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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610290828.4 (22)申请日 2016.05.04 (71)申请人 上海米洋杨生物科技有限公司 地址 200233 上海市徐汇区田林路140号16 号楼东楼201-59室 (72)发明人 王晓冰 (51)Int.Cl. C12N 5/079(2010.01) G01N 33/68(2006.01) (54)发明名称 一种构建验证视网膜感光细胞特异性表面 蛋白的方法 (57)摘要 本发明涉及一种构建验证视网膜感光细胞 特异性表面蛋白的方法， 利用本发明所述方法可 以。
2、对纯化的感光细胞前体细胞进行分析筛选， 找 到一种感光细胞所特异的表面蛋白， 其特异性表 达在人胚胎干细胞以及人多能干细胞来源的视 网膜感光细胞膜表面； 从而利用该特异性表面蛋 白对诱导的人胚胎干细胞或人多能干细胞来源 的感光细胞进行纯化。 通过表面蛋白筛选获得的 纯化感光细胞， 可以避免转基因或者应用多种小 分子化合物为诱导剂所带来的潜在危险。 这一关 键科学问题的解决， 将加快干细胞向临床转化的 过程， 符合医学研究的需要， 为人类视网膜相关 疾病(如青光眼、 黄斑性眼病等)的细胞替代治疗 奠定了基础。 权利要求书1页 说明书4页 CN 107345219 A 2017.11.14 CN 。
3、107345219 A 1.一种构建验证视网膜感光细胞特异性表面蛋白的方法， 其特征在于包括如下步骤： (1)利用Talen技术， 建立Crx-GFP的人胚胎干细胞系， 将这种Crx-GFP的人胚胎干细胞 系诱导分化至第6周， 通过FACS筛选， 将表达GFP的感光细胞前体细胞筛选并纯化； (2)应用BD公司的表面蛋白筛选试剂盒对该纯化的感光细胞前体细胞进行筛选， 确定 一种感光细胞表面蛋白； (3)为了证实筛选获得的感光细胞表面蛋白是否仅仅表达在感光细胞上， 将人胚胎干 细胞诱导分化至第6周， 利用FACS技术对该表面蛋白进行筛选， 分别获得表面蛋白阳性和特 异性表面蛋白阴性的细胞； (4)。
4、证实筛选获得的感光细胞表面蛋白是否特异性的表达在感光细胞膜表面； (5)确定筛选获得的感光细胞表面蛋白特异性的表达在感光细胞膜表面后， 为了证实 这种表面蛋白筛选获得的细胞在体外和体内是否具有功能， 将步骤(3)中得到的细胞与色 素细胞系ARPE-19进行共培养， 如果得到的细胞可以成熟， 则得到的细胞与色素细胞系 ARPE-19共培养后， 将会看到感光细胞的外节可以被色素细胞系所吞噬； 在确定了得到的细胞可以形成外节并被色素细胞所吞噬之后， 利用RCS小鼠的动物模 型， 将得到的细胞移植到小鼠眼球视网膜下腔； 观察小鼠的视觉功能是否有部分改善。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于步骤。
5、(3)中， 将获得的表面蛋白阳性和表面 蛋白阴性的细胞培养2周后， 分别进行如下鉴定： (1)是否形成外节； (2)通过电生理检测是 否可以产生动作电位。 3.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于步骤(4)中， 为了证实筛选获得的感光细胞 表面蛋白是否特异性的表达在感光细胞膜表面， 对发育不同时期的人胚胎视网膜组织以及 成年人视网膜组织进行表面蛋白的染色， 观察筛选获得的感光细胞表面蛋白是否特异性地 表达在感光细胞膜表面。 权利要求书 1/1 页 2 CN 107345219 A 2 一种构建验证视网膜感光细胞特异性表面蛋白的方法 技术领域 0001 本发明涉及生物医药领域， 涉及视网膜细胞。
6、方面， 具体涉及一种构建验证视网膜 感光细胞特异性表面蛋白的方法。 背景技术 0002 视网膜是组成视觉系统的关键结构。 临床上， 针对屈光性视觉功能障碍， 已有有效 的治疗方法， 但对视网膜病变， 尤其是外伤、 变性等原因引起的视觉障碍或失明， 目前仍束 手无策。 由于视网膜来源于神经外胚层， 具有典型的中枢神经组织结构特点， 对损伤敏感， 且难以再生， 使其成为难治性眼病的症结所在， 也是眼科研究的重点、 难点和亟待攻克的领 域。 多年来， 国内外众多的研究人员为此开展了广泛的探索， 国家科技部也分别于2005年、 2007年和2012年分别设立了三个 “973” 项目予以攻关。 此外， 。
