一种提纯纽莫康定Bsub0/sub的方法.pdf

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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410051009.5 (22)申请日 2014.02.14 C07K 7/56(2006.01) C07K 1/14(2006.01) (73)专利权人 博瑞生物医药泰兴市有限公司 地址 225400 江苏省泰州市泰兴市经济开发 区滨江南路 (72)发明人 王其龙 朱海 吴长军 施成 张致慧 WO 2005026323 A2,2005.03.24, WO 2004042350 A2,2004.05.21, CN 102295686 A,2011.12.28, WO 2008048627 A1,2008.04.24, CN 1016。

2、59693 A,2010.03.03, CN 102816207 A,2012.12.12, US 2002028916 A1,2002.03.07, Joseph Nti-Gyabaah et al.Normal phase high-performance liquid chromatography of pneumocandins:In situ modification of Silica with L-Proline to separate structural analogues.Biotechnology progress .2006, 第 22 卷 ( 第 2 期 ), Rou。

3、sh et al.Influence of mobile phase composition and thermodynamics on the normal phase chromatography of echinocandins.Journal of chromatography .2005, 第 1098 卷 ( 第 1-2 期 ), (54) 发明名称 一种提纯纽莫康定 B0的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种高效提纯纽莫康定B0纯度 的方法， 包括 ：（1）将含有纽莫康定 B0的发酵液 pH 调至 2.0 4.0， 过滤， 浸提纽莫康定 B0的浸提 液 ；（2） 浸提液浓缩后加。

4、入硅藻土裹晶， 再加入水 搅拌， 离心 ；（3） 离心固体用乙醇溶解， 加入活性 炭脱色过滤 ；（4） 滤液浓缩， 加入氯仿过硅胶柱， 收集纽莫康定 B0的过柱液 ；（5） 纽莫康定 B0的过 柱液浓缩至干， 在多相溶剂体系下结晶， 得到纽莫 康定 B0。本发明的纽莫康定 B0的提取方法可以大 大减少树脂柱使用和冲洗的溶剂量， 而且通过活 性炭能有效去除色素， 通过硅胶柱层析能够有效 的去除相关物质 C0， 提取的纯度可达到 99%。同时 工艺简便易行， 成本大幅度降低， 易于实现工业化 生产。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 黎舒婷 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (。

5、12)发明专利 权利要求书1页 说明书8页 附图1页 CN 103936837 B 2016.05.25 CN 103936837 B 1.一种提纯纽莫康定B0的方法， 包括以下步骤： （1） 将含有纽莫康定B0的发酵液pH调至2.04.0， 过滤， 菌渣用低分子醇浸提， 得浸提 液； （2） 将步骤 （1） 所得的浸提液蒸馏出低分子醇， 并浓缩至浓缩混合物中液体所含的纽莫 康定B0 100mg/L， 然后向浸提液浓缩混合物中加入硅藻土裹晶， 加去离子水离心得到含 有纽莫康定B0的白色固体； （3） 将步骤 （2） 所得的离心固体加入乙醇溶解， 充分搅拌， 再加入活性炭， 充分搅拌脱 色， 过。

6、滤得到无色滤液； （4） 将步骤 （3） 所得的无色滤液浓缩至纽莫康定B0含量为250000300000mg/L， 加入氯 仿混合均匀， 过硅胶柱， 并用氯仿与甲醇的混合液对硅胶柱进行预洗、 洗脱， 收集洗脱液； （5） 将步骤 （4） 所得的洗脱液浓缩至氯仿含量 0.5%， 然后将洗脱液浓缩混合物加入多 相溶剂体系中溶解、 析晶， 得到潮晶， 并在真空下干燥得成品； 所述步骤 （2） 中硅藻土的目数为100150， 所述硅藻土的加入重量为浸提液浓缩混合 物重量的36倍， 并使硅藻土充分吸附浸提液浓缩混合物中的纽莫康定B0； 所述去离子水 的加入重量为浸提液浓缩混合物与硅藻土的重量之和， 加入。

