技术领域
本发明涉及用于培养人细胞尤其是造血细胞的装置和方法。
背景技术
造血细胞在骨髓中由全能干细胞产生，全能干细胞能够复制其自身并且产生所 有其它的造血细胞。这种干细胞产生祖细胞，例如红细胞样祖细胞和髓细胞样祖细 胞，这些细胞定向分化成专门的细胞类型。祖细胞产生分化的具有有限的增殖能力 或不能增殖的细胞。在人中，干细胞和祖细胞表达CD34抗原，而更为分化的造血 细胞则不表达该抗原。
造血细胞衍生自患者或合适供者的骨髓、外周血或脐带血。当患者的凝血和抗 感染功能由于(例如)化疗而受到削弱时，这些细胞可用于重建患者的这些功能。
无关供者的脐带血正越来越多地被用作骨髓清除性(myeloablative)治疗后进 行同种异体移植时的造血细胞来源。虽然利用脐带血有几种优势，但是与可从骨髓 或外周血中获得的细胞相比，对脐带血的利用受到有限的细胞数目的限制。
希望提供一种增加脐带血细胞数目的方法，从而这些脐带血细胞可用于治疗成 年患者。美国专利号5,635,387描述了培养造血细胞的方法。‘387专利描述了在没有 基质细胞层或基质细胞条件培养基的条件下培养造血细胞的方法，据信该方法在该 领域最初的发展中起到了重要作用。当前的扩增方法在细胞扩增室或细胞扩增袋中 进行，这些细胞扩增室或细胞扩增袋并非专用于该目的。没有使用专用系统造成几 个问题。例如，大多数系统不是封闭的系统，这意味着人干细胞的扩增需要熟练的 操作人员和昂贵的设备以进行成功的扩增。即使是熟练的人员和设备非常好的实验 室使用，这种开放的流程也不能保证终产物的无菌，不能达到现有管理推荐和/或 指导中所提供的无菌操作要求。现有的封闭循环系统提供并非为人干细胞扩增专门 设计的非专用系统；而且，这种系统需要复杂、昂贵的设备才能操作。
大多数干细胞扩增方法现在利用含有来自动物的产品的试剂进行操作。使用来 自动物的产品使得这些扩增的细胞群不能在临床上使用。当前，用并非为造血干细 胞扩增而特别设计的不同的培养基来进行造血干细胞的扩增。具体地说，所用试剂 不是由确定的培养基和专用于造血干细胞扩增的生长因子混合物组成。当前所用的 培养基具有不同的浓度和生长因子组合，常常不能满足特定的调节需要如 apirogenicity，不具有使用者友好性，并且没有昂贵的设备和熟练的人员就难以使 用。
本领域仍然需要用于培养人造血干细胞的改进的装置和方法，这些装置和方法 能够实现这些细胞数目的扩增，获得良好的细胞回收，同时又保持无菌和不损害细 胞存活力。
本文所述的发明提供了可用于培养人造血干细胞的装置。然而，该装置也可用 于培养人的其它细胞，包括其它类型的人类干细胞、人肌肉细胞、人皮肤细胞等。
发明概述
本发明提供了一种生物反应器，其包括：反应室；第一端口，适于引入细 胞；第二端口，适于气体交换，所述第二端口包括滤器；第三端口，适于引入 细胞培养基；第四端口，适于细胞取样；以及第五端口，适于在细胞培养后将 其收获。
本发明提供一种体外增加人造血细胞数目的方法，该方法包括：提供上述 的生物反应器；将人造血细胞引入所述第一端口；通过第三端口引入培养基； 和在足以增加细胞数目的条件和时间下培养细胞。
本发明提供一种体外增加人CD34阳性造血细胞数目的方法，该方法包括： 提供CD34阳性人造血细胞；以1×104-5×106细胞/毫升的初始浓度将CD34阳 性细胞接种到含有培养基的生物反应器中，所述培养基含有有效扩增CD34阳性 细胞的生长因子和营养培养基，其中所述生长因子包括Flt-3L、血小板生成素、 白介素-3和干细胞因子；以及在足以增加CD34阳性细胞数目的条件和时间下培 养CD34阳性细胞。
以下将描述本发明的其它特点和优势，其中部分可从这些描述显而易见地 得知。通过在书面说明书和权利要求书中具体描述的用于培养人细胞的装置和 方法，可实现和获得本发明的目的和其它优点。
应理解，前面的一般性描述和下面的详述都是示范性和阐释性的，意在提 供如权利要求所要求的本发明的进一步解释。
附图简述
图1所示为本发明生物反应器的透视图。
图2所示为图1生物反应器的顶视图。
图3所示为可与本发明生物反应器一起使用的管道和无菌袋的顶视图。