7、因结构明晰、 功能清楚， 且便于 操作和观察， 视网膜也是研究中枢神经结构、 功能， 乃至再生的重要窗口。 0003 尽管一些低等动物的视网膜具有一定的再生能力， 但一般认为哺乳类动物， 尤其 是灵长类动物的视网膜是不具有这种能力。 因此， 如何激发视网膜内在的再生潜能或通过 外源性细胞的植入， 以达到修复视网膜结构甚至功能， 成为近10多年来的研究热点。 0004 纵观近十年来的视网膜再生研究， 在干细胞来源、 干细胞诱导分化、 动物模型制备 及干细胞移植方式上已经取得了一定的进展， 但仍存在诸多问题有待解决。 0005 目前通过干细胞诱导分化所获得的视网膜细胞通常是多种细胞的混合， 而视网。
8、膜 疾病的发病早期多数仅累及一种细胞， 因此， 如果能够获得某种纯化的细胞， 且在视网膜疾 病的发病早期将纯化的细胞移植到体内， 则可以从两个方面对患者的视觉功能进行改善： 首先， 移植的纯化细胞可以改善患者局部的微环境， 从而有利于患者自身残存细胞的生存； 其次， 移植的纯化细胞可以部分替代受损细胞， 从而改善患者的视觉功能。 0006 细胞替代疗法治疗神经元退行性疾病首要解决的问题是细胞纯度的问题。 其原因 显而易见， 首先， 将诱导分化的细胞在体外进行药物筛选或功能鉴定时， 混杂的其它细胞将 会影响结果的可靠性； 其次， 如果将混杂的细胞移植到模型动物体内， 将会产生异常增生甚 至致瘤的。
9、风险。 虽然目前已经有很多研究致力于提高节细胞的诱导分化率， 例如： 将Math5 转染到干细胞， 然后通过FACS筛选来获得纯化的节细胞， 然而， 这些方法存在致命缺陷， 即： 将报告载体转染到干细胞内会导致干细胞基因组的改变， 从而限制了其临床应用。 发明内容 0007 本发明的目的在于一种构建验证视网膜感光细胞特异性表面蛋白的方法， 从而找 到感光细胞特异性表面蛋白， 用于人胚胎干细胞/人多能干细胞来源的视网膜感光细胞的 纯化， 从而加快临床利用细胞移植替代疗法治疗人类视网膜相关疾病(如青光眼、 黄斑性眼 病等)。 0008 本发明的具体技术方案如下： 0009 一种构建验证视网膜感光细。
10、胞特异性表面蛋白的方法， 包括如下步骤： 说明书 1/4 页 3 CN 107345219 A 3 0010 (1)利用Talen技术， 建立Crx-GFP的人胚胎干细胞系， 将这种Crx-GFP的人胚胎干 细胞系诱导分化至第6周， 通过FACS筛选， 将表达GFP的感光细胞前体细胞筛选并纯化； 0011 (2)应用BD公司的表面蛋白筛选试剂盒对该纯化的感光细胞前体细胞进行筛选， 确定一种感光细胞表面蛋白； 0012 (3)为了证实筛选获得的感光细胞表面蛋白是否仅仅表达在感光细胞上， 将人胚 胎干细胞诱导分化至第6周， 利用FACS技术对该表面蛋白进行筛选， 分别获得表面蛋白阳性 和特异性表面。
11、蛋白阴性的细胞； 0013 (4)证实筛选获得的感光细胞表面蛋白是否特异性的表达在感光细胞膜表面； 0014 (5)确定筛选获得的感光细胞表面蛋白特异性的表达在感光细胞膜表面后， 为了 证实这种表面蛋白筛选获得的细胞在体外和体内是否具有功能， 将步骤(3)中得到的细胞 与色素细胞系ARPE-19进行共培养， 如果得到的细胞可以成熟， 则得到的细胞与色素细胞系 ARPE-19共培养后， 将会看到感光细胞的外节可以被色素细胞系所吞噬； 0015 在确定了得到的细胞可以形成外节并被色素细胞所吞噬之后， 利用RCS小鼠的动 物模型， 将得到的细胞移植到小鼠眼球视网膜下腔； 观察小鼠的视觉功能是否有部分。
