技术领域
本发明涉及核酸技术领域，具体涉及一种具有降低正义链脱靶效应的化学修饰的双链小干扰RNA(siRNA)分子及其制备方法，以及该种修饰的siRNA分子在制备药物组合物中的应用。
背景技术
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由双链RNA分子(double-stranded RNA，dsRNA)在mRNA水平降低同源基因表达的现象。RNA干扰技术又被形象地称为基因敲低(knock-down)或基因沉默(gene silencing)，是一种转录后基因表达调控方法，因此又被称为转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)。最早有关RNA干扰的报道出现在1990年左右，由两个不同的研究小组同时报道了在转基因植物中发现的RNA干扰现象，随后又在线虫、果蝇、斑马鱼以及小鼠等几乎所有后生生物中观察到RNA干扰现象。1999年，Hamilton和Baulcombe在发生RNA干扰现象的植物中检测到长度为21-25个核苷酸的双链RNA片段，这些双链RNA片断被证明是产生RNA干扰现象所必需的，被称作小干扰核酸(small interfering RNA，siRNA)。双链siRNA与细胞源性的相关酶和蛋白质形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)是RNA干扰的效应分子。通常认为，在RNA干扰过程中，双链siRNA中的正义链(过客链)被RISC复合体排出，反义链指导RISC复合体结合到目标mRNA上的同源位点，然后由复合物中的核糖核酸酶III降解目标mRNA，从而关闭靶基因的表达。事实上，对于一个标准的双链siRNA，它的两条链均能参与RISC复合体的结合，也就是说，除了siRNA的反义链(引导链)能够介导同源基因的表达沉默外，siRNA的正义链(过客链)也能介导其同源基因的表达沉默，引发由正义链介导的脱靶效应。在基因功能研究中，siRNA正义链的这种脱靶效应可能会导致错误解读siRNA的抑制活性；而在小核酸制药中，则有可能引发siRNA药物的毒副作用等一系列后果，这些都将严重影响RNA干扰技术的应用。
因此，降低siRNA分子正义链的脱靶效应，提高RNA干扰的特异性是目前迫切需要解决的问题。
发明内容
本发明涉及以下按顺序编号的段落中定义的主题：
1、分离的化学修饰的双链小干扰RNA(siRNA)分子，包含正义链(过客链)和反义链(引导链)，其特征在于所述修饰的siRNA分子的正义链自5’端起第14位点的核苷酸为化学修饰的核苷酸。
2、分离的化学修饰的双链小干扰RNA(siRNA)分子，包含正义链(过客链)和反义链(引导链)，其特征在于所述修饰的siRNA分子的正义链自5’端起第16位点的核苷酸为化学修饰的核苷酸。
3、分离的化学修饰的双链小干扰RNA(siRNA)分子，包含正义链(过客链)和反义链(引导链)，其特征在于所述修饰的siRNA分子的正义链自5’端起第14位点和第16位点的核苷酸为化学修饰的核苷酸。
4、根据段落1-3任一项所述的化学修饰的siRNA分子，其特征在于所述化学修饰选自以下修饰方式中的一种或几种：
(1)对核苷酸中核糖的化学修饰；
(2)对核苷酸中碱基的化学修饰；
(3)对核苷酸之间磷酸二酯键的化学修饰。
5、根据段落4所述的化学修饰的siRNA分子，其特征在于所述化学修饰为对核苷酸中核糖2’-OH的修饰。
6、根据段落5所述的化学修饰的siRNA分子，其特征在于所述化学修饰为核苷酸中核糖2’-OH被甲氧基或氟取代。
7、根据段落4所述的化学修饰的siRNA分子，其特征在于所述化学修饰为核苷酸之间的磷酸二酯键被硫代磷酸酯键取代。
8、根据段落4所述的化学修饰的siRNA分子，其特征在于所述化学修饰为核苷酸的碱基被非RNA碱基取代。
9、根据段落8所述的化学修饰的siRNA分子，其特征在于所述非RNA碱基选自胸腺嘧啶(thymine)、5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine)、异胞嘧啶(isocytosine)、假异胞嘧啶(pseudoisocytosine)、5-溴尿嘧啶(5-bromouracil)、5-丙炔基尿嘧啶(5-propynyluracil)、5-丙炔基-6-氟代尿嘧啶(5-propyny-6-fluoroluracil)、5-甲基噻唑尿嘧啶(5-methylthiazoleuracil)、6-氨基嘌呤(6-aminopurine)、2-氨基嘌呤(2-aminopurine)、肌苷(inosine)、2，6-二氨基嘌呤(2，6-diaminopurine)、7-丙炔 基-7-脱氮腺嘌呤(7-propyne-7-deazaadenine)、7-丙炔基-7-脱氮鸟嘌呤(7-propyne-7-deazaguanine)、2-氯-6-氨基嘌呤(2-chloro-6-aminopurine)。