发明详述
本发明提供了一种生物反应器，其包括：反应室；第一端口，适于引入细 胞；第二端口，适于气体交换，所述第二端口包括滤器；第三端口，适于引入 细胞培养基；第四端口，适于细胞取样；以及第五端口，适于在细胞培养后将 其收获。在本发明的一个实施方式中，第二端口的滤器是气体可透过性膜滤器。 在本发明的另一个实施方式中，第三端口包括滤器。在本发明的又一个实施方 式中，所述生物反应器还包括适于引入培养基的第六端口，所述第六端口包括 滤器。
在本发明的一个实施方式中，第一端口包括可刺穿的帽。在本发明的另一 个实施方式中，第四端口包括可刺穿的帽。在本发明的一个实施方式中，该生 物反应器适于在细胞培养后通过将细胞导出第五端口来收获细胞。
在本发明的一个实施方式中，所述反应室具有25cm2-600cm2的扩增表面 积。在本发明的另一个实施方式中，所述反应室具有150cm2-250cm2的扩增表 面积。在本发明的一个实施方式中，所述反应室由光洁的(clear)、组织培养 处理的塑料制成。
在本发明的一个实施方式中，该生物反应器包括第一端口附近的标签，该 标签说明可通过第一端口引入细胞。在本发明另一个实施方式中，该生物反应 器包括第二端口附近的标签，该标签说明可通过第二端口交换气体。在本发明 又一个实施方式中，该生物反应器包括第三端口附近的标签，该标签说明可通 过第三端口引入培养基。在本发明一个实施方式中，该生物反应器包括第四端 口附近的标签，该标签说明可通过第四端口对反应室中的内容物取样。在本发 明另一个实施方式中，该生物反应器包括：(i)第三端口附近的标签，该标签 说明可在第0天通过第三端口引入培养基，和(ii)第六端口附近的标签，该标 签说明可在第7天通过第六端口引入培养基。所有的标签都可以附在所述生物 反应器上或者浇铸到生物反应器上。
所述生物反应器可用于培养人细胞，包括人造血干细胞、其它类型的人干 细胞、人肌肉细胞、人皮肤细胞等。
本发明提供一种试剂盒，其包括本发明所述的生物反应器和连接于第五端 口的管道。在本发明一个实施方式中，所述试剂盒包括另外的管道以及一个或 多个无菌袋。在本发明另一个实施方式中，所述试剂盒还包括第一容器中的营 养培养基，以及第二容器中的生长因子Flt-3L、血小板生成素、白介素-3和干细 胞因子。在本发明另一个实施方式中，生长因子存在的浓度为：Flt-3L，1.9微 克/毫升；血小板生成素，1.9微克/毫升；白介素-3，0.17微克/毫升；以及干细 胞因子，1微克/毫升。
本发明提供一种体外增加人造血细胞数目的方法，该方法包括：提供本文 所述的生物反应器；将人造血细胞引入第一端口；通过第三端口引入培养基； 和在足以增加细胞数目的条件和时间下培养细胞。在本发明一个实施方式中， 细胞经培养之后，通过第五端口收获细胞。在本发明另一个实施方式中，该生 物反应器还包括适于引入培养基的第六端口，所述第六端口包括滤器，通过第 三端口引入培养基之后7天，通过第六端口引入培养基。
在本发明一个实施方式中，所述人造血细胞是CD34-阳性。在本发明另一 个实施方式中，所述培养基含有可有效扩增人造血细胞的生长因子和营养培养 基，其中所述生长因子包括Flt-3L、血小板生成素、白介素-3和干细胞因子。在 本发明的实施方式中，所述人造血细胞衍生自人脐带血、人骨髓或人外周血。
本发明提供一种体外增加人造血细胞数目的方法，该方法包括：提供CD34- 阳性的人造血细胞；以1×104-5×106细胞/毫升的初始浓度将CD34-阳性细胞 接种到含有培养基的生物反应器中，所述培养基含有可有效扩增CD34-阳性细 胞的生长因子和营养培养基，其中所述生长因子包括Flt-3L、血小板生成素、 白介素-3和干细胞因子；和在足以增加CD34-阳性细胞数目的条件和时间下培 养CD34-阳性细胞。在本发明一个实施方式中，所述CD34-阳性细胞衍生自人脐 带血、人骨髓或人外周血。在另一个实施方式中，以初始细胞数目为5×105-1.5 ×106个细胞将CD34-阳性细胞接种到生物反应器中。在另一个实施方式中，所 述生物反应器的扩增表面积是25cm2-600cm2。
