技术领域 本发明涉及生物技术领域中生物体转化技术。即将GAFP基因的表达载体通过花粉 管通道法或者农杆菌介导法导入白棉或彩色棉花，通过目的基因GAFP的表达，赋予转基因棉 花抗枯萎病和黄萎病的特性。
背景技术 枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum)和黄萎病菌(Vecticillium dahliae kleb)引起的棉花枯萎病和黄萎病是棉花生产中最主要的两种真菌病害，广泛分布在 世界各主要产棉国，并有逐年加重的趋势。尤其是黄萎病，侵染后造成蕾铃大量脱落，导致 减产达20％-60％，且纤维的品质下降。据不完全统计，我国棉花黄萎病的发病率在300万公 顷以上，并且呈逐年加重的势头。目前，选育和种植抗病新品种仍是防治棉花枯萎病和黄萎 病的主要措施，但由于棉花中本来就缺乏抗黄萎病的突变材料，通过常规育种的方法很难选 育出高抗黄萎病的品种，迄今尚无有效的防治措施，因此，高抗品种的培育是迫在眉睫的任 务。
随着分子生物学、植物病理学和基因工程技术的迅猛发展，运用基因工程手段提高植物 的抗病性，为抗病育种开辟了一条全新的途径。天麻抗真菌蛋白GAFP是我国独立分离和鉴定 的抗真菌蛋白，是由胡忠最早在1988年从传统中药天麻中提取到的一种具有广谱抗真菌活性 的蛋白，也是天麻中的重要功能蛋白质。它对许多植物致病菌包括棉花枯萎病菌和黄萎病菌 离体具有很强的抑制作用，在植物抗真菌基因工程上具有巨大的应用潜力。我们已经将它的 基因转入新疆彩色棉品种中，获得了高抗黄萎病转基因彩色棉花植株，经过选育和扩繁，转 基因彩色棉具有稳定的、较强的抗真菌病能力，证明了基因工程的方法是获得抗病品系的一 条有效的途径。
附图说明 GAFP棉花组成型高效表达载体与GAFP棉花真菌诱导型高效表达载体的载体结构 图。
发明内容 本发明的目的是：将构建的GAFP基因的表达载体转入不同的棉花优良品种，通过 对转化后代的筛选，获得的转基因棉花具有了抗棉花枯萎病和黄萎病的特性，经过进一步的 选育，可以育成抗真菌病的转基因棉花品系。
本发明主要包括以下七方面的技术：
一、GAFP棉花组成型高效表达载体的构建技术；
二、GAFP棉花真菌诱导型高效表达载体的构建技术；
三、GAFP表达载体花粉管通道法转化棉花的技术；
四、GAFP表达载体农杆菌介导法转化棉花的技术；
五、转化棉花后代的筛选技术(一)幼苗期卡那霉素或除草剂筛选；
六、转化棉花后代的筛选技术(二)病圃筛选；
七、转化棉花后代的筛选技术(三)分子检测；
具体实施方式
实施例1
GAFP棉花组成型高效表达载体的构建技术
棉花表达载体pBI35Sgafp-bar的构建过程为：用XbaI和SacI分别酶切pBI221和 pUC-gafp，将切下的.gafp片段连接到切去1.9Kb GUS片段的pBI221载体上，得到中间载体 pBI35Sgafp，然后从HindIII酶切位点处连上用同样酶切从pBI221-bar上切下的bar盒而成。 含有35S启动子、nos终止子、gafp基因、氨苄青霉素抗性基因Ampr和除草剂抗性基因bar.