10、根据段落8所述的化学修饰的siRNA分子，其特征在于所述化学修饰为核苷酸的碱基被DNA碱基取代。
11、根据段落1-10任一项所述的化学修饰的siRNA分子，其特征在于所述siRNA分子的正义链和反义链的长度为15-35个核苷酸。
12、根据段落11所述的化学修饰的siRNA分子，其特征在于所述siRNA分子的正义链和反义链的长度为19-23个核苷酸。
13、根据段落12所述的化学修饰的siRNA分子，其特征在于所述siRNA分子的正义链和反义链的长度为21个核苷酸。
14、根据段落1-14任一项所述的化学修饰的siRNA分子，其特征在于所述siRNA分子为平末端的siRNA分子。
15、根据段落1-14任一项所述的化学修饰的siRNA分子，其特征在于所述siRNA分子为3’突出末端的siRNA分子。
16、根据段落15所述的化学修饰的siRNA分子，其特征在于所述siRNA分子为具有1-6个3’突出末端的siRNA分子。
17、根据段落16所述的化学修饰的siRNA分子，其特征在于所述siRNA分子为具有2-4个3’突出末端的siRNA分子。
18、一种药物组合物，其特征在于含有段落1-17任一项所述的化学修饰的siRNA分子及药学上可接受的载体。
19、段落1-17任一项所述的化学修饰的siRNA分子在制备药物组合物中的应用。
20、一种降低siRNA分子正义链脱靶效应的方法，其特征在于对所述siRNA分子的正义链自5’端起第14位点的核苷酸进行化学修饰。
21、一种降低siRNA分子正义链脱靶效应的方法，其特征在于对所述siRNA分子的正义链自5’端起第16位点的核苷酸进行化学修饰。
22、一种降低siRNA分子正义链脱靶效应的方法，其特征在于对所述siRNA分子的正义链自5’端起第14位点和第16位点的核苷酸进行化学修饰。
23、根据段落20-22任一项所述的降低siRNA分子正义链脱靶效应的方法，其特征在于所述化学修饰选自以下修饰方式中的一种或几种：
(1)对核苷酸中核糖的化学修饰；
(2)对核苷酸中碱基的化学修饰；
(3)对核苷酸之间磷酸二酯键的化学修饰。
24、根据段落23所述的降低siRNA分子正义链脱靶效应的方法，其特征在于所述化学修饰为对核苷酸中核糖2’-OH的修饰。
25、根据段落24所述的降低siRNA分子正义链脱靶效应的方法，其特征在于所述化学修饰为核苷酸中核糖2’-OH被甲氧基或氟取代。
26、根据段落23所述的降低siRNA分子正义链脱靶效应的方法，其特征在于所述化学修饰为核苷酸之间磷酸二酯键被硫代磷酸酯键取代。
27、根据段落23所述的降低siRNA分子正义链脱靶效应的方法，其特征在于所述化学修饰为核苷酸中碱基被非RNA碱基取代。
28、根据段落27所述的降低siRNA分子正义链脱靶效应的方法，其特征在于所述非RNA碱基选自胸腺嘧啶(thymine)、5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine)、异胞嘧啶(isocytosine)、假异胞嘧啶(pseudoisocytosine)、5-溴尿嘧啶(5-bromouracil)、5-丙炔基尿嘧啶(5-propynyluracil)、5-丙炔基-6-氟代尿嘧啶(5-propyny-6-fluoroluracil)、5-甲基噻唑尿嘧啶(5-methylthiazoleuracil)、6-氨基嘌呤(6-aminopurine)、2-氨基嘌呤(2-aminopurine)、肌苷(inosine)、2，6-二氨基嘌呤(2，6-diaminopurine)、7-丙炔基-7-脱氮腺嘌呤(7-propyne-7-deazaadenine)、7-丙炔基-7-脱氮鸟嘌呤(7-propyne-7-deazaguanine)、2-氯-6-氨基嘌呤(2-chloro-6-aminopurine)。
29、根据段落27所述的降低siRNA分子正义链脱靶效应的方法，其特征在于所述化学修饰为核苷酸中碱基被DNA碱基取代。
30、根据段落20-29任一项所述的降低siRNA分子正义链脱靶效应的方法，其特征在于所述siRNA分子的正义链和反义链的长度为15-35个核苷酸。
31、根据段落30所述的降低siRNA分子正义链脱靶效应的方法，其特征在于所述siRNA分子的正义链和反义链的长度为19-23个核苷酸。
32、根据段落31所述的降低siRNA分子正义链脱靶效应的方法，其特征在于所述siRNA分子的正义链和反义链的长度为21个核苷酸。
33、根据段落20-32任一项所述的降低siRNA分子正义链脱靶效应的方法，其特征在于所述siRNA分子为平末端的siRNA分子。
