技术领域
本发明涉及一类具有高效、抗癌谱宽、代谢稳定的抗癌药物先导化合物： N-取代苯甲基四氢吡啶连-5-取代吲哚及其制备方法和应用。
技术背景
癌症是人类的第一杀手，为当今世界死亡率最高的疾病之一。椐世界卫生组 织预计，我国现有癌症病人300多万，每年新发病160～200万人，并以3％速率 增加，且呈年轻化趋势。例如，血细胞癌症白血病，它好发于青少年，其发病率 排在青少年肿瘤的第一位，所以对人类的危害更为明显和突出。恶性肿瘤中的原 发性肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，由于我国HBV肝炎和相关肝炎后肝 硬化病人众多，致使肝癌的发病率和病死率明显高于世界平均水平，全球50％ 以上的肝癌发生在中国。乳腺癌和卵巢癌是女性最常见的肿瘤疾病，严重影响妇 女身心健康甚至危及生命。目前，除联合化疗外，大多数癌症缺乏特效的治疗手 段，仍采用多种细胞毒性药物联合化疗的方法来治疗。由于目前所用的化疗药物 多缺乏特异性，对正常细胞和肿瘤细胞具有几乎相同的杀伤作用，所以毒性较大， 特别是对那些高度增殖的组织细胞，如骨髓中的造血细胞、消化道细胞和生殖细 胞均有很强的杀伤作用。更棘手的是，大多数复发癌症患者的癌细胞常常对现有 的化疗药物产生耐药。
在我国“国家中长期发展纲要”中，将“重大新药创制”列为十六个专题之 一，这是国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键问题，也是保障人民健康和 国家战略安全的需要。近年来，我国政府不断加大投资和政策的引导，希望加速 我国创制新药的研究。然而，目前我国上市的抗癌新药，以及正处于临床前研究 中的候选药物数量极少，特别是具有我国自主知识产权的候选药物的数量就更 少。为此，寻找新型特异性高和毒性低的抗癌药物是目前面临的一大重要课题。
发明内容
本发明的目的在于提供一类具有高效、低毒、广谱、代谢稳定的抗癌药物先 导化合物：N-取代芳甲基四氢吡啶连-5-取代吲哚。
本发明的另一个目的是提供N-取代芳甲基四氢吡啶连-5-取代吲哚的制备方 法和应用。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明所述的N-取代苯甲基四氢吡啶连-5-取代吲哚，其结构式如式(Ⅰ) 所示：
式(I)中：
n＝1～2，n1＝1～2，n＝n1or n≠n1
R1＝CN，OMe，Me，Br
R＝H，4-Me，4-Cl，2-Cl，2-F，3，4-(OMe)2，3，5-F2
N-取代苯甲基四氢吡啶连-5-取代吲哚的制备方法，其具体步骤如下：
1)室温下，将0.04mol式(1)化合物溶于4mL甲醇溶液中，搅拌下滴加 入0.16mol丙烯酸甲酯和7mL甲醇的混合液中，反应体系温度不超过50℃。 滴加完毕后，再加热回流6～7h，回流温度为60～65℃，薄层色谱(TLC)跟踪反应 进程。待反应结束后，回收甲醇和未反应的丙烯酸甲酯，减压蒸馏，得到浅黄色 油状液体为式(2)化合物。
2)将0.04mol的式(2)化合物溶于20mL无水甲苯，搅拌下再滴入15mL 无水甲苯和0.122mol金属钠溶液中；滴加完毕后，回流5～7h；回流过程中，反 应体系逐渐变得粘稠，需加大搅拌速度，并将20mL无水甲苯分批加入到反应容 器中；反应结束后冷却至室温，加入10ml甲醇除去未反应完的金属钠，将混合 物用120mL 25％(质量分数)的盐酸溶液提取，油浴回流6～7h。冷却反应混合物， 搅拌下加入浓NaOH溶液中和至pH＝8.5，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，合并乙酸 乙酯层，用无水硫酸钠干燥，蒸馏回收乙酸乙酯，减压蒸馏剩余物质，得到淡黄 色油状液体为式(3)化合物。
3)将0.005mol 5-取代吲哚、5mL甲醇和甲醇钠(30wt％CH3OH溶液，5mL) 的混合液，冰水浴条件下搅拌加入0.01mol式(3)化合物和5mL甲醇的混合液。 滴加完毕后室温搅拌20～30min，然后在60～65℃条件下加热回流5～7h，有黄色 固体析出，薄层色谱(TLC)跟踪反应进程。待反应结束后，用无水乙醇洗涤固体， 用乙酸乙酯重结晶，得到目标物式(I)化合物。