在本发明一个实施方式中，CD34-阳性人造血细胞的数目增长至少3倍。在 另一个实施方式中，所述造血生长因子基本上由Flt-3L、血小板生成素、白介 素-3和干细胞因子组成。在另一个实施方式中，在培养步骤之后，从培养基中 收获人造血细胞。在本发明实施方式中，培养CD34-阳性细胞4-20天。在另一 个实施方式中，培养CD34-阳性细胞7天，然后在第7天，加入另外的营养培养 基和生长因子，再培养CD34-阳性细胞5天，然后收获。
在本发明一个实施方式中，所述生长因子基本上由Flt-3L、血小板生成素、 白介素-3和干细胞因子组成。在培养步骤开始时，这些生长因子以下面的浓度 存在：Flt-3L，0.01-0.1微克/毫升；血小板生成素，0.01-0.1微克/毫升；白介 素-3，0.001-0.01微克/毫升；以及干细胞因子，0.01-0.1微克/毫升。在另一个 实施方式中，所述生长因子基本上由Flt-3L、血小板生成素、白介素-3和干细胞 因子组成。在培养步骤开始时，这些生长因子以下面的浓度存在：Flt-3L，0.05 微克/毫升；血小板生成素，0.05微克/毫升；白介素-3，0.0043微克/毫升；以 及干细胞因子，0.025微克/毫升。在另一个实施方式中，所述培养基和生物反 应器不包括基质细胞或基质细胞条件培养基。
本发明提供一种试剂，所述试剂基本上由生长因子Flt-3L、血小板生成素、 白介素-3和干细胞因子组成，这些生长因子以下面的浓度存在：Flt-3L，1.9微克/ 毫升；血小板生成素，1.9微克/毫升；白介素-3，0.17微克/毫升；和干细胞因子， 1微克/毫升。
本发明提供一种试剂盒，其包括生物反应器、第一容器中的营养培养基、 以及第二容器中的生长因子Flt-3L、血小板生成素、白介素-3和干细胞因子。在 一个实施方式中，所述试剂盒包括一个或多个注射器。在另一个实施方式中， 所述试剂盒还包括管道和一个或多个无菌袋。在试剂盒的另一个实施方式中， 所述生长因子以下面的浓度存在：Flt-3L，1.9微克/毫升；血小板生成素，1.9微 克/毫升；白介素-3，0.17微克/毫升；以及干细胞因子，1微克/毫升。
在本发明一个实施方式中，人细胞在生物反应器中从脐带血开始培养。在 营养和生长培养基中孵育一段合适的时间后，收集细胞，洗涤以除去残留试剂， 然后使其即可使用。
用于产生造血细胞的培养基含有营养培养基和生长因子(细胞因子)。各 种营养培养基和生长因子都可用于培养造血细胞。可用于本发明的合适营养培 养基包括X-VIVO 20(可购自Cambrex，East Rutherford，美国新泽西州)，或其它 无血清培养基。可在营养培养基中补充加入1-20％的自体血浆或异源血浆。
可包括在营养培养基中的生长因子或细胞因子包括人Flt-3L、血小板生成 素(TPO)、白介素3(IL-3)、干细胞因子(SCF)、人GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集 落刺激因子)和G-CSF(粒细胞集落刺激因子)、白介素1、2和4-7，以及促红细胞 生成素。
图1和2说明了本发明的一种实施方式，其中生物反应器10包括反应室15。 该室具有允许培养基分布并促进细胞生长的合适形状。该室包含与生物材料相 容或已经处理成与生物材料相容的透明聚合材料。
生物反应器15有5个端口(20，21，22，24，26)。端口20(有标签40“细胞 (Cells)”)具有可刺穿的帽以注射细胞。端口21(有标签42“气体(Gas)”)具 有与外部环境进行气体交换的滤器。端口22(有标签44“第0天(Day 0)”)具 有用于在操作流程开始时注射培养基和生长因子的滤器。端口24(有标签46“第 7天(Day 7)”)具有用于在以后的时间中如第7天注射培养基和生长因子的滤器。 端口26(有标签48“取样(Sampling)”)具有可刺穿的膜以进行细胞取样。