34、根据段落20-32任一项所述的降低siRNA分子正义链脱靶效应的方法，其特征在于所述siRNA分子为3’突出末端的siRNA分子。
35、根据段落34所述的降低siRNA分子正义链脱靶效应的方法，其特征在于所述 siRNA分子为具有1-6个3’突出末端的siRNA分子。
36、根据段落35所述的降低siRNA分子正义链脱靶效应的方法，其特征在于所述siRNA分子为具有2-4个3’突出末端的siRNA分子。
本发明要解决的技术问题是siRNA分子正义链介导其互补基因转录本的表达沉默，从而引发由正义链介导的脱靶效应的问题。本发明的目的是提供一种具有降低正义链引起的脱靶效应的化学修饰的siRNA分子及降低siRNA分子正义链脱靶效应的方法。
为解决上述问题，本发明一方面提供了一种分离的化学修饰的双链小干扰RNA(siRNA)分子，包含正义链(过客链)和反义链(引导链)，所述修饰的siRNA分子的正义链自5’端起第14位点或第16位点的核苷酸为化学修饰的核苷酸。本发明还提供了一种分离的化学修饰的双链小干扰RNA(siRNA)分子，包含正义链(过客链)和反义链(引导链)，所述修饰的siRNA分子的正义链自5’端起第14位点和第16位点的核苷酸均为化学修饰的核苷酸。本发明中所述的化学修饰，选自以下修饰方式中的一种或几种：(1)对核苷酸中核糖的化学修饰；(2)对核苷酸中碱基的化学修饰；(3)对核苷酸之间磷酸二酯键的化学修饰。
在一种优选情况下，所述化学修饰为对核苷酸中核糖2’-OH的修饰；更优选地，所述化学修饰为核苷酸中核糖2’-OH被甲氧基或氟取代。在另一种优选情况下，所述化学修饰为核苷酸之间的磷酸二酯键被硫代磷酸酯键取代。在另一种优选情况下，所述化学修饰为核苷酸的碱基被非RNA碱基取代；优选地，所述非RNA碱基选自胸腺嘧啶(thymine)、5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine)、异胞嘧啶(isocytosine)、假异胞嘧啶(pseudoisocytosine)、5-溴尿嘧啶(5-bromouracil)、5-丙炔基尿嘧啶(5-propynyluracil)、5-丙炔基-6-氟代尿嘧啶(5-propyny-6-fluoroluracil)、5-甲基噻唑尿嘧啶(5-methylthiazoleuracil)、6-氨基嘌呤(6-aminopurine)、2-氨基嘌呤(2-aminopurine)、肌苷(inosine)、2，6-二氨基嘌呤(2，6-diaminopurine)、7-丙炔基-7-脱氮腺嘌呤(7-propyne-7-deazaadenine)、7-丙炔基-7-脱氮鸟嘌呤(7-propyne-7-deazaguanine)、2-氯-6-氨基嘌呤(2-chloro-6-aminopurine)。优选地，所述化学修饰为核苷酸中碱基被DNA碱基取代。
上述任一种化学修饰的siRNA分子，其正义链和反义链的长度可以为15-35个核苷酸，优选长度为19-23个核苷酸，更优选长度为21个核苷酸。上述任一种经过化学修饰的siRNA分子，其可以为平末端，也可以带有3’突出末端，3’突出末端可以为1-6个核苷酸，优选为2-4个核苷酸，更优选为2个核苷酸。
本发明另一方面提供了一种药物组合物，该组合物可包含上述任一种化学修饰的 siRNA分子及药学上可接受的载体。本发明所用的“药学上可接受的载体”应当与本发明药物组合物中的小干扰RNA(siRNA)分子相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物在抑制基因表达方面的效果。这类给药载体包括但不限于各种可用于核酸给药的载体，如脂质体、可降解的高分子化合物、盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其组合。
本发明的药物组合物可以制成各种医学上可接受的剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。本发明所述制剂是指口服液、注射剂、舌下含服剂等多种液体剂型，或通过加以适当的赋形剂制备成片剂、胶囊剂等多种其他剂型。
本发明还提供了上述任一种化学修饰的siRNA分子在制备药物组合物中的应用。
本发明的第三方面，提供了一种降低siRNA分子正义链引起的脱靶效应的方法。通过对siRNA分子的正义链自5’端起第14位点或第16位点的核苷酸进行化学修饰，或者对siRNA分子的正义链自5’端起第14位点和第16位点的核苷酸同时进行化学修饰，能够显著降低修饰后的siRNA分子的正义链引起的脱靶效应。本发明中所述的化学修饰，选自以下修饰方式中的一种或几种：(1)对核苷酸中核糖的化学修饰；(2)对核苷酸中碱基的化学修饰；(3)对核苷酸之间磷酸二酯键的化学修饰。