所述的式(1)化合物为取代苄胺或取代苯乙胺。
式(Ⅰ)的合成反应方程式如下：
式中：n＝1～2，n1＝1～2，n＝n1 or n≠n1
R1＝CN，OMe，Me，Br
R＝H，4-Me，4-Cl，2-Cl，2-F，3，4-(OMe)2，3，5-F2
本发明所述的甲醇为分析纯。
本发明提供了一类具有高效、广谱、代谢稳定的抗癌药物先导化合物：N- 取代苯甲基四氢吡啶连-5-取代吲哚，结构通式为(Ⅰ)。制备方法为：以取代苯 甲(乙)胺和丙烯酸甲酯为原料，依次经过Michael加成，Dieckmann缩合，水 解脱羧等三步反应得到中间体N-取代苯甲(乙)基哌啶-4-酮，该中间体与5-取 代吲哚进行缩合反应制得目标物(Ⅰ)。化合物(Ⅰ)高效抑制人白血病K562， Jurkat，U937，THP-1细胞系；人食道癌ECA-109细胞系；人肝癌SMMC-7721细 胞系，人卵巢癌HO-8910细胞系，人乳腺癌MCF-7细胞系，乳腺癌MDA-MB-231 细胞系增殖；在人和大鼠肝微粒体中代谢稳定性较好；对CYP3A4、CYP 2D6、 CYP2C9、CYP1A2和CYP2C19等人肝微粒体的五种酶没有机制性抑制作用；通过 诱导细胞周期G2/M阻滞和促进癌细胞凋亡而抑制癌细胞的增殖。有着明显的开 发应用研究的前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明的技术特点。
通式(Ⅰ)的结构式见表1。
表1目标物(Ⅰa～Ⅰu)的结构式
目标物 R R1 目标物 R R1 Ⅰa Ph H Ⅰl 3，5-di(F)-Ph OMe Ⅰb 4-Cl-Ph H Ⅰm PhCH2- OMe Ⅰc 2-F-Ph H Ⅰn 4-F-Ph Br Ⅰd 2-Cl-Ph H Ⅰo 4-Cl-Ph Br Ⅰe 3，4-di(OMe)-Ph H Ⅰp 2-F-Ph Br Ⅰf PhCH2- H Ⅰq 2-Cl-Ph Br Ⅰg 4-Cl-Ph OMe Ⅰr 3，5-di(F)-Ph Br Ⅰh 4-Me-Ph OMe Ⅰs PhCH2- Br Ⅰi 2-F-Ph OMe Ⅰt 4-F-Ph CN Ⅰj 2-Cl-Ph OMe Ⅰu 4-Cl-Ph CN Ⅰk 3，4-di(OMe)-Ph OMe
1、实施例1～21：通式(Ⅰa～u)N-取代苯甲(乙)基四氢吡啶连-5-取代吲 哚的制备方法：
1)室温下，将0.04mol式(1)化合物(取代苄胺或取代苯乙胺)溶于4mL 甲醇溶液中，搅拌下滴加入0.16mol丙烯酸甲酯和7mL甲醇的混合液中，反应 体系温度不超过50℃。滴加完毕后，再加热回流6～7h，回流温度为60～65℃， 薄层色谱(TLC)跟踪反应进程。待反应结束后，回收甲醇和未反应的丙烯酸甲酯， 减压蒸馏，得到浅黄色油状液体为式(2)化合物。
2)将0.04mol的式(2)化合物溶于20mL无水甲苯，搅拌下再滴入15mL 无水甲苯和0.122mol金属钠溶液中；滴加完毕后，回流5～7h；回流过程中，反 应体系逐渐变得粘稠，需加大搅拌速度，并将20mL无水甲苯分批加入到反应容 器中；反应结束后冷却至室温，加入10ml甲醇除去未反应完的金属钠，将混合 物用120mL 25％(质量分数)的盐酸溶液提取，油浴回流6～7h。冷却反应混合物， 搅拌下加入浓NaOH溶液中和至pH＝8.5，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，合并乙酸 乙酯层，用无水硫酸钠干燥，蒸馏回收乙酸乙酯，减压蒸馏剩余物质，得到淡黄 色油状液体为式(3)化合物。
3)将0.005mol 5-取代吲哚、5mL甲醇和甲醇钠(30wt％CH3OH溶液，5mL) 的混合液，冰水浴条件下搅拌加入0.01mol式(3)化合物和5mL甲醇的混合液。 滴加完毕后室温搅拌20～30min，然后在60～65℃条件下加热回流5～7h，有黄色 固体析出，薄层色谱(TLC)跟踪反应进程。待反应结束后，用无水乙醇洗涤固体， 用乙酸乙酯重结晶，得到目标物式(Ⅰ)化合物。
2、制备获得的目标物(Ⅰa～Ⅰu)的数据表征如下：
实施例1 3-(N-苄基-1，2，3，6-四氢吡啶-4-基)-1H-吲哚(Ⅰa)