7、去离子水后并充分搅拌； 所述步骤 （3） 中加入的乙醇的重量为离心固体重量的24倍； 所述活性炭的目数为140 200， 所述活性炭的加入重量为离心固体重量的0.050.1倍； 所述步骤 （4） 中过硅胶柱上柱液为滤液浓缩得到的滤液浓缩混合物加入氯仿并充分搅 拌、 溶解制成的氯仿溶液， 加入氯仿的量为滤液浓缩得到滤液浓缩混合物重量的36倍； 所述步骤 （4） 中硅胶柱使用的硅胶目数为200400， 所述硅胶使用量为滤液浓缩混合 物重量的23倍； 装柱溶剂为氯仿， 装柱所使用的氯仿量为硅胶重量的12倍； 冲柱溶剂为 氯仿， 冲柱所使用的氯仿量为滤液浓缩混合物重量的38倍； 上柱量为硅胶使用量的0。

8、.1 0.2倍； 所述步骤 （4） 中对吸附完全的硅胶柱预洗所使用的氯仿与甲醇的混合液中氯仿与甲醇 的质量比为5： 1， 所述预洗的终点为预洗液中无前杂； 对预洗后的硅胶柱进行洗脱所使用的 氯仿与甲醇的混合液中氯仿与甲醇的质量比为3： 1， 所述洗脱的终点为洗脱液中无纽莫康 定B0； 所述预洗液中前杂和洗脱液中纽莫康定B0测定均采用TLC监控， 硅胶板为正相硅胶板； 所述预洗液中前杂测定时TLC点板展开剂为氯仿与甲醇按质量比8:1组成的混合液； 所述洗 脱液中纽莫康定B0测定时TLC点板展开剂为氯仿与甲醇按质量比2:1组成的混合液； 所述 TLC点板显色剂为磷钼酸， 热风枪烘烤显色； 所述步骤。

9、 （5） 中多相溶剂体系为乙酸乙酯、 异丙醇、 石油醚的一种或几种的组合； 所述 多相溶剂的量为洗脱液浓缩混合物重量的58倍； 所述步骤 （5） 中溶解温度为5060， 析晶温度为05； 所述干燥的条件为温度为 45.050.0， 真空度 -0.07MPa， 干燥时间为1824h； 干燥后固体水份 2%； 步骤 （2） 、（4） 、（5） 中所述的浓缩为真空条件下， 浓缩温度 50， 真空度 -0.07MPa。 权利要求书 1/1 页 2 CN 103936837 B 2 一种提纯纽莫康定B0的方法 技术领域 0001 本发明属于药物化学领域， 具体涉及一种提纯纽莫康定B0的方法。 背景技术 。

10、0002 PneumocandinsB0 （简称PB0） 是由霉菌Glarealozoyensis发酵合成的次级代谢 产物。 Glarealozoyensis发酵产物除目标产物之外， 有C0等组份， 还包括有大量的色素等 其他杂质， 因此PB0的提取纯化工艺难度较大。 0003 中国发明专利200910133118.0公开了制备纽莫康定B0的方法， 主要步骤是： a)离 心纽莫康定B0发酵液， 取菌丝体， 用甲醇浸提纽莫康定B0； b） 降甲醇浸提液蒸干， 再用正丁醇 浸提纽莫康定B0； c） 将正丁醇浸提液蒸干， 再用7080%甲醇浸提纽莫康定B0， 过酸性氧化铝 柱， 收集流出液； d） 。

11、将纽莫康定B0收集蒸干后， 用6070%甲醇溶解， 上HP20吸附树脂， 用85 95%甲醇洗脱， 收集洗脱液纽莫康定B0纯度在5065%间； e） 将纽莫康定B0收集液蒸干， 溶 于反相树脂YPR-II， 用8595%甲醇洗脱， 收集纽莫康定B0纯度大于90%； f） 将纽莫康定B0收 集液蒸干后， 用甲醇溶解， 滴加少量水使之过饱和结晶析出， 制得纽莫康定B0， 纯度可达到 96%。 0004 中国专利201110266790.4公开了一种纽莫康定B0的提取纯化方法， 主要包括： a） 将含有纽莫康定B0的发酵液pH值调至2.04.0， 过滤， 菌渣用低分子醇浸提， 得浸提液； b） 调整。