在一种优选情况下，所述化学修饰为对核苷酸中核糖2’-OH的修饰；更优选地，所述化学修饰为核苷酸中核糖2’-OH被甲氧基或氟取代。在另一种优选情况下，所述化学修饰为核苷酸之间的磷酸二酯键被硫代磷酸酯键取代。在再一种优选情况下，所述化学修饰为核苷酸的碱基被非RNA碱基取代；优选地，所述非RNA碱基选自胸腺嘧啶(thymine)、5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine)、异胞嘧啶(isocytosine)、假异胞嘧啶(pseudoisocytosine)、5-溴尿嘧啶(5-bromouracil)、5-丙炔基尿嘧啶(5-propynyluracil)、5-丙炔基-6-氟代尿嘧啶(5-propyny-6-fluoroluracil)、5-甲基噻唑尿嘧啶(5-methylthiazoleuracil)、6-氨基嘌呤(6-aminopurine)、2-氨基嘌呤(2-aminopurine)、肌苷(inosine)、2，6-二氨基嘌呤(2，6-diaminopurine)、7-丙炔基-7-脱氮腺嘌呤(7-propyne-7-deazaadenine)、7-丙炔基-7-脱氮鸟嘌呤(7-propyne-7-deazaguanine)、2-氯-6-氨基嘌呤(2-chloro-6-aminopurine)。优选地，所述化学修饰为核苷酸中碱基被DNA碱基取代。
上述任一种化学修饰的siRNA分子，其正义链和反义链的长度可以为15-35个核苷酸，优选长度为1g-23个核苷酸，更有选长度为21个核苷酸。上述任一种化学修饰的siRNA分子，其可以为平末端，也可以带有3’突出末端，3’突出末端可以为1-6个核苷酸， 优选为2-4个核苷酸，更优选为2个核苷酸。
本发明的有益效果
本发明提供的化学修饰的siRNA分子，能够显著降低siRNA分子正义链引起的脱靶效应，提高siRNA对靶基因表达沉默的特异性。
具体实施方式
在通常情况下，研究人员将一个siRNA分子导入细胞中，由反义链(引导链)介导的基因沉默是研究人员所期望的；而由正义链(过客链)介导的基因沉默是RNA干扰过程中的副作用，被称为正义链引起的脱靶效应。
针对如何降低siRNA分子正义链引起的脱靶效应的问题，发明人对siRNA正义链的不同位点的核苷酸的化学修饰与脱靶效应之间的相关性进行了细致的研究。发现对siRNA正义链从5’端起第14位点或第16位点的核苷酸进行化学修饰，能显著降低正义链对与其互补的基因转录本的表达抑制活性，即抑制siRNA正义链引起的脱靶效应；同时该化学修饰不影响siRNA分子未修饰的反义链的基因沉默活性。在此基础上，发明人完成本发明。
本发明中，术语“反义链(引导链)”是指双链siRNA分子中与目标基因转录本中的目标位点序列互补的siRNA组成链。“正义链(过客链)”是指与siRNA分子反义链序列互补的siRNA分子的另一条组成链。“正义链靶序列”是指与siRNA分子中正义链(过客链)互补的基因序列或该基因序列的同源序列。“反义链靶序列”是指与siRNA分子中反义链(引导链)互补的基因序列或该基因序列的同源序列。
根据本发明，所述修饰的小干扰RNA(siRNA)分子可以由核糖核苷酸组成，也可以包括核糖核苷酸和至少一个脱氧核糖核苷酸的杂合分子。
本发明中，可以应用各种常规的核酸合成方法完成本发明所涉及的核酸分子的合成，或者委托专门从事核酸合成服务的生物技术公司完成核酸分子的合成，如委托广州锐博生物科技有限公司或英骏生物技术有限公司(invitrogen)进行合成。
一般来说，寡聚核酸分子的合成方法包括以下四个步骤：(1)寡聚核糖核苷酸的合成；(2)脱保护；(3)纯化分离；(4)脱盐。
例如，具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的siRNA的化学合成步骤如下：
(1)siRNA组成链的合成：在自动DNA/RNA合成仪(例如，Applied Biosystems EXPEDITE8909)上设定合成1毫摩尔量的siRNA的正义链或反义链寡聚核苷酸序 列，设定每个循环的偶联时间为10-15分钟，起始物为固相连接的5’-O-对二甲氧基-胸苷支持物，第一个循环在固相支持物上连接一个碱基，然后在第n次(2≤n≤35)循环中，在第n-1次循环所连接的碱基上连接一个碱基，重复此循环直至完成全部核酸序列的合成。
(2)脱保护
将连接有寡聚核苷酸的固相支持物加入到试管中，并在此试管中加入1毫升的乙醇/乙胺(体积比为1∶3)，然后密封，置于55-70℃温箱中，孵育2-30小时；取出连接有寡聚核苷酸的固相支持物，用双蒸水淋洗2次(每次1毫升)，收集洗脱液；室温下干燥30分钟后，加入1毫升四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液(1M)，室温放置4-12小时；再加入2毫升乙醇，收集沉淀即得到合成的寡聚核苷酸的粗产物。