12、改善。 如果得到的细胞具有功能， 则该细胞移植后的一段时期内， 通过一系列功能学检测， 我们将 会看到小鼠的视觉功能有部分改善。 0016 步骤(3)中， 将获得的表面蛋白阳性和表面蛋白阴性的细胞培养2周后， 分别进行 如下鉴定： (1)是否形成外节； (2)通过电生理检测是否可以产生动作电位。 0017 步骤(4)中， 为了证实筛选获得的感光细胞表面蛋白是否特异性的表达在感光细 胞膜表面， 对发育不同时期的人胚胎视网膜组织以及成年人视网膜组织进行表面蛋白的染 色， 观察筛选获得的感光细胞表面蛋白是否特异性地表达在感光细胞膜表面。 0018 采用本发明所述的验证视网膜感光细胞特异性表面蛋白的方。
13、法， 通过筛选确定一 种表面蛋白特异性表达在人胚胎干细胞以及人多能干细胞来源的视网膜感光细胞膜表面； 利用FACS技术对这种表面蛋白进行筛选， 可以将诱导的人胚胎干细胞或人多能干细胞来源 的感光细胞进行纯化。 将这种纯化的感光细胞进行贴壁培养， 可以观察到形成外节； 另外， 将这种感光细胞与色素细胞系ARPE-19共培养， 看到感光细胞的外节可以被色素细胞系所 吞噬； 将纯化的感光细胞移植到小鼠眼球视网膜下腔， 移植后的一段时期内， 通过一系列功 能学检测， 我们将会看到小鼠的视觉功能有部分改善。 0019 利用本发明所述方法可以对纯化的感光细胞前体细胞进行分析， 通过数模分析， 找到一种感光。
14、细胞所特异的表面蛋白， 其特异性表达在人胚胎干细胞以及人多能干细胞来 源的视网膜感光细胞膜表面； 从而利用该特异性表面蛋白对诱导的人胚胎干细胞或人多能 干细胞来源的感光细胞进行纯化。 通过表面蛋白筛选获得的纯化感光细胞， 可以避免转基 因或者应用多种小分子化合物为诱导剂所带来的潜在危险。 这一关键科学问题的解决， 将 加快干细胞向临床转化的过程， 符合医学研究的需要， 为人类视网膜相关疾病(如青光眼、 黄斑性眼病等)的细胞替代治疗奠定了基础。 具体实施方式 0020 本发明所述的 “人胚胎干细胞诱导分化” 采用申请号为201210301765.X， 名称为 “一种诱导人多能干细胞分化为视网膜前。
15、体细胞的方法” 中提到的方法。 本发明其他未提及 说明书 2/4 页 4 CN 107345219 A 4 部分均为现有技术。 0021 报告细胞系构建技术： 目前已有的报告细胞系构建技术包括传统的锌指蛋白技 术、 Talen技术和Cas9技术， 我们采用Talen技术进行报告细胞系的构建。 0022 一种构建验证视网膜感光细胞特异性表面蛋白的方法， 包括如下步骤： 0023 (1)利用Talen技术， 建立Crx-GFP的人胚胎干细胞系， 将这种Crx-GFP的人胚胎干 细胞系诱导分化至第6周， 通过FACS筛选， 将表达GFP的感光细胞前体细胞筛选并纯化； 0024 (2)应用BD公司的表。
16、面蛋白筛选试剂盒对该纯化的感光细胞前体细胞进行筛选， 确定一种感光细胞表面蛋白； 0025 (3)为了证实筛选获得的感光细胞表面蛋白是否仅仅表达在感光细胞上， 将人胚 胎干细胞诱导分化至第6周， 利用FACS技术对该表面蛋白进行筛选， 分别获得表面蛋白阳性 和特异性表面蛋白阴性的细胞， 培养2周后， 分别进行如下鉴定： (1)是否形成外节； (2)通过 电生理检测是否可以产生动作电位； 0026 (4)证实筛选获得的感光细胞表面蛋白是否特异性的表达在感光细胞膜表面， 对 发育不同时期的人胚胎视网膜组织以及成年人视网膜组织进行表面蛋白的染色， 观察筛选 获得的感光细胞表面蛋白是否特异性地表达在感。
17、光细胞膜表面； 0027 (5)确定筛选获得的感光细胞表面蛋白特异性的表达在感光细胞膜表面后， 为了 证实这种表面蛋白筛选获得的细胞在体外和体内是否具有功能， 将步骤(3)中得到的细胞 进行功能学检测； 检测方法如下： 0028 a、 将步骤(3)中得到的细胞与色素细胞系ARPE-19进行共培养， 如果得到的细胞可 以成熟， 则得到的细胞与色素细胞系ARPE-19共培养后， 将会看到感光细胞的外节可以被色 素细胞系所吞噬； 0029 b、 在确定了得到的细胞可以形成外节并被色素细胞所吞噬之后， 利用RCS小鼠的 动物模型， 将得到的细胞移植到小鼠眼球视网膜下腔； 观察小鼠的视觉功能是否有部分改。
