成淤浆，然后加入硫酸氢钠(489mg, 5.82mmol)。当固体溶解时，生成物的PH达到6.5。在剧烈搅拌 下，将硫羰基二咪唑(600mg,3.37mmol,Aldrich Chemical Co.) 加到搅拌的溶液中，产生亮黄色。在5分钟内，颜色褪去并将反应 物搅拌24小时。此时，通过HPLC观察到的低聚物的分布不随时 间而变化。真空(T=35℃)蒸发溶剂，得到1.8g粗品硫脲低聚 物，通过HPLC发现该低聚物所含的最大组分为n=4(n=4时， 在254nm处，面积为9.9％)。 从未封端的低聚物制备封端的聚硫脲低聚物
将如上所述制备的未封端的聚硫脲低聚物(400mg)溶解在 15mL水中。用5％盐酸将PH调至4.5。在搅拌下，加入硫羰基 二咪唑(100mg,Alcrich Chemical Co.)并且搅拌15分钟后获 得PH6.6.HPLC分析表明将低聚物的分布变为一系列更亲脂性 的物质(终端异硫氰酸酯)。加入甲苯胺(80mg)立即形成白色 沉淀(甲苯胺硫脲)。将淤浆搅拌20分钟(PH为7.0)后，将溶 液过滤并将母液蒸发(10-1mm,35°)，得到537mg对甲苯 胺封端的聚硫脲低聚物。HPLC分析表明有少量前体异硫氰酸酯 封端的物质(甲苯胺封端物质是更亲脂性的并且在更长的滞留时间 进行系列洗脱)。 未封端聚硫脲低聚物的分级
将上述制备的粗品-未封端的聚硫脲(500mg)溶解在2ml 水中，并将溶液加到26mm×90cm大小的G-10排阻凝胶柱上 (Pharmacia)。通过HPLC分析收集到的流份(20ml)，估计 最初两个具有紫外活性的流份(254nm)含n=7.2。将这些合并 并蒸发，得到140mg数均分散度n=7.2的产物(通过1H NMR 分析末端基团法来测定)。结构与13C和1H NMR分析结果一致。 生物资料
实施例Ⅰ 用TM细胞和GB8病毒株证明抗HIV低聚物防止合胞体形成和 P24病毒核心抗原表达的能力
为了显示本发明的低聚物阻断HIV感染，将CD4+T细胞 (JM)暴露于HIV-I的GB8株GB8。病毒先与低聚物保温15 分钟，然后加入细胞．吸附2小时后，去除病毒接种物，将细胞洗 涤三次以除去痕量病毒，然后细胞在化合物存在下培养。培养3天 后测定抗病毒活性，将四份培养物中所见合胞体的平均数与阴离子 低聚物或其它试验化合物的浓度对数(log10)作图。还通过测定 上清液中病毒核心抗原(P24 test-Abbott)测定了低聚物的效力。 肝素、硫酸葡聚糖、rs CD4、ATZ和/或ddC数据(当包含于下 列任一表中时)，作为阳性对照。
表Ⅰ 化合物 EP50(μg／ml)+ 实施例1C，未封端的 1.9 实施例1C，封端的 0.46
+抑制GB8病毒株引起的JM细胞中HIV-I诱导之合胞体 形成达50％时的有效剂量。 用MT-4细胞和RF病毒株测定抗-HIV低聚物抑制HIV诱导 的细胞死亡的能力
在该试验中，向每个试管中加入1.5ml RPMI培养基以溶解试 验化合物。然后通过在微量滴定板上将溶液稀释二倍来测定化合物 的HIV-I活性。每个孔中加入5×104个细胞和100 TCID50单 位的病毒，并将滴定板在37℃下孵育7天。将MTT加入每个孔中， 并将滴定板再孵育2小时。用酸性异丙醇将蓝色的甲 结晶溶解， 并在540nm测定吸收度。
下表Ⅱ显示得到的数据。 表Ⅱ 化合物 ED50(μg/ml)+ CD50(μg/ml)* 实施例1C 未封端的 5.1 ≥100 实施例1C 封端的 8.5 ≥100
+在MTT测定中，对HIV-1诱导的MT-4细胞死于RF 病毒株感染产生50％抑制作用的有效剂量。
*在MTT测定中，对MT-4细胞产生50％毒性的化合物的 细胞毒性剂量。 抗-HIV低聚物对C8166 T细胞系中HIV-IRF生长的作用 实验方法：在室温下，用HIV-IRF将C8166细胞感染1小时。然 后在RPMI中将细胞洗涤两次并分配到组织培养板的孔中，其中各 孔中含不同浓度的试验化合物或无试验化合物(对照)。在37℃ 下孵育3天后，观察细胞中合胞体的含量并且用ELISA测定不含 细胞的上清液中P24病毒核心抗原的水平。结果示于下表Ⅲ和Ⅳ 中。
表Ⅲ 化合物 浓度 μg/mL 合胞体 P24 (pg/mL) 对照的 百分数 实施例1C 未封端的 100 10 1 0.1 0.01 0 + ++ +++ +++ 无 55950 241460 508610 376670 0 14 59 ＞100 93 实施例1C 封端的 100 10 1 0.1 0.01 0 0 +/++ ++ +++ 无 无 150668 389080 435450 0 0 37 96 ＞100
表Ⅴ 化合物 ED50(μg/ml)+ 实施例1C 未封端的 1.6 实施例1C 封端的 0.6
+在RF病毒株感染的C98166细胞中，对HIV-1诱导的合 胞体和P24病毒抗原水平产生50％抑制作用的有效剂量。