(3)纯化分离
将得到的寡聚核苷酸的粗产物溶解于2毫升浓度为1摩尔/毫升的乙酸铵水溶液中，然后通过C18高压液相色谱进行分离，得到纯化的寡聚核苷酸产物。
(4)脱盐
用浓度为75重量％的乙醇水溶液洗涤纯化的寡聚核苷酸产物2-4次(每次2毫升)，除去盐份，室温下干燥；将正义链和反义链的寡聚核糖核酸混合溶解在1-2毫升的缓冲液中(10mM Tris，pH＝7.5-8.0，50mM NaCl)，将此溶液加热至95℃，然后缓缓将此溶液冷却至室温，并维持在室温条件下16-22小时，即得到siRNA溶液。
本发明中，所述化学修饰的方式为本领域技术人员所公知。例如，本发明对所述核酸分子进行的化学修饰为以下修饰方式中的一种或几种：
(1)对核苷酸中核糖的化学修饰；
(2)对核苷酸中碱基的化学修饰；
(3)对核苷酸之间磷酸二酯键的化学修饰。
所述对磷酸二酯键的修饰包括但不限于对磷酸二酯键中的氧进行修饰，例如硫代磷酸修饰(Phosphorthioate)和硼烷化磷酸盐修饰(Boranophosphate)，分别用硫和硼烷置换磷酸二酯键中的氧。两种修饰都能稳定siRNA分子的结构，保持碱基配对的特异性和亲和力。硼烷化磷酸盐修饰的siRNA疏水性强，易于在血浆中形成水合蛋白，对人体的毒副作用低于硫代磷酸酯修饰的siRNA。
硫代磷酸修饰 硼烷化磷酸盐修饰
所述核糖修饰包括但不限于对核苷酸戊糖中羟基(2′-OH)的修饰。在核糖的羟基位置引入某些取代基如甲氧基或氟后，使siRNA具有更强的抵抗核酸酶水解的性能。对核苷酸戊糖中羟基的修饰包括2′-氟修饰(2′-fluro modification)、2′-氧甲基修饰(2′-OME)、2′-甲氧乙基修饰(2′-MOE)、2，4′-二硝基苯酚修饰(2′-DNP modification)、锁核酸(LNA)、2′-氨基修饰(Amina modification)、2′-脱氧修饰(2′-Deoxy modification)等。
2′-氟修饰 2′-氧甲基修饰
2′-甲氧乙基修饰 2，4′-二硝基苯酚修饰
锁核酸 2′-氨基修饰
2′-脱氧修饰
所述碱基修饰包括但不限于对核苷酸的碱基进行修饰，如在尿嘧啶的5位点引入溴或碘的5′-溴尿嘧啶(5′-bromo-uracil)和5′-碘尿嘧啶(5′-iodo-uracil)修饰是常使用的碱基修饰方法，其他还有N3-甲基尿嘧啶(N3-methyl-uracil)修饰，2，6-二氨基嘌呤(2，6-diaminopurine)修饰等。
5′-溴尿嘧啶 5′-碘尿嘧啶
N3-甲基尿嘧啶 2，6-二氨基嘌呤
优选情况下，所述修饰为对所述核酸分子的核苷酸中核糖的2’-OH的修饰；进一步优选为，所述修饰为所述核酸分子的核苷酸中核糖的2’-OH被甲氧基或氟取代。
根据本发明，所述siRNA分子的目的基因可以为各种基因，可以将在细胞内的功能有待分析的基因作为目的基因，可以将需要抑制其表达的基因作为目的基因，也可以将与疾病或功能紊乱相关的基因作为目的基因，如癌基因、病毒基因、细胞膜表面受体基因、细胞核受体基因或细胞信号传导通路上的基因等。本领域的技术人员根据目的基因的序列，能够设计得到目的基因特异的siRNA分子，例如，将目的基因序列或目的基因在NCBI Genbank中的序列号输入各种siRNA设计程序，如Insert Design Tool for the shRNA Vectors(Ambion)、shRNA Explorer(Gene Link)、siDirect(Yuki Naito et al.University of Tokyo)、SiRNA at Whitehead(Whitehead lnstitute for Biomedical Research)，BLOCK-iT RNAi Designer(invitrogen)、RNAi Design(IDT)，RNAi Explorer(Gene Link)、siRNA Target Finder(Ambion)、或siSearch(Stockholm Bioinformatics Center)等，该设计程序根据设计者的要求和siRNA的设计原则，针对所提供的基因序列设计siRNA序列。有些程序还能够对设计的siRNA序列进行基于全基因组或转录组的同源性分析，筛选出目的基因序列特异的siRNA分子。以上所述的siRNA设计程序及其涉及的原则为本领域技术人员所公知，其全部内容在此一并引入作为参考。