产率：75％；黄色结晶；熔点：180-182℃；1H NMR(400MHz，DMSO-d6) δ11.10(s，1H)，7.79(d，J＝8.0Hz，1H)，7.56-6.78(m，9H)，6.11(s，1H)，3.67(s，2H)， 3.02(s，2H)，2.65(t，J＝5.5Hz，2H)，2.49(s，2H)；IR(KBr)：3072，3067，2918，2842， 1657，1608，1580，1510，1310，1293，1102，940，820，760cm-1；Anal.calcd.for C20H20N2C％83.30，H％6.79，N％9.71；Found：C％82.15，H％6.90，N％9.80.
实施例2 3-(N-(4-氯苄基)-1，2，3，6-四氢吡啶-4-基)-1H-吲哚(Ⅰb)
产率：72％；黄色结晶；熔点：184-186℃；1H NMR(400MHz，DMSO-d6) δ11.02(s，1H)，7.72(d，J＝8.0Hz，1H)，7.43-6.80(m，8H)，6.02(s，1H)，3.49(s，2H)， 3.02(d，J＝2.7Hz，2H)，2.59(t，J＝5.6Hz，2H)，2.48(s，2H)；IR(KBr)：3072，3059，2920， 2852，1657，1604，1575，1510，1322，1287，1103，935，815，760cm-1；Anal.calcd.for C20H19ClN2 C％74.41，H％5.93，N％8.68；Found：C％74.55，H％6.01，N％8.50.
实施例3 3-(N-(2-氟苄基)-1，2，3，6-四氢吡啶-4-基)-1H-吲哚(Ⅰc)
产率：64％；黄色结晶；熔点：197-199℃；1H NMR(400MHz，DMSO-d6) δ11.12(s，1H)，7.78(d，J＝8.0Hz，1H)，7.49-6.87(m，8H)，6.02(s，1H)，3.50(s，2H)， 3.07(d，J＝2.7Hz，2H)，2.63(t，J＝5.6Hz，2H)，2.48(s，2H)；IR(KBr)：3086，3054，2923， 2850，1652，1600，1582，1520，1323，1270，1108，940，810，762cm-1；Anal.calcd.for C20H19FN2 C％78.40，H％6.25，N％9.14；Found：C％78.36，H％6.31，N％9.17.
实施例4 3-(N-(2-氯苄基)-1，2，3，6-四氢吡啶-4-基)-1H-吲哚(Ⅰd)
产率：62％；黄色结晶；熔点：187-189℃；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.04 (s，1H)，7.73(d，J＝8.0Hz，1H)，7.40-6.81(m，8H)，6.02(s，1H)，3.47(s，2H)，3.02(d，J＝ 2.7Hz，2H)，2.59(t，J＝5.6Hz，2H)，2.48(s，2H)；IR(KBr)：3072，3059，2920，2852， 1657，1604，1575，1510，1322，1287，1103，935，815，760cm-1；Anal.calcd.for C20H19ClN2 C％74.41，H％5.93，N％8.68；Found：C％74.55，H％6.01，N％8.50.
实施例5 3-(N-(3，4-二甲氧苄基)-1，2，3，6-四氢吡啶-4-基)-1H-吲哚(Ⅰe)
产率：60％；黄色结晶；熔点：216-218℃；1H NMR(400MHz，DMSO-d6) δ11.10(s，1H)，7.80(d，J＝8.0Hz，1H)，7.60-6.62(m，8H)，6.12(s，1H)，3.73(s，6H)， 3.55(s，2H)，3.09(s，2H)，2.64(t，J＝5.6Hz，2H)，2.52(s，2H)；IR(KBr)：3090，3025， 2910，2827，1654，1590，1569，1460，1375，1340，1239，1105，978，814，768cm-1； Anal.calcd.for C22H24N2O2 C％75.83，H％6.94，N％8.04；Found：C％75.63，H％6.85， N％8.24.