另外一个载体pBin35Sgafp来自pBI35Sgafp。用HindIII和SacI酶切pBI35Sgafp切下 35S-gafp片段，用同样酶切pBI121，切去GUS片段连入35S-gafp片段而得到载体 pBin35Sgafp，此载体与pBI35Sgafp-bar的差异在于两个抗性基因为卡那霉素抗性基因Kanr 和NPTII筛选标记基因，而不是Ampr和bar。表达载体详细结构见说明书附图图1.。
实施例2
GAFP棉花真菌诱导型高效表达载体的构建技术
GAFP基因的真菌诱导型启动子Fi由本实验室克隆。
棉花表达载体pBIFigafp-bar的构建过程为：用XbaI和SacI分别酶切pBIFi-GUS和 pUC-gafp，将切下的gafp片段连接到切去1.9Kb GUS片段的pBIFi载体上，得到中间载体 pBIFigafp，然后从HindIII酶切位点处连上用同样酶切从pBI221-bar上切下的bar盒而成。 含有Fi启动子、nos终止子、gafp基因、氨苄青霉素抗性基因Ampr和除草剂抗性基因bar.
另外一个载体pBinFigafp来自pBIFigafp。用HindIII和SacI酶切pBIFigafp切下 Fi-gafp片段，用同样酶切pBI121，切去GUS片段连入Fi-gafp片段而得到载体pBinFigafp， 此载体与pBIFigafp-bar的差异在于两个抗性基因为卡那霉素抗性基因Kanr和NPTII筛选标 记基因，而不是Ampr和bar。表达载体详细结构见说明书附图图2.。
实施例3
GAFP表达载体花粉管通道法转化棉花的技术
在开花的次日，按照每朵花0.1～0.2μg(10μl)质粒的量，采用微注射法(用微量加样器直 接将质粒注射入棉花的子房)和柱头滴加法(将质粒滴加到柱头上，让其自然吸收)。收获时， 将转化植株的棉铃单独采收，单独轧花，得到种子以备后续的检测。
实施例4
GAFP表达载体农杆菌介导法转化棉花的技术
农杆菌感受态的制备
●接种农杆菌LBA 4404单菌落于50ml YEB培养基(含有30μg/ml链霉素)中，28℃振 荡培养，转速为200～250rpm，至OD600为0.3～0.5左右，冰浴30分钟，5000rpm离心 10分钟，收集菌体并用10ml 0.15M NaCl悬浮。
●4℃离心(同上)，菌体悬浮于1ml 20mM CaCl2溶液中。
●取50μl菌液分装到1.5ml离心管中，液氮迅速冷冻，并保存于-70℃冰柜中。 农杆菌的冻融转化法
●取0.5～1μg DNA加入到50μl的感受态菌液中，轻轻混合，冰浴30分钟，并在液氮中迅 速冷冻1分钟。
●在37℃水浴融化后，加入1ml YEB培养液，28℃轻轻摇动2～4小时。
●5000rpm离心，倒去大部分上清液，剩200μl培养液悬浮。
●涂布在含有30μg/ml链霉素和50μg/ml卡那霉素的YEB固体培养基上，28℃培养。长出 的菌落用碱法提取质粒，进行酶切鉴定。
农杆菌介导的转化法
●挑取GAFP表达载体的农杆菌单菌落，接种于20ml含50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平 和30mg/L链霉素的YEP培养基中，28℃、280rpm过夜培养至OD600为0.7～0.8。5000rpm 离心，用MS液体培养基重新悬浮，与棉花愈伤组织共侵染10分钟。
●将愈伤组织用无菌吸水纸吸干，放置于MS培养基上，暗培养2～3天后，用无菌水将外 植体洗净，转到含有100μg/ml头孢霉素，75μg/ml卡那霉素的分化培养基中，在12小 时光照，12小时黑暗的条件下，继续培养至分化出小芽。
●待芽长到1～2cm后，用无菌剪刀和镊子将分化的芽剪下，插到生根培养基中，继续培养 4周左右，移栽到土壤中。
实施例5