18、 善。 0030 视网膜感光细胞特异性表面蛋白的筛选 0031 报告细胞系的建立： 利用Talen的同源重组技术， 将编码GFP的序列插入到H9人胚 胎干细胞系的Crx基因位点， 从而建立报告细胞系。 上述Crx-GFP的人胚胎干细胞系中的Crx 可以根据不同的视网膜疾病(如青光眼、 黄斑性眼病等)进行确定， 如： Brn3、 Math5或者Tuj- 1等。 以Brn3报告细胞系的建立为例， 利用Talen的同源重组技术， 将编码GFP的序列插入到 H9人胚胎干细胞系的Brn3基因位点， 从而建立报告细胞系。 0032 利用Talen技术， 建立Crx-GFP的人胚胎干细胞系， 通过申请号为2。
19、01210301765.X 中所建立的诱导分化方案， 将这种Crx-GFP的人胚胎干细胞系诱导分化至第6周左右。 通过 FACS筛选， 将表达GFP的感光细胞前体细胞筛选并纯化。 应用BD公司所提供的表面蛋白筛选 试剂盒， 对纯化的感光细胞前体细胞进行分析， 通过数模分析， 找到一种感光细胞所特异的 表面蛋白。 0033 2.通过感光细胞特异性表面蛋白筛选并纯化人胚胎干细胞来源的视网膜细胞 0034 为了证实筛选获得的感光细胞特异性表面蛋白是否仅仅表达在感光细胞上， 我们 将人胚胎干细胞诱导分化至第6周， 通过FACS筛选分别获得表面蛋白阳性和表面蛋白阴性 的细胞， 培养2周后， 分别进行如下。
20、鉴定： (1)是否形成外节； (2)通过电生理检测是否可以产 说明书 3/4 页 5 CN 107345219 A 5 生动作电位。 0035 通过感光细胞特异性表面蛋白筛选并纯化诱导的人多能干细胞来源的视网膜细 胞 0036 为了证实筛选获得的感光细胞特异性表面蛋白不仅可以用来筛选人胚胎干细胞 来源的视网膜细胞， 同时也可以用来筛选诱导的人多能干细胞来源的视网膜细胞， 从而加 快干细胞治疗从实验室走向临床， 我们应用同样的手段， 筛选出表面蛋白阳性和表面蛋白 阴性的细胞， 然后应用同样的鉴定方法进行验证。 0037 筛选获得的感光细胞特异性表面可以表达在人胚胎及成年人的视网膜感光细胞 膜表面。
21、 0038 通过我们前期的收集工作， 我们获得了不同时期的人胚胎视网膜组织以及成年人 视网膜组织。 为了证实筛选获得的感光细胞表面蛋白仅仅特异性表达在感光细胞膜表面， 我们对发育不同时期的人胚胎视网膜组织以及成年人视网膜组织进行表面蛋白的染色， 观 察筛选获得的感光细胞表面蛋白是否特异性地表达在感光细胞膜表面。 0039 将纯化的感光细胞与色素细胞系ARPE-19 0040 通过以上鉴定， 基本可以确定我们所筛选获得的感光细胞表面蛋白是感光细胞所 特有的， 但通过这种表面蛋白筛选获得的感光细胞在体外是否可以形成外节并被RPE细胞 所吞噬， 我们希望通过与色素细胞系ARPE-19的共培养来初步确。
22、定， 培养基为视网膜诱导分 化培养基。 如果纯化的感光细胞可以成熟， 则感光细胞与色素细胞系ARPE-19共培养后， 我 们将会看到感光细胞的外节可以被色素细胞系所吞噬。 0041 将纯化的感光细胞移植到RCS小鼠眼球的视网膜下腔内 0042 在确定了纯化的感光细胞可以形成外节并被色素细胞所吞噬， 我们希望证实纯化 的感光细胞在体内是否具有功能。 因此， 我们利用RCS小鼠的动物模型， 将纯化的感光细胞 移植到小鼠眼球视网膜下腔。 如果纯化的感光细胞具有功能， 则感光细胞移植后的一段时 期内， 通过一系列功能学检测， 我们将会看到小鼠的视觉功能有部分改善。 0043 统计学分析： 细胞球阳性率。
23、的统计， 随机选取3张切片， 每张切片随机选取5个视 野， 用ImageJ软件对细胞进行计数。 使用SPSS12.0软件， 采用t-test进行统计学分析， P 0.05为具有统计学意义。 0044 采用本发明所述方法可以对纯化的感光细胞前体细胞进行分析， 通过数模分析， 找到一种感光细胞所特异的表面蛋白， 其特异性表达在人胚胎干细胞以及人多能干细胞来 源的视网膜感光细胞膜表面； 从而利用该特异性表面蛋白对诱导的人胚胎干细胞或人多能 干细胞来源的感光细胞进行纯化。 这一关键科学问题的解决， 将加快干细胞向临床转化的 过程， 符合医学研究的需要， 为人类视网膜相关疾病(如青光眼、 黄斑性眼病等)的细胞替代 治疗奠定了基础。 说明书 4/4 页 6 CN 107345219 A 6 。