7.89，N％9.14.
实施例6 3-(N-苯乙基-1，2，3，6-四氢吡啶-4-基)-1H-吲哚(Ⅰf)
产率：70％；黄色结晶；熔点：190-192℃；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.10 (s，1H)，7.79(d，J＝8.0Hz，1H)，7.56-6.78(m，9H)，6.11(s，1H)，3.67(s，2H)，3.02(s， 2H)，2.65(t，J＝5.5Hz，2H)，2.49(s，2H)；IR(KBr)：3072，3067，2918，2842，1657，1608， 1580，1510，1310，1293，1102，940，820，760cm-1；Anal.calcd.for C21H22N2 C％83.40， H％7.33，N％9.26；Found：C％83.15，H％7.40，N％9.19.
实施例7 3-(N-(4-氯苄基)-1，2，3，6-四氢吡啶-4-基)-5-甲氧基-1H-吲哚(Ⅰg)
产率：70％；黄色结晶；熔点：164-166℃；1H NMR(400MHz，DMSO-d6) δ11.02(s，1H)，7.43-6.70(m，8H)，6.02(s，1H)，3.73(s，3H)，3.49(s，2H)，3.02(d，J＝2.7 Hz，2H)，2.59(t，J＝5.6Hz，2H)，2.48(s，2H)；IR(KBr)：3072，3059，2920，2852，1657， 1604，1575，1510，1322，1287，1103，935，815，760cm-1；Anal.calcd.for C21H21ClN2O C％71.48，H％6.00，N％7.94；Found：C％71.55，H％6.01，N％7.70.
实施例8 3-(N-(4-甲苄基)-1，2，3，6-四氢吡啶-4-基)-5-甲氧基-1H-吲哚(Ⅰh)
产率：80％；黄色结晶；熔点：140-143℃；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.96 (s，1H)，7.46-6.66(m，8H)，6.06(s，1H)，3.75(s，3H)，3.55(s，2H)，3.08(s，2H)，2.63(t，J ＝5.6Hz，2H)，2.48(t，J＝10.6Hz，2H)，2.29(s，3H)；IR(KBr)：3070，3037，2911，2837， 1659，1597，1579，1468，1375，1345，1248，1115，980，810，764cm-1；Anal.calcd.for C22H24N2O C％79.48，H％7.28，N％8.43；Found：C％79.54，H％7.36，N％8.39
实施例9 3-(N-(2-氟苄基)-1，2，3，6-四氢吡啶-4-基)-5-甲氧基-1H-吲哚(Ⅰi)
产率：62％；yellow solid；熔点：161-163℃；1H NMR(400MHz，DMSO-d6) δ10.93(s，1H)，7.47-6.70(m，8H)，6.08(s，1H)，3.72(s，3H)，3.55(s，2H)，3.04(s，2H)， 2.65(t，J＝5.4Hz，2H)，2.50(s，2H)；IR(KBr)：3082，3060，2928，2852，1650，1608， 1589，1510，1320，1280，1108，945，810，767cm-1；Anal.calcd.for C21H21FN2O C％ 74.98，H％6.29，N％8.33；Found：C％74.82，H％6.33，N％8.43.
实施例10 3-(N-(2-氯苄基)-1，2，3，6-四氢吡啶-4-基)-5-甲氧基-1H-吲哚(Ⅰj)
产率：68％；黄色结晶；熔点：154-156℃；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.01 (s，1H)，7.46-6.70(m，8H)，6.02(s，1H)，3.75(s，3H)，3.47(s，2H)，3.02(d，J＝2.7Hz，2H)， 2.59(t，J＝5.6Hz，2H)，2.49(s，2H)；IR(KBr)：3072，3059，2920，2852，1657，1604， 1575，1510，1322，1287，1103，935，815，760cm-1；Anal.calcd.for C21H21ClN2O C％ 71.48，H％6.00，N％7.94；Found：C％71.52，H％6.04，N％7.70.