12、浸提液的醇浓度至3050%(V/V),pH为6.08.0； c） 用吸附树脂吸附浸提液后， 依次 用水、 3050%(V/V)丙酮-水溶液冲洗树脂， 然后用pH值为3.05.0的50%80%(V/V)丙酮- 酸溶液洗脱树脂， 收集富含纽莫康定B0的洗脱液； d） 纽莫康定B0洗脱液加水稀释至丙酮浓度 为3050%(V/V),用吸附树脂吸附， 用水冲洗树脂后用低分子醇洗脱， 收集富含纽莫康定 B0的洗脱液； e） 以常规方法结晶得纽莫康定B0。 0005 现有技术主要采用的是树脂柱工艺， 均未对相关物质C0的检测和控制进行描述， C0 （见图1,R1位为羟基， R2位为氢） 是纽莫康定B0（R2。

13、位为羟基， R1位为氢） 的异构体， 在结构上 的差异表现为一个羟基位置的不同； C0杂质不能在反相色谱中与纽莫康定B0分离， 只有通过 正相色谱分离。 发酵液中的C0杂质一般10%， 如果不能得到有效的控制， 最后得到的是纽莫 康定B0和C0的混合物。 C0杂质能参与后续反应， 严重影响醋酸卡泊芬净的质量。 通过本专利， 能够有效的控制C0的含量， 降到C0 0.2%。 发明内容 0006 为了克服现有技术的不足， 本发明提供了一种提取纯化产业化成本低、 周期短， 且 能有效控制相关物质C0的提纯纽莫康定B0的方法。 0007 为了实现上述目的， 本发明采用的技术方案如下： 0008 一种提。

14、纯纽莫康定B0的方法， 包括以下步骤： 0009 （1） 将含有纽莫康定B0的发酵液pH调至2.04.0， 过滤， 菌渣用低分子醇浸提， 得 浸提液； 说明书 1/8 页 3 CN 103936837 B 3 0010 （2） 将步骤 （1） 所得的浸提液蒸馏出低分子醇， 并浓缩至浓缩混合物中液体所含的 纽莫康定B0 100mg/L， 然后向浸提液浓缩混合物中加入硅藻土裹晶， 加去离子水离心得 到含有纽莫康定B0的白色固体； 0011 （3） 将步骤 （2） 所得的离心固体加入乙醇溶解， 充分搅拌， 再加入活性炭， 充分搅拌 脱色， 过滤得到无色滤液； 0012 （4） 将步骤 （3） 所得的。

15、无色滤液浓缩至纽莫康定B0含量为250000300000mg/L， 加 入氯仿混合均匀， 过硅胶柱， 并用氯仿与甲醇的混合液对硅胶柱进行预洗、 洗脱， 收集洗脱 液； 0013 （5） 将步骤 （4） 所得的洗脱液浓缩至氯仿含量 0.5%， 然后将洗脱液浓缩混合物加 入多相溶剂体系中溶解、 析晶， 得到潮晶， 并在温度45.050.0， 真空度 -0.07MPa的条 件下干燥得成品。 0014 所述步骤 （2） 中硅藻土的目数为100150， 所述硅藻土的加入重量为浸提液浓缩 混合物重量的36倍， 并使硅藻土充分吸附浸提液浓缩混合物中的纽莫康定B0； 所述去离 子水的加入重量为浸提液浓缩混合物。

16、与硅藻土的重量之和， 加入去离子水后并充分搅拌。 0015 所述步骤 （3） 中加入的乙醇的重量为离心固体重量的24倍； 所述活性炭的目数 为140200， 所述活性炭的加入重量为离心固体重量的0.050.1倍。 0016 所述步骤 （4） 中过硅胶柱上柱液为滤液浓缩得到的滤液浓缩混合物加入氯仿并充 分搅拌、 溶解制成的氯仿溶液， 加入氯仿的量为滤液浓缩得到滤液浓缩混合物重量的36 倍。 0017 所述步骤 （4） 中硅胶柱使用的硅胶目数为200400， 所述硅胶使用量为滤液浓缩 混合物重量的23倍； 装柱溶剂为氯仿， 装柱所使用的氯仿量为硅胶重量的12倍； 冲柱溶 剂为氯仿， 冲柱所使用的氯。