下面将结合实施例进一步详细描述本发明。应当理解，列举这些实施例只是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明的范围。除非特别说明，本发明所用到的试剂、培养基均为市售商品。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规实验条件进行，例如Sambrook等人在《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1.siRNA靶位点和siRNA序列
委托Invitrogen北京分公司合成表1中的siRNA靶序列片段，用于融合报告基因表达载体的构建。
针对表1中靶位点序列设计siRNA，委托广州锐博生物科技有限公司合成表2-11中所列的化学修饰的和未修饰的小干扰RNA(siRNA)。
表1.siRNA靶位点序列
实施例2.siRNA对靶位点抑制活性的检测
1)构建带有siRNA分离靶位点的重组萤火虫荧光素酶报告基因质粒
参见以下文献，构建含有siRNA分离靶位点的重组萤火虫荧光素酶报告基因质粒，报告基因质粒载体可向论文作者索取。(Du Q，Thonberg H，Zhang HY，Wahlestedt C&Liang Z.Validating siRNA Using a Reporter Made from Synthetic DNA Oligonucleotides.Biochem Biophys Res Commun.325：243-9，2004；Du Q，Thonberg H，Wang J，Wahlestedt C&Liang Z.A Systematic Analysis of the Silencing Effects of an Active siRNA at All Single-nucleotide Mismatched Target Sites.Nucleic Acids Res.33：1671-7，2005；Li ZS，Qiao RP，Du Q，Yang ZJ，Zhang LR，Zhang PZ，Liang Z&Zhang LH.Studies on Aminoisonucleoside Modified siRNAs：Stability and Silencing Activity.Bioconjugate Chem.18：1017-24，2007；Dahlgren C，Zhang HY，Du Q，Grahn M，Norstedt G，Wahlestedt C&Liang Z.Analysis of siRNA specificity on targets with double-nucleotide mismatches.Nucleic Acids Res.36：e53，2008；Huang H，Qiao R，Zhao D，Zhang T，Li Y，Yi F，Lai F，Hong J，Ding X，Yang Z，Zhang L，Du Q＊，Liang Z＊.Profiling of mismatch discrimination in RNAi enabled rational design of allele-specific siRNAs.Nucleic Acids Res.37：7560-9，2009)。
2)转染
参照上述文献中描述的方法，进行细胞转染和siRNA活性测定。具体将在DMEM培养基(10％FBS，2mM L-谷氨酰胺，100个单位/毫升的青霉素和100μg/ml的链霉素)中培养的人胚胎肾细胞(HEK293)接种到24孔板中(1×105细胞/0.5ml培养基/孔)。待细胞生长24小时后，细胞的融合度为50-70％左右时，将培养基换为Opti-MEM培养基(Gibco公司)。利用Lipofectamine 2000(Invitrogen公司，美国)将带有siRNA分离靶位点的重组萤火虫荧光素酶报告基因质粒转染入细胞，同时转染进入细胞的还有pRL-TK(编码海肾萤光素酶)的对照质粒(Promega公司，Madison WI，USA)，以及化学合成的修饰的或未修饰的siRNA分子。每孔含0.17g重组质粒和0.017g pRL-TK对照质粒，siRNA的终浓度为13nM。每种siRNA平行转染三个复孔，以只转染同样量的两种报告基因质粒(不转染siRNA)的三个复孔作为对照。4小时后再将转染介质换成1mlDMEM培养基(10％FBS，2mM L-谷氨酰胺，100个单位/豪升的青霉素和100μg/ml的链霉素)。
3)荧光素酶活性测定
转染24小时后收获细胞，以10μl细胞裂解液裂解细胞，利用双荧光素酶报告基因分析系统(Dual-Luciferase Assay System，Promega公司)和酶标仪(Novosta r，BMG Labtechnologies GmbH，Germany)测定两种荧光素酶的活性，以未转染siRNA的孔中的报告基因的表达量作为对照，通过以下公式计算得到siRNA对靶位点的沉默效率。