实施例11 3-(N-(3，4-二甲氧基苄基)-1，2，3，6-四氢吡啶-4-基)-5-甲氧基-1H-吲哚 (Ⅰk)
产率：60％；黄色结晶；熔点：216-218℃；1H NMR(400MHz，DMSO-d6) δ11.10(s，1H)，7.80(d，J＝8.0Hz，1H)，7.60-6.62(m，7H)，6.12(s，1H)，3.74(t，J＝9.3 Hz，9H)，3.55(s，2H)，3.09(s，2H)，2.64(t，J＝5.6Hz，2H)，2.52(s，2H)；IR(KBr)：3090， 3025，2910，2827，1654，1590，1569，1460，1375，1340，1239，1105，978，814， 768cm-1；Anal.calcd.for C22H24N2O2 C％72.99，H％6.92，N％7.40；Found：C％73.03， H％6.90，N％7.44.
实施例12 3-(N-(3，5-二氟苄基)-1，2，3，6-四氢吡啶-4-基)-5-甲氧基-1H-吲哚(Ⅰl)
产率：42％；黄色结晶；熔点：207-209℃；1H NMR(400MHz，DMSO-d6) δ10.99(s，1H)，7.45-6.70(m，7H)，6.06(s，1H)，3.75(s，3H)，3.55(s，2H)，3.07(s，2H)， 2.61(t，J＝5.4Hz，2H)，2.50(s，2H)；IR(KBr)：3082，3060，2928，2852，1650，1608， 1589，1510，1320，1280，1108，945，810，767cm-1；Anal.calcd.for C21H20F2N2O C％ 71.17，H％5.69，N％7.90；Found：C％71.20，H％5.72，N％7.94.
实施例13 3-(N-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶-4-基)-5-甲氧基-1H-吲哚(Ⅰm)
产率：72％；黄色结晶；熔点：190-192℃；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.10 (s，1H)，7.79(d，J＝8.0Hz，1H)，7.56-6.74(m，8H)，6.11(s，1H)，3.76(s，3H)，3.64(s， 2H)，3.02(s，2H)，2.63(t，J＝5.5Hz，2H)，2.49(s，2H)；IR(KBr)：3072，3067，2918，2842， 1657，1608，1580，1510，1310，1293，1102，940，820，760cm-1；Anal.calcd.for C22H24N2O C％79.48，H％7.28，N％8.43；Found：C％79.55，H％7.23，N％8.50
实施例14 3-(N-(4-氟苄基)-1，2，3，6-四氢吡啶-4-基)-5-溴-1H-吲哚((Ⅰn)
产率：70％；brown solid；熔点：110-112℃；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.36 (s，1H)，7.92(d，J＝1.6Hz，1H)，7.50-7.05(m，7H)，6.06(s，1H)，3.56(s，2H)，3.08(s， 2H)，2.62(t，J＝4.9Hz，2H)，2.49(s，2H)；IR(KBr)：3082，3060，2928，2852，1650，1608， 1589，1510，1320，1280，1108，945，810，767cm-1；Anal.calcd.for C20H18BrFN2C％62.35，H％4.71，N％7.27；Found：C％63.10，H％4.92，N％7.10.
实施例15 3-(N-(4-氯苄基)-1，2，3，6-四氢吡啶-4-基)-5-溴-1H-吲哚(Ⅰo)
产率：68％；黄色结晶；熔点：144-146℃；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.02 (s，1H)，7.43-6.72(m，8H)，6.04(s，1H)，3.49(s，2H)，3.05(d，J＝2.9Hz，2H)，2.59(t，J＝ 5.8Hz，2H)，2.48(s，2H)；IR(KBr)：3072，3059，2920，2852，1657，1604，1575，1510， 1322，1287，1103，935，815，760cm-1；Anal.calcd.for C20H18BrClN2 C％59.80，H％4.52， N％6.97；Found：C％60.00，H％4.41，N％6.90
实施例16 3-(N-(2-氟苄基)-1，2，3，6-四氢吡啶-4-基)-5-溴-1H-吲哚(Ⅰp)
产率：62％；黄色结晶；熔点：141-143℃；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.95 (s，1H)，7.47-6.72(m，8H)，6.06(s，1H)，3.55(s，2H)，3.05(s，2H)，2.65(t，J＝5.7Hz，2H)， 2.50(s，2H)；IR(KBr)：3082，3060，2928，2852，1650，1608，1589，1510，1320，1280， 1108，945，810，767cm-1；Anal.calcd.for C20H18BrFN2 C％62.35，H％4.71，N％7.27； Found：C％63.20，H％4.94，N％7.12.