转化棉花后代的筛选技术(一)幼苗期卡那霉素或除草剂筛选
在转化单株幼苗长出3～4片真叶时，对其进行了卡那霉素或除草剂Bastar叶片涂抹初 筛实验。除草剂Bastar和卡那霉素的浓度分别为0.1％(W/V)和1.0％(W/V)。涂抹5天后进行 观察，淘汰显症(叶片涂抹点变黄)单株后进行第二轮筛选，如此连续涂抹三次，选出三次 不显症单株，进入下一步筛选。
实施例6
转化棉花后代的筛选技术(二)病圃筛选
分别于蕾期(6月中下旬)、花期(7月中旬)和铃期(8月中下旬)逐株进行三次病情 调查，观察转化后代的抗病情况。采用成株期鉴定法，单株划分黄萎病的病情级别，发病程 度采用5级(0、1、2、3、4)分级法调查，用发病程度值的大小作为衡量抗病程度的一个指 标，筛选出抗病的单株。
0级：健株；1级：病株叶片有25％以下表现病状，叶片主脉间产生淡黄色或黄色不规则 病斑；2级：病株叶片有25％～50％表现病状，病斑颜色大部分变成黄色或黄褐色，叶片边缘略 有卷枯；3级：病株叶片有50％～75％表现病状，病斑颜色大部分成黄褐色，叶片边缘卷枯，有 少数叶片凋落；4级：全株叶片发病，多为褐色掌状枯斑，以致植株死亡。
感病对照按照下列公式计算病情指数：病情指数＝【(∑各级病级×相应病级发病株数)/ 调查总株数×4】×100
经过病圃筛选，转基因棉花对黄萎病与枯萎病的抗性显著提高，有16个株系高抗黄萎病， 5个兼抗枯萎病。
实施例7
转化棉花后代的筛选技术(三)分子检测
转化棉花后代的分子检测技术有PCR、Southern、和RT-PCR等。
采取入选棉花单株的新鲜幼嫩叶片，用CTAB法提取总DNA。
PCR检测 对转化棉花后代总DNA做模板，阳性对照为质粒pBI35Sgafp，阴性对照为非转 基因的棉花总DNA，以gafp基因的上下游引物5’＞ACG TCT AGA AGG GAT CGG TTG AAT＜3’； 和5’＞GAT CTC GAG GCC AGA AGC CGC CGC TGT＜来扩增，反应的总体积为20μl，程序为： 94℃ 3min，94℃ 40s，55℃ 30s，72℃ 40s，30个循环后，72℃延伸10min。反应结束后， 1.5％琼脂糖凝胶电泳检测结果。如果能扩增出了特异的387bp gafp基因的条带，则该样品 为候选的转基因植株。
Southern杂交 取不同样品的总DNA约10μg，用HindIII+SacI 37℃双酶切过夜，阴性 对照为非转基因的棉花总DNA，阳性对照为未酶切和经同样酶切的质粒pBI35Sgafp。琼脂糖 凝胶电泳检测后，将核酸电转移到尼龙膜上(BioRad公司Mini-3cells)，操作方法按照BioRad 公司使用说明。同样用α-32P-dCTP标记gafp基因为探针进行点杂交，标记方法、杂交系统和 洗膜及压片的方法参考文献(Sambrook，1989)。杂交阳性的样品则为正确的转基因植株，表 明gafp基因整合进了棉花基因组中。
RT-PCR检测 为了检测Southern阳性植株中gafp基因是否得到了表达，进一步进行 RT-PCR检测。用CTAB法提取待测样品的总RNA，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测后，使用Access RT-PCR试剂盒(Promega公司)进行一步法RT-PCR，操作的详细步骤参见试剂盒说明书。使 用的gafp上、下游引物的序列为：上游引物：5’＞ACG TCT AGA AGG GAT CGG TTG AAT＜3’； 下游引物：5’＞GAT CTC GAG GCC AGA AGC CGC C6C TGT＜3’。转基因植株扩增出了特异的 387bp gafp基因的条带，则该转基因样品中，gafp基因得到了正确的表达。
GAFP基因序列表(核苷酸序列和推导的成熟肽氨基酸序列)