沉默效率＝1-(实验组萤火虫荧光素酶报告基因的表达量/实验组海肾荧光素酶报告基因的表达量)/(对照组萤火虫荧光素酶报告基因的表达量/对照组海肾荧光素酶报告基因的表达量)
实施例3.甲氧基核苷酸修饰siRNA正义链的不同位点对正义链脱靶效应的影响
选取2条siRNA(CM-01和CM-11)，按照实施例2所述的方案分别构建含有siRNA正义链靶位点的重组萤火虫荧光素酶报告基因质粒(靶位点序列如表1所示)；合成表2所示的未修饰的siRNA分子，以及分别在siRNA正义链自5’端起第2-18位点含有甲氧基修饰核苷酸的经化学修饰的siRNA分子。按照实施例2所述的实验方案，分别检测各种siRNA分子对其正义链靶位点的抑制活性。每种siRNA每次实验平行做3个复孔，每个实验重复至少2次。表2所示的实验结果表明，对siRNA正义链自5’端起第14位点的核苷酸的化学修饰能够显著降低修饰的siRNA对与其正义链互补的基因的表达抑制活性；对siRNA正义链自5’端起第16位点的核苷酸的化学修饰也能够在一定程度上降低修饰的siRNA对与其正义链互补的基因的表达抑制活性；而对其余位点的修饰基本上不影响siRNA对与其正义链互补的基因的表达抑制活性。
实施例4.甲氧基修饰siRNA正义链的13-16位点对正义链脱靶效应的影响
如表3所示，在siRNA正义链自5’端起的第13-16位点中，每个位点选取12条siRNA序列，合成其未修饰的siRNA分子，以及分别在其正义链自5’端起第13-16位点含有甲氧基修饰核苷酸的化学修饰的siRNA分子；按照实施例2所述的实验方案，构建含有siRNA正义链靶位点的重组萤火虫荧光素酶报告基因质粒(靶位点序列如表1所示)；按照实施例2所述方案，分别检测表3中各种修饰或未修饰的siRNA分子对与其正义链互补的靶位点的抑制活性；每种siRNA每次实验平行做3个复孔，每个实验重复至少2次。 表3所示实验结果表明，正义链从5’端起第14位点的核苷酸为A、U、C、G中任一种时，对其进行化学修饰均能显著降低修饰的siRNA分子对与其正义链互补的基因的表达抑制活性；此外，正义链从5’端起第16位点的核苷酸为A、U、C、G中任一种时，对其进行化学修饰也能在一定程度上降低修饰的siRNA分子对与其正义链互补的基因的表达抑制活性；而第13位点或第15位点的修饰对正义链脱靶效应的影响较小。这个实验结果也表明，siRNA的修饰对正义链脱靶效应的影响是一种与修饰位置相关，而与具体的核酸序列无关的现象，即该效应是一种不依赖于核酸序列的效应。本文中所使用的“不依赖于核酸序列的效应”是指实施方案提供的修饰核苷酸和修饰方式可用于任何siRNA序列而不考虑该siRNA的具体序列。
实施例5.修饰siRNA正/反义链的14位点/16位点对siRNA正义链脱靶效应的影响
如表4所示，选取2条siRNA序列(cdc-2，NPY-305)，合成其未修饰的siRNA分子，以及对siRNA的正义链或反义链从5’端起第14位点或第16位点的核苷酸进行甲氧基修饰的siRNA分子，或同时对正义链和反义链从5’端起第14位点的核苷酸进行甲氧基修饰的siRNA分子，或同时对正义链和反义链从5’端起第16位点的核苷酸进行甲氧基修饰的siRNA分子，修饰和未修饰的siRNA分子如表4所示。按照实施例2所述的方案，构建分别含有与其正义链或反义链互补的分离靶位点的重组萤火虫荧光素酶报告基因质粒(靶位点序列如表1所示)。按照实施例2所述方案，分别检测各种siRNA分子对与其正义链或反义链互补的分离的靶位点的抑制活性。每种siRNA每次实验平行做3个复孔，每个实验重复至少2次。表4所示的实验结果表明，对siRNA中一条组成链的化学修饰仅降低被修饰链对与其互补的基因的表达抑制活性，而不影响另一条未修饰的siRNA组成链对与其互补的基因的表达抑制活性。
实施例6.甲氧基同时修饰siRNA正义链5’端起第14和16位点对正义链脱靶效应的影响
如表5所示，选择5条siRNA序列(CM-01，CM-02，CM-03，CM-04，CM-05)，合成未经修饰的siRNA(表3)及同时对正义链5’端起第14和16位点进行甲氧基修饰的siRNA(表5)。按照实施例2所述实验方案，分别构建含有这些siRNA正义链靶位点的重组萤火虫荧光素酶报告基因质粒(靶位点序列如表1所示)，然后分别将各种siRNA 与重组萤火虫荧光素酶报告基因质粒、pRL-TK(编码海肾萤光素酶)对照质粒共转染入细胞中，24小时后裂解细胞检测两种荧光素酶的活性。表5所示实验结果表明，在不同的siRNA分子中，正义链5’端起第14位点和第16位点是对正义链脱靶效应具有重要影响作用的位点；与未经修饰的siRAN相比，对该两个位点的同时修饰能够显著降低siRNA对相应的正义链靶位点基因表达的抑制作用；与单独修饰第14位点或第16位点的siRNA相比，对两个位点的同时修饰具有一定的协同作用。