实施例17 3-(N-(2-氯苄基)-1，2，3，6-四氢吡啶-4-基)-5-溴-1H-吲哚(Ⅰq)
产率：68％；黄色结晶；熔点：151-153℃；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.04 (s，1H)，7.46-6.74(m，8H)，6.06(s，1H)，3.48(s，2H)，3.02(d，J＝3.7Hz，2H)，2.59(t，J＝ 5.9Hz，2H)，2.49(s，2H)；IR(KBr)：3072，3059，2920，2852，1657，1604，1575，1510， 1322，1287，1103，935，815，760cm-1；Anal.calcd.for C20H18BrClN2 C％59.80，H％4.52， N％6.97；Found：C％59.90，H％4.54，N％6.80.
实施例18 3-(N-(3，5-二氟苄基)-1，2，3，6-四氢吡啶-4-基)-5-溴-1H-吲哚(Ⅰr)
产率：40％；黄色结晶；熔点：153-155℃；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.97 (s，1H)，7.45-6.71(m，7H)，6.06(s，1H)，3.54(s，2H)，3.10(s，2H)，2.63(t，J＝6.4Hz，2H)， 2.50(s，2H)；IR(KBr)：3082，3060，2928，2852，1650，1608，1589，1510，1320，1280， 1108，945，810，767cm-1；Anal.calcd.for C20H17BrF2N2 C％59.57，H％4.25，N％6.95； Found：C％60.00，H％4.32，N％6.84.
实施例19 3-(N-苯乙基-1，2，3，6-四氢吡啶-4-基)-5-溴-1H-吲哚(Ⅰs)
产率：72％；黄色结晶；熔点：180-182℃；1H NMR(400MHz，DMSO-d6) δ11.10(s，1H)，7.79(d，J＝8.0Hz，1H)，7.56-6.74(m，8H)，6.11(s，1H)，3.64(s，2H)， 3.02(s，2H)，2.63(t，J＝5.5Hz，2H)，2.49(s，2H)；IR(KBr)：3072，3067，2918，2842， 1657，1608，1580，1510，1310，1293，1102，940，820，760cm-1；Anal.calcd.for C22H24N2O C％66.15，H％5.55，N％7.35；Found：C％66.35，H％7.29，N％7.28.
实施例20 3-(N-(4-氟苄基)-1，2，3，6-四氢吡啶-4-基)-5-氰基-1H-吲哚(Ⅰt)
产率：40％；黄色结晶；熔点：217-219℃；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.14 (s，1H)，7.46-6.72(m，8H)，6.09(s，1H)，3.54(s，2H)，3.07(s，2H)，2.63(t，J＝7.4Hz，2H)， 2.50(s，2H)；IR(KBr)：3082，3060，2928，2852，1650，1608，1589，1510，1320，1280， 1108，945，810，767cm-1；Anal.calcd.for C21H18FN3 C％76.11，H％5.47，N％12.68； Found：C％76.20，H％5.35，N％12.67.
实施例21 3-(N-(4-氯苄基)-1，2，3，6-四氢吡啶-4-基)-5-氰基-1H-吲哚(Ⅰu)
产率：41％；黄色结晶；熔点：214-216℃；1H NMR(400MHz，DMSO-d6) δ11.04(s，1H)，7.43-6.73(m，8H)，6.05(s，1H)，3.49(s，2H)，3.02(d，J＝3.7Hz，2H)， 2.59(t，J＝6.4Hz，2H)，2.48(s，2H)；IR(KBr)：3072，3059，2920，2852，1657，1604， 1575，1510，1322，1287，1103，935，815，760cm-1；Anal.calcd.for C21H18ClN3 C％72.51， H％5.22，N％12.08；Found：C％72.55，H％5.30，N％11.98.
3.本发明通式(Ⅰ)抗肿瘤活性测试方法：
主要采用Luminescent Cell Viability Assay法测试本发明通式 (Ⅰ)化合物抑制人白血病K562等9种人癌细胞系增殖的活性.