17、仿量为滤液浓缩混合物重量的38倍； 上柱量为硅胶使用量的 0.10.2倍。 0018 所述步骤 （4） 中对吸附完全的硅胶柱预洗所使用的氯仿与甲醇的混合液中氯仿与 甲醇的质量比为5： 1， 所述预洗的终点为预洗液中无前杂； 对预洗后的硅胶柱进行洗脱所使 用的氯仿与甲醇的混合液中氯仿与甲醇的质量比为3： 1， 所述洗脱的终点为洗脱液中无纽 莫康定B0。 0019 所述预洗液中前杂和洗脱液中纽莫康定B0测定均采用TLC监控， 硅胶板为正相硅 胶板； 所述预洗液中前杂测定时TLC点板展开剂为氯仿与甲醇按质量比8:1组成的混合液； 所述洗脱液中纽莫康定B0测定时TLC点板展开剂为氯仿与甲醇按质量比2:。

18、1组成的混合液； 所述TLC点板显色剂为磷钼酸， 热风枪烘烤显色。 0020 所述步骤 （5） 中多相溶剂体系为乙酸乙酯、 异丙醇、 石油醚的一种或几种的组合； 所述多相溶剂的量为洗脱液浓缩混合物重量的58倍。 0021 所述步骤 （5） 中溶解温度为5060， 析晶温度为05； 所述干燥的条件为温度 为45.050.0； 真空度 -0.07MPa， 干燥时间为1824h； 干燥后固体水份 2%。 0022 步骤 （2） 、（4） 、（5） 中的所述的浓缩为真空条件下， 浓缩温度 50， 真空度 - 0.07MPa。 0023 所述纽莫康定B0的分子结构式为： 说明书 2/8 页 4 CN 1。

19、03936837 B 4 0024 0025 本发明提供的一种提纯纽莫康定B0的方法， 具有以下有益效果： 0026 （1） 浸提液浓缩混合物经裹晶、 离心、 加乙醇溶解后采用活性炭脱色去除色素， 将 红棕色转变成无色液体， 有效去除了液体中的色素， 提高了产品纯度与质量。 0027 （2） 无色滤液浓缩后使用硅胶过柱， 不使用传统工艺的树脂过柱， 能有效去除大部 分的杂质， 同时进一步降低了成本。 0028 （3） 洗脱液浓缩混合物采用在多相溶剂体系中结晶能进一步去除杂质， 尤其是 0029 对相关物质C0有显著的去除效果， 提高了产品质量。 综上， 本发明能有效去除反 应体系中的色素、 杂。

20、质， 尤其是对相关物质C0 0030 去除效果明显， 获得的产品质量较高， 而且整个工艺流程简便易行， 成本大幅度 0031 降低， 易于实现工业化生产。 附图说明 0032 图1是本发明的工艺流程图。 具体实施方式 0033 下面参照附图并结合具体实施例对本发明作进一步的说明。 0034 实施例1 0035 11吨发酵液先转移到酸化罐， 用草酸将发酵液的pH值调至2.04.0， 板框压滤。 得 菌渣1200kg， 加入6吨75%的乙醇溶液， 搅拌6小时， 再次板框压滤， 得浸提液6吨。 0036 浸提液再次转移到1000L搪瓷釜中， 控制温度 50， 真空度 -0.07MPa真空浓 说明书 。

21、3/8 页 5 CN 103936837 B 5 缩， 浓缩过程中， 观察料液变浑浊后， 取样离心， 清液送检含量， 当清液中纽莫康定B0含量 48mg/L时停止浓缩， 得浸提液浓缩混合物50kg； 浸提液浓缩混合物中加入200kg规格为100 目的硅藻土充分吸附， 裹晶， 再加入250kg去离子水搅拌， 离心， 得到含有纽莫康定B0的白色 固体， 收集离心固体260kg。 0037 将260kg离心固体用800kg的乙醇溶解， 搅拌1小时， 加入20kg规格为140目的活性 炭， 搅拌2小时， 脱色， 过滤得无色滤液。 0038 无色滤液在釜内控制温度 50， 真空度 -0.07MPa下浓缩。