通过端口22和24，用注射器递送培养基，通过端口21交换气体。交换的气 体包括氧气和二氧化碳(CO2)。优选地，将CO2含量控制在所需水平，例如5％。 用生理温度孵育生物反应器的内容物，即优选37℃，虽然温度可在25℃-37℃之 间。湿度优选保持在约100％。一旦完成孵育，造血细胞通过管道线31经出口 28脱离生物反应器，所述出口28可通过管道31利用常规的无菌对接系统与收集 袋7相连。生物反应器15向端口28倾斜，细胞流入收集袋7(如图3所示)。在 优选实施方式中，培养时间为10-14天。预先与收集袋7相连的袋8可通过线9装 入洗涤盐水溶液。可通过线12将洗涤溶液引入收集袋7。用无菌滤器11保证洗 涤液体的无菌性。
在本发明一个实施方式中，造血细胞通过以下方式产生：首先通过端口22 将X-VIVO 20营养培养基和生长因子引入反应器。所述生长因子包括IL3、 TPO、SCF和Flt3-L。将所选择的CD34+细胞通过端口20注射入反应室，将生物 反应器放置在处于生理温度和控制的气氛中的培养箱中。孵育所需的一段时间 后，通过端口24加入另外的X-VIVO 20营养培养基和生长因子(如上所述)。
然后将生物反应器返回到培养箱中。在第二次孵育时间结束时，将生物反 应器从培养箱中取出，将细胞收集在收集袋中。
本发明所用试剂通常保存于4℃。优选地，提供的试剂为两个细胞因子混 合物小瓶(细胞因子混合物A和细胞因子混合物B)和两个培养基小瓶(培养基 A和培养基B)。“A”瓶的内容物在第0天加入到反应室中，“B”瓶的内容物 在第7天加入反应室。用注射器将试剂引入反应器。
实施例
用可通过商业途径获得的聚苯乙烯组织培养瓶(例如可从Becton Dickinson Labware，Franklin Lakes，NJ，USA购得的货号35-3028)来制备生物反应器，所 述生物反应器具有以下装备：(1)在培养瓶的上部提供5个端口。两个端口有 聚醚砜(PES)0.2微米滤器。两个端口有可穿孔的连接体；一个端口有气体可 透过性滤膜；(2)第六端口将所述组织培养瓶连接到用于在培养阶段结束时 收集细胞的500ml无菌袋。所述生物反应器的扩增表面积是约175cm2的组织培 养处理的聚苯乙烯。
在第0天，用无菌注射器通过具有0.2微米(μm)无菌滤器的端口引入营养培 养基和生长因子的混合物。所述营养培养基和生长因子的混合物通过以下方式 制备：混合细胞因子组合物(细胞因子混合物A)和60ml X-VIVO 20培养基(培 养基A)，所述细胞因子组合物(细胞因子混合物A)含有悬浮在1560微升营养 培养基中的0.270μg(微克)IL3、3.0μg TPO、1.5μg SCF和3.0μg Flt3-L。在第 0天加入营养培养基和生长因子之后，用另一个专用端口将所选的CD34+细胞接 种到生物反应器中。例如，将1.2×106个所选的细胞接种到61.5毫升营养培养基 中(起始细胞浓度约为20,000细胞/毫升)。所述CD34+细胞的最小存活力为80 ％，最小纯度为70％。
在37℃、约100％湿度、含有约5％CO2的空气气氛中孵育生物反应器内容 物。培养或孵育一周后(即第7天)，用无菌注射器通过另一个具有0.2微米(μm) 无菌滤器的专用端口引入营养培养基和生长因子的混合物。通过以下方式制备 营养培养基和生长因子的混合物：混合细胞因子组合物(细胞因子混合物B) 和30ml X-VIVO 20培养基(培养基B)，所述细胞因子组合物(细胞因子混合物B) 含有悬浮在776微升营养培养基中的0.135μg(微克)IL3、1.5μg TPO、0.75μg SCF和1.5μg Flt3-L。
在培养阶段结束时，通过专用的端口将生物反应器的内容物导出生物反应 器并流入无菌袋中。用标准方法洗涤细胞以除去残留的细胞因子。
该方法通常产生3-40倍的CD34+细胞扩增，总细胞数目扩增30-300倍，平 均约200倍。细胞存活力大于80％。
提供上面的说明书和附图是出于描述本发明实施方式的目的，而非以任何 方式限制本发明。对本领域一般技术人员显而易见的是，可对本发明培养细胞 的装置和方法进行各种改动和变化而不脱离本发明的精神或范围。因此，只要 这些改动和变化落在所附权利要求及其等价形式的范围内，则本发明包括这些 改动和变化。