3.1 受试细胞系：人白血病K562，Jurkat，U937，THP-1细胞系；人食道癌 ECA-109细胞系；人肝癌SMMC-7721细胞系，人卵巢癌HO-8910细胞系，人乳腺 癌MCF-7细胞系，乳腺癌MDA-MB-231细胞系。
3.2 抑制癌细胞系增殖实验的具体操作步骤为：
正常培养K562细胞(含10％FBS的RPMI1640培养基)，指数生长状态下，消 化后取合适密度，约500个/孔，种板于384孔板，20μl/孔；种板1d后，加药。5μl /孔，2个复孔，5个给药浓度。52个化合物，及阳性药imatinib，起始给药浓度为 3.333μM，依次3倍稀释；paclitaxol起始浓度为0.1μM。
化合物处理3d后，取细胞培养板室温平衡后，每孔加入25μl CellTiter-Glo 反应液，震荡后稳定10min，Envision测定荧光信号值。按下列公式计算抑制率： 抑制率(％)＝(信号值对照-信号值给药)/信号值对照×100％。并根据各浓度 下的细胞抑制率，采用LOGIT法计算50％抑制浓度(50％ inhibitory concentration， IC50)。
3.3 测试结果：本发明通式(Ⅰ)化合物抑制人白血病K562等9种人癌细胞 系增殖的IC50见表2。
表2 目标物(Ⅰa～Ⅰu)抑制肿瘤细胞系增殖的活性
a IC50：半数抑制浓度，即生长抑制率为50％的浓度；
b 白血病细胞系；
c 食道癌癌细胞系；
d 乳腺癌细胞系；
e 卵巢癌细胞系；
f 肝癌细胞系；
g 5-FU抑制白血病K562细胞的IC50为8.56uM。
4.本发明化合物(Ⅰo)和(Ⅰn)在人和大鼠肝微粒体的代谢稳定性
4.1 材料：人肝微粒体购自RILD公司(批号：PLYU)，大鼠肝微粒体购自RILD 公司(批号：BDVH)，NADPH、midazolam、propranolol和metoprolol购自Sigma。
4.2 实验方法：
4.2.1 配药方法：将化合物(Ⅰo)和(Ⅰn)用DMSO溶解后配制成10-2M 的储备液，分装后存放于-80℃。分别用乙腈稀释至100μM和10μM。
4.2.2 体外肝微粒体代谢实验：用体系为150μL的肝微粒体(最终浓度 0.5mg/mL)进行代谢稳定性温孵，体系含NADPH(终浓度1mM)和1μM化合 物、阳性对照及阴性对照，分别在0min、5min、10min和30min用含tid的乙腈 终止反应，涡旋10min后，用转速为15000rmp离心10min，取50μL上清液于 96孔板中进样。
通过测定原化合物的相对减少量计算其代谢稳定性。
4.2.3 测试结果：化合物(Ⅰo)和(Ⅰn)在人和大鼠肝微粒体中代谢稳定性RILD 值见表3。
表3 HLM及RLM的RILD值
稳定性数据的单位为μl/min/mg protein，RILD人肝微粒体数值小于50代谢 稳定，RILD大鼠肝微粒体数值小于100稳定。
表3结果表明，化合物(Ⅰo)和(Ⅰn)在人和大鼠肝微粒体中代谢稳定性较好。
5.本发明化合物(Ⅰo)和(Ⅰn)对人肝微粒体的机制性抑制作用
5.1 材料：人肝微粒体购自Xenotech公司(批号：H0610)。NADPH、 troleandomycin、testosterone、paroxetine、midazolam、tienilic acid、furafylline、 dextromethorphan、diclofenac、tinidazole、atenolol、S-(+)-fluoxetine、phenacetin、 S-(+)-mephenytoin购自Sigma；atenolol标准品由药物所相赠。
5.2 实验方法：
5.2.1 配药方法：将化合物3e用DMSO溶解后配制成10-2M的储备液，分装 后存放于-80℃。用乙腈稀释至1mM。
5.2.2 体外机制性抑制实验：用体系为200μl的人肝微粒体(终浓度 0.2mg/ml)进行机制性抑制温孵，10μM化合物、混合阳性抑制剂(Troleandomycin 10μM、Paroxetine 10μM、Tienilic Acid 10μM、Furafylline10μM)或10μM阴性对 照PRO，在加入NADPH(终浓度1mM)或PBS后预温孵0min、5min、10minh和 30min后加入NADPH(终浓度1mM)和混合探针底物(Midazolam 5μM、 Dextromethophan 5μM、Testosterone50μM、Diclofenac 10μM、Phenacetin 50μM、 S-(+)-mephenytoin 50μM)，温孵10min后终止反应。阳性抑制剂CYP2C19单独 实验，抑制剂S-(+)-fluoxetine 100μM。通过测定代谢物的相对生成量计算酶活性。 计算kobs。
5.3 测试结果：(Ⅰo)和(Ⅰn)对人肝微粒体的机制性抑制作用的TDI值 见表4。
表4 化合物(Ⅰo)和(Ⅰn)、阳性对照及阴性对照对5种代谢酶的抑制效应
TDIa(average) 3A4 2D6 2C9 1A2 2C19 +Control 639/1011b 1186 1498 1191 267 -Control No inhibition 24 No inhibition 17 No inhibition Ⅰn 32/66 82 67 164 79 Ⅰo 14 43 25 44 34
a TDI值用kobs表示，单位是10-4/min；
b TDI值超过200表明存在竞争性抑制效应.