22、， 浓缩至纽莫康定B0 含量为285000mg/L， 得到滤液浓缩混合物重量80kg。 0039 500L硅胶柱湿法装柱， 称取160kg规格为200目的硅胶， 加入300kg氯仿搅拌均匀装 柱， 用240kg氯仿冲柱， 出口处收集420kg的氯仿时冲柱结束， 准备上样； 0040 样品溶解： 将滤液浓缩混合物中加入240kg重量的氯仿， 混合均匀， 制得上柱样品 溶液； 0041 上样吸附： 将溶解好的样品通过已装好的硅胶柱吸附； 每次上样的样品溶液为 20kg， 吸附过程出口阀全开， 自然流速； 以氯仿： 甲醇质量比5:1进行预洗， 出口阀全开， 自然 流速， 预洗至经TLC检测无前杂； 。

23、使用氯仿： 甲醇质量比3:1进行洗脱， 出口阀全开， 自然流 速， 洗脱至经TLC检测无产品后停止； 使用HPLC方法检测收集C0 5.0%的产品， 收集合格的 洗脱液总重900kg。 0042 将洗脱液进釜， 控制温度 50， 真空度 -0.07MPa减压浓缩至氯仿含量 0.5%， 得到干粉， 称重15kg， 即为纽莫康定B0粗品。 0043 粗品加入100kg的多相溶剂体系， 溶剂体系为由乙酸乙酯、 异丙醇、 石油醚按83： 12： 5组成的混合液， 升温至5060， 搅拌溶解， 降温至05结晶2小时； 析晶， 离心， 得固体 潮晶； 将潮晶放入真空干燥箱， 控制浓缩温度45.050.0，。

24、 真空度 -0.07MPa， 干燥20h， 即得到成品14.5kg， 水份1.13%； 0044 制得的成品用HPLC方法分析相关物质C0正相纯度0.02%， 纽莫康定B0正相纯度 99.98%， 反相纯度99.1%。 0045 TLC薄层色谱检测方法为： 0046 预洗液中前杂测定时TLC点板， 硅胶板为正相硅胶板， 展开剂为氯仿与甲醇按质量 比8:1组成的混合液， 显色剂为磷钼酸， 热风枪烘烤显色。 0047 洗脱液中纽莫康定B0测定时TLC点板， 硅胶板为正相硅胶板， 展开剂为氯仿与甲醇 按质量比2:1组成的混合液， 显色剂为磷钼酸， 热风枪烘烤显色。 0048 HPLC高效液相色谱检测。

25、方法为： 0049 反相方法： 0050 成品样品处理用无水乙醇 0051 测定柱： C18柱， 4.6mm250mm5um， 柱温： 25； 采用梯度洗脱， 流动相A相为乙 腈， B相为0.05mol/L磷酸二氢钠水溶液， 梯度见下表所示； 流速为1.0mL/min； 检测器为DAD 或VWD， 测定波长210nm； 溶样溶剂为60%甲醇水溶液， 进样浓度为1.5mg/mL， 进样量为10uL。 0052 梯度洗脱表 说明书 4/8 页 6 CN 103936837 B 6 0053 0054 纽莫康定B0的保留时间tR=24.6min， 理论塔板数N=14000。 0055 正相方法 00。

26、56 样品处理用流动相 0057 测定柱： SiO2柱， 4.6mm250mm5um， 柱温： 25； 采用等度洗脱， 流动相为氯 仿： 乙醇=75:25 （V/V） ； 流速为1.0mL/min； 检测器为DAD或VWD， 测定波长234nm(276nm)； 溶样 溶剂为流动相， 进样浓度为500mg/L， 进样量为10uL， 运行时间为25min。 0058 纽莫康定B0的保留时间tR=12.4min， 相关物质C0的保留时间t=18.4min， 理论塔板 数N=3200。 0059 实施例2 0060 11吨发酵液先转移到酸化罐， 用草酸将发酵液的pH值调至2.04.0， 板框压滤。 得。