实施例7.氟代修饰对siRNA正义链脱靶效应的影响
选择5条siRNA序列(CM-01，CM-02，CM-03，CM-04，CM-05)，合成未经修饰的siRNA(表3)及表6中所示的修饰的siRNA；按照实施例2所述方案，分别构建含有siRNA正义链靶位点的重组萤火虫荧光素酶报告基因质粒(靶位点序列如表1所示)。按照实施例2所述方案，分别检测各种siRNA分子对与其正义链互补的靶位点的抑制活性；每种siRNA每次实验平行做3个复孔，每个实验重复至少2次。表6所示的实验结果表明，对siRNA分子正义链5’端起第14和/或第16位点进行氟代修饰能显著降低修饰的siRNA分子的正义链对与其互补的基因的表达抑制活性。
实施例8.5-甲基胞嘧啶修饰对siRNA正义链脱靶效应的影响
选择表7中所示的siRNA，合成未经修饰的siRNA(表3)及表7中所示的5-甲基胞嘧啶修饰修饰的siRNA；按照实施例2所述方案，分别构建含有siRNA正义链靶位点的重组萤火虫荧光素酶报告基因质粒(靶位点序列如表1所示)。按照实施例2所述方案，分别检测各种siRNA分子对与其正义链互补的靶位点的抑制活性。每种siRNA每次实验平行做3个复孔，每个实验重复至少2次。表7所示的实验结果表明，对siRNA分子正义链5’端起第14和/或第16位点进行5-甲基胞嘧啶修饰能显著降低修饰的siRNA分子的正义链对与其互补的基因的表达抑制活性。
实施例9.5-溴尿嘧啶修饰对siRNA正义链脱靶效应的影响
选择表8中所示的siRNA，合成未经修饰的siRNA(表3)及表8中所示的修饰的siRNA；按照实施例2所述方案，分别构建含有siRNA正义链靶位点的重组萤火虫荧光 素酶报告基因质粒(靶位点序列如表1所示)。按照实施例2所述方案，分别检测各种siRNA分子对与其正义链互补的靶位点的抑制活性；每种siRNA每次实验平行做3个复孔，每个实验重复至少2次。表8所示的实验结果表明，对siRNA分子正义链5’端起第14和/或第16位点进行5-溴尿嘧啶修饰能显著降低修饰的siRNA分子的正义链对与其互补的基因的表达抑制活性。
实施例10.DNA替换修饰对siRNA正义链脱靶效应的影响
选择表9中所示的siRNA，合成未经修饰的siRNA(表3)及表9中所示的DNA碱基修饰的siRNA；按照实施例2所述方案，分别构建含有siRNA正义链靶位点的重组萤火虫荧光素酶报告基因质粒(靶位点序列如表1所示)。按照实施例2所述方案，分别检测各种siRNA分子对与其正义链互补的靶位点的抑制活性。每种siRNA每次实验平行做3个复孔，每个实验重复至少2次。表9所示的实验结果表明，对siRNA分子正义链5’端起第14和/或第16位点的碱基进行DNA替换修饰能显著降低修饰的siRNA分子的正义链对与其互补的基因的表达抑制活性。
以上实施例表明，对siRNA正义链5’端起第14和/或第16位点进行不同方式的化学修饰均能降低由正义链引起的脱靶效应；这个结果进一步表明，siRNA的修饰对正义链脱靶效应的影响是一种与修饰位置相关的现象。
实施例11.siRNA正义链修饰对具有不同长度3’突出末端的siRNA的正义链脱靶效应的影响
如表10所示，合成具有不同长度3’突出末端的siRNA(3’突出末端的核苷酸数目分别为0、1、4、6，为“0”时即为平末端)。按照实施例2所述方案，分别构建含有siRNA正义链靶位点的重组萤火虫荧光素酶报告基因质粒(靶位点序列如表1所示)，然后分别将表10中的siRNA与重组萤火虫荧光素酶报告基因质粒、pRL-TK(编码海肾萤光素酶)对照质粒共转染入细胞中，24小时后裂解细胞检测两种荧光素酶的活性。表10所示的实验结果表明，在具有不同长度的3’突出末端的siRNA分子中，正义链5’端起第14位点和/或第16位点是对正义链脱靶效应具有重要影响的位点；与未经修饰的siRAN相比，对该两个位点的单独修饰或同时修饰能够降低siRNA对相应的正义链靶位点基因表达的抑 制作用，即降低正义链的脱靶效应。
实施例12.siRNA正义链修饰对不同长度siRNA的正义链脱靶效应的影响
如表11所示，合成具有不同长度的siRNA；按照实施例2所述方案，分别构建含有siRNA正义链靶位点的重组萤火虫荧光素酶报告基因质粒(靶位点序列如表1所示)。分别将表11中的siRNA与重组萤火虫荧光素酶报告基因质粒、pRL-TK(编码海肾萤光素酶)对照质粒共转染入细胞中，24小时后裂解细胞检测两种荧光素酶的活性。表11所示的实验结果表明，在具有不同长度的siRNA分子中，正义链5’端起第14位点和/或第16位点是对正义链脱靶效应具有重要影响的位点；与未经修饰的siRAN相比，对该两个位点的单独修饰或同时修饰能够降低siRNA对相应的正义链靶位点基因表达的抑制作用，即降低正义链的脱靶效应。