表4结果表明，人肝微粒体用(Ⅰo)和(Ⅰn)处理后，5种代谢酶CYP3A4、 CYP2D6、CYP2C9、CYP1A2、CYP2C19的TDI值都低于200，这明确的说明化合物 (Ⅰo)和(Ⅰn)对人肝微粒体5种主要代谢酶的催化活性不存在机制性抑制作 用。
6.化合物(Ⅰo)流式细胞仪检测细胞周期阻滞情况
6.1 材料：自制化合物(Ⅰo)，用DMSO稀释成所需浓度(DMSO浓度≤1‰)， 灭菌后4℃保存。人慢性粒细胞白血病细胞系K562细胞购于上海中科院细胞库。 用含20％小牛血清(FBS)的RPMI-1640(美国GiBCo公司)培养液，Annexin V-FITC细 胞凋亡检测试剂盒(瑞士Roche公司)，其它试剂都是市售分析纯。在5％CO2、37℃、 饱和湿度的培养箱中进行传代培养，在细胞处于对数生长期时用于实验。
6.2实验方法：取对数生长期白血病K562细胞，倒去培养液，胰酶消化细 胞，然后用浓度分别为0.5uM，1uM，及5uM的目标化合物4d处理48小时。 随后用PBS洗两次，加0.5ml PBS吹匀，务必吹散。再用5ml注射器将细胞吸起， 用力打入5ml 70％的遇冷乙醇中，用封口膜封口，4℃固定过夜(也可延长一定 时间)。800rpm 15分钟收集，PBS洗两次，然后用0.4ml PBS重悬并转至Tube 中轻轻吹打(防止细胞破碎)，然后加RNase-A约3ul至浓度约为50ug/ml，37℃ 冰浴消化30分钟，再加PI约50ul至浓度为65ug/ml，在冰浴中避光染色30分 钟，后用300目尼龙网过滤，上流式细胞仪检测。最后进行样品的分析测定及打 印。
6.3测试结果：化合物(Ⅰo)处理白血病K562细胞进行细胞周期分析的实 验结果见表5。
表5 化合物(Ⅰo)处理白血病K562细胞的细胞周期
Compound G0/G1％ S％ G2/M％ Control 30.64 60.92 8.43 Ⅰo(0.5uM) 36.99 52.23 10.77 Ⅰo(1.0uM) 39.59 49.79 10.62 Ⅰo(5.0uM) 61.40 30.02 8.58
表5结果表明，化合物(Ⅰo)表现出G0/G1期阻滞。由于G0/G1期周期阻 滞是致细胞凋亡的重要标志，因此该细胞周期分析实验初步证实了化合物(Ⅰo) 是通过诱导细胞凋亡来抑制白血病K562细胞增值的。
综上，化合物(Ⅰ)高效抑制人白血病K562，Jurkat，U937，THP-1细胞系； 人食道癌ECA-109细胞系；人肝癌SMMC-7721细胞系，人卵巢癌HO-8910细胞 系，人乳腺癌MCF-7细胞系，乳腺癌MDA-MB-231细胞系增殖；在人和大鼠肝微 粒体中代谢稳定性较好；对CYP3A4、CYP 2D6、CYP2C9、CYP1A2和CYP2C19等 人肝微粒体的五种酶没有机制性抑制作用；通过诱导细胞周期G2/M阻滞和促进 癌细胞凋亡而抑制癌细胞的增殖，有着明显的开发应用研究的前景。