27、 菌渣1200kg， 加入6吨75%的乙醇溶液， 搅拌6小时， 再次板框压滤， 得浸提液5.8吨。 0061 浸提液再次转移到1000L搪瓷釜中， 控制温度 50， 真空度 -0.07MPa真空浓 缩， 浓缩过程中， 观察料液变浑浊后， 取样离心， 清液送检含量， 当清液中纽莫康定B0含量 30mg/L时停止浓缩， 得浸提液浓缩混合物46kg； 浸提液浓缩混合物中加入260kg规格为100 目的硅藻土充分吸附， 裹晶， 再加入306kg去离子水搅拌， 离心， 得到含有纽莫康定B0的白色 固体， 收集离心固体320kg。 0062 将320kg离心固体用740kg的乙醇溶解， 搅拌1小时， 加入。

28、18kg规格为140目的活性 炭， 搅拌2小时， 脱色， 过滤得无色滤液。 0063 将无色滤液在釜内控制温度 50， 真空度 -0.07MPa下浓缩， 浓缩至纽莫康定 B0含量为265000mg/L， 得到滤液浓缩混合物重量60kg。 0064 500L硅胶柱湿法装柱， 称取120kg规格为200目的硅胶， 加入200kg氯仿搅拌均匀装 柱， 用280kg氯仿冲柱， 出口处收集360kg的氯仿时冲柱结束， 准备上样； 0065 样品溶解： 将滤液浓缩混合物中加入240kg重量的氯仿， 混合均匀， 即得上柱样品 溶液； 0066 上样吸附： 将溶解好的样品通过已装好的硅胶柱吸附； 每次上样的产。

29、品量15kg， 吸 附过程出口阀全开， 自然流速； 以氯仿： 甲醇质量比5:1进行预洗， 出口阀全开， 自然流速， 预 洗至经TLC检测无前杂； 使用氯仿： 甲醇质量比3:1进行洗脱， 出口阀全开， 自然流速， 洗脱至 经TLC检测无产品后停止； 使用HPLC方法检测收集C0 5.0%的产品， 合格的洗脱液总重 800kg。 说明书 5/8 页 7 CN 103936837 B 7 0067 将洗脱液进釜， 控制温度 50， 真空度 -0.07MPa减压浓缩至氯仿含量 0.5%， 得到干粉， 称重14kg， 即为纽莫康定B0粗品。 0068 粗品加入90kg的多相溶剂体系， 溶剂体系为由乙酸乙。

30、酯、 异丙醇、 石油醚按83： 12： 5组成的混合液， 升温至5060， 搅拌溶解， 降温至05结晶2小时； 析晶， 离心， 得固体潮 晶； 将潮晶放入真空干燥箱， 控制浓缩温度45.050.0， 真空度 -0.07MPa， 干燥20h， 即 得到成品13.6kg， 水份1.03%， 相关物质C0正相纯度0.01%， 纽莫康定B0正相纯度99.99%， 反 相纯度99.2%。 0069 实施例3 0070 11吨发酵液先转移到酸化罐， 用草酸将发酵液的pH值调至2.04.0， 板框压滤。 得 菌渣1200kg， 加入6吨75%的乙醇溶液， 搅拌6小时， 再次板框压滤， 得浸提液6.2吨。 0。

31、071 浸提液再次转移到1000L搪瓷釜中， 控制温度 50， 真空度 -0.07MPa真空浓 缩， 浓缩过程中， 观察料液变浑浊后， 取样离心， 清液送检含量， 当清液中纽莫康定B0含量 62mg/L时停止浓缩， 得浸提液浓缩混合物56kg； 浸提液浓缩混合物中加入300kg规格为100 目的硅藻土充分吸附， 裹晶， 再加入356kg去离子水搅拌， 离心， 得到含有纽莫康定B0的白色 固体， 收集离心固体380kg。 0072 将380kg离心固体用820kg的乙醇溶解， 搅拌1小时， 加入22kg规格为140目的活性 炭， 搅拌2小时， 脱色， 过滤得无色滤液。 0073 将无色滤液在釜内。

32、控制温度 50， 真空度 -0.07MPa下浓缩， 浓缩至285000mg/ L， 得到滤液浓缩混合物重量85kg。 0074 500L硅胶柱湿法装柱， 称取200kg规格为200目的硅胶， 加入340kg氯仿搅拌均匀装 柱， 用260kg氯仿冲柱， 出口处收集440kg的氯仿时冲柱结束， 准备上样； 0075 样品溶解： 将滤液浓缩混合物中加入340kg重量的氯仿， 混合均匀， 即得上柱样品 溶液； 0076 上样吸附： 将溶解好的样品通过已装好的硅胶柱吸附； 每次上样的产品量30kg， 吸 附过程出口阀全开， 自然流速； 以氯仿： 甲醇质量比5:1进行预洗， 出口阀全开， 自然流速， 预 。

33、洗至经TLC检测无前杂； 使用氯仿： 甲醇质量比3:1进行洗脱， 出口阀全开， 自然流速， 洗脱至 经TLC检测无产品后停止； 使用HPLC方法检测收集C0 5.0%的产品， 收集合格的洗脱液总重 1000kg。 0077 将洗脱液进釜， 控制温度 50， 真空度 -0.07MPa减压浓缩至氯仿含量 0.5%， 得到干粉， 称重16kg， 即为纽莫康定B0粗品。 0078 粗品加入110kg的多相溶剂体系， 溶剂体系为由乙酸乙酯、 异丙醇、 石油醚按83： 12： 5组成的混合液， 升温至5060， 搅拌溶解， 降温至05结晶2小时； 析晶， 离心， 得固体 潮晶； 将潮晶放入真空干燥箱， 控。

34、制浓缩温度45.050.0， 真空度 -0.07MPa， 干燥20h， 即得到成品15.5kg， 水份1.12%； 有关物质C0正相纯度0.02%， 纽莫康定B0正相纯度99.98%， 反相纯度99.3%。 0079 实施例4 0080 11吨发酵液先转移到酸化罐， 用草酸将发酵液的pH值调至2.04.0， 板框压滤。 得 菌渣1200kg， 加入6吨75%的乙醇溶液， 搅拌6小时， 再次板框压滤， 得浸提液6.1吨。 0081 浸提液再次转移到1000L搪瓷釜中， 控制温度 50， 真空度 -0.07MPa真空浓 说明书 6/8 页 8 CN 103936837 B 8 缩， 浓缩过程中， 。

35、观察料液变浑浊后， 取样离心， 清液送检含量， 当清液中纽莫康定B0含量 100mg/L时停止浓缩， 得浸提液浓缩混合物52kg； 浸提液浓缩混合物中加入312kg规格为150 目的硅藻土充分吸附， 裹晶， 再加入364kg去离子水搅拌， 离心， 得到含有纽莫康定B0的白色 固体， 收集离心固体375kg。 0082 将375kg离心固体用1500kg的乙醇溶解， 搅拌1小时， 加入37.5kg规格为200目的活 性炭， 搅拌2小时， 脱色， 过滤得无色滤液。 0083 将无色滤液在釜内控制温度 50， 真空度 -0.07MPa下浓缩， 浓缩至300000mg/ L， 得到滤液浓缩混合物重量8。

36、2kg。 0084 1000L硅胶柱湿法装柱， 称取246kg规格为400目的硅胶， 加入492kg氯仿搅拌均匀 装柱， 用656kg氯仿冲柱， 出口处收集850kg的氯仿时冲柱结束， 准备上样； 0085 样品溶解： 将滤液浓缩混合物中加入492kg重量的氯仿， 混合均匀， 即得上柱样品 溶液； 0086 上样吸附： 将溶解好的样品通过已装好的硅胶柱吸附； 每次上样的产品量49.2kg， 吸附过程出口阀全开， 自然流速； 以氯仿： 甲醇质量比5:1进行预洗， 出口阀全开， 自然流速， 预洗至经TLC检测无前杂； 使用氯仿： 甲醇质量比3:1进行洗脱， 出口阀全开， 自然流速， 洗脱 至经TL。

37、C检测无产品后停止； 使用HPLC方法检测收集C0 5.0%的产品， 收集合格的洗脱液总 重1020kg。 0087 将洗脱液进釜， 控制温度 50， 真空度 -0.07MPa减压浓缩至氯仿含量 0.5%， 得到干粉， 称重15kg， 即为纽莫康定B0粗品。 0088 粗品加入120kg的乙酸乙酯溶剂体系， 升温至5060， 搅拌溶解， 降温至05结 晶2小时； 析晶， 离心， 得固体潮晶； 将潮晶放入真空干燥箱， 控制浓缩温度45.050.0， 真 空度 -0.07MPa， 干燥20h， 即得到成品14.8kg， 水份1.19%； 有关物质C0正相纯度0.04%， 纽 莫康定B0正相纯度99。

38、.92%， 反相纯度99.4%。 0089 实施例5 0090 11吨发酵液先转移到酸化罐， 用草酸将发酵液的pH值调至2.04.0， 板框压滤。 得 菌渣1200kg， 加入6吨75%的乙醇溶液， 搅拌6小时， 再次板框压滤， 得浸提液5.7吨。 0091 浸提液再次转移到1000L搪瓷釜中， 控制温度 50， 真空度 -0.07MPa真空浓 缩， 浓缩过程中， 观察料液变浑浊后， 取样离心， 清液送检含量， 当清液中纽莫康定B0含量 10mg/L时停止浓缩， 得浸提液浓缩混合物35kg； 浸提液浓缩混合物中加入105kg规格为120 目的硅藻土充分吸附， 裹晶， 再加入140kg去离子水搅。

39、拌， 离心， 得到含有纽莫康定B0的白色 固体， 收集离心固体180kg。 0092 将180kg离心固体用360kg的乙醇溶解， 搅拌1小时， 加入9kg规格为180目的活性 炭， 搅拌2小时， 脱色， 过滤得无色滤液。 0093 将无色滤液在釜内控制温度 50， 真空度 -0.07MPa下浓缩， 浓缩至250000mg/ L， 得到滤液浓缩混合物重量55kg。 0094 500L硅胶柱湿法装柱， 称取110kg规格为300目的硅胶， 加入110kg氯仿搅拌均匀装 柱， 用165kg氯仿冲柱， 出口处收集300kg的氯仿时冲柱结束， 准备上样； 0095 样品溶解： 将滤液浓缩混合物中加入1。

40、65kg重量的氯仿， 混合均匀， 即得上柱样品 溶液； 说明书 7/8 页 9 CN 103936837 B 9 0096 上样吸附： 将溶解好的样品通过已装好的硅胶柱吸附； 每次上样的产品量11kg， 吸 附过程出口阀全开， 自然流速； 以氯仿： 甲醇质量比5:1进行预洗， 出口阀全开， 自然流速， 预 洗至经TLC检测无前杂； 使用氯仿： 甲醇质量比3:1进行洗脱， 出口阀全开， 自然流速， 洗脱至 经TLC检测无产品后停止； 使用HPLC方法检测收集C0 5.0%的产品， 收集合格的洗脱液总重 750kg。 0097 将洗脱液进釜， 控制温度 50， 真空度 -0.07MPa减压浓缩至氯。

41、仿含量 0.5%， 得到干粉， 称重12kg， 即为纽莫康定B0粗品。 0098 粗品加入60kg的异丙醇溶剂体系， 升温至5060， 搅拌溶解， 降温至05结晶2 小时； 析晶， 离心， 得固体潮晶； 将潮晶放入真空干燥箱， 控制浓缩温度45.050.0， 真空 度 -0.07MPa， 干燥20h， 即得到成品12.6kg， 水份1.01%； 有关物质C0正相纯度0.02%， 纽莫 康定B0正相纯度99.96%， 反相纯度99.7%。 0099 以上实例仅用于说明本发明的内容， 应当指出， 这些实施例的给出只用以对帮助 理解本发明的内容及优点， 而不作为对本发明保护范围的限定。 说明书 8/8 页 10 CN 103936837 B 10 图1 说明书附图 1/1 页 11 CN 103936837 B 11 。