技术领域
本发明属生物技术领域，具体的涉及一种高通量的数量性状调控基因分离的 方法。适用于可通过杂交获得后代的植物、动物等各类生物，尤其适用于各类作 物重要农艺性状基因的分离。
背景技术
生物的性状都是由基因控制的，性状可以被分为质量性状和数量性状。质 量性状表现为分离群体中个体的性状表现呈不连续分布，质量性状基因也称为 主效基因。因为质量性状基因控制表型显著，并且对于某个质量性状，其控制 基因较少，所以克隆方法相对简单，包括基因定位图位克隆、突变体分析和近 等基因系差异表达基因分离等，目前国内外已有许多通过这些方法克隆质量性 状调控基因成功的范例。
另一类性状在分离群体中呈连续的分布，只能用数值来衡量其性状表现， 这类性状称为数量性状。农作物的很多重要农艺性状，如产量性状、某些品质 性状、对病害的水平抗性和各类环境耐性，一般都表现为数量性状。数量性状 基因比质量性状难分离，因为数量性状往往被多个基因共同作用，难以有效地 确定控制性状表达基因的数目、基因在染色体上的位置以及基因的效应及其作 用方式。所以数量性状调控基因复杂，克隆方法也较繁琐，目前国内外鲜有成 功的例子。
经典的数量性状基因分离方法只能把控制数量性状的多个基因作为一个 整体进行研究，应用饱和的分子标记连锁图谱检测控制数量性状的染色体区 间，然后分析这段染色体的基因组序列寻找候选基因，最后进行基因的验证挑 选出该数量性状相关调控基因。具体步骤包括以下：
1)亲本的选择：要求亲本在目标性状上符合研究目的，配制的组合必须是杂 交亲和。在此基础上，所选用的亲本应该具有足够的DNA变异。
2)遗传群体的构建：F2、BC(回交)、加倍单倍体(DH)和重组自交系(RIL)
3)数量性状座位(QTLs)的定位：选择多态性好的探针，检测多态性探针 在群体中的表现，构建分子遗传图谱。通过统计分析找到与目标性状连锁的 DNA标记，从而达到定位QTL的目的。
4)基因组人工染色体(BAC)库的建立：基因组DNA的提取和纯化、DNA 片段化及末端修补、目标片段的回收及与载体的连接、连接产物的转化。
5)含QTL位点BAC库的筛选：将BAC克隆点在膜上，利用某一QTL位点 附近的标记制成探针进行杂交，选出带杂交信号的BAC克隆进行测序分析。
6)候选基因的筛选和验证：选取上述测序所获得基因为候选基因，针对基因 开展表达分析、与性状连锁性分析和转基因功能验证，进一步确定目标基因。
该种方法缺点在于：实验周期长，步骤繁琐，操作复杂，工作量大，消耗 大，并且假阳性高。其中步骤3-5需大量的劳动力及很长的实验周期，如一个 完整的BAC库的建立就需要半年的时间。该基因分离方法只能针对一个QTL 位点，分离存在相同染色体区间内的基因。对于某一数量性状而言，其QTL 位点数量多、分布广，往往存在几个不同的染色体区间，如果要分离对应全部 有效QTL位点的功能基因得花上5-10年的时间。
另外有一种常用分离数量性状基因的方法就是首先针对某一性状经多年 回交选育出一系列含不同位点基因的近等基因系，再进行每一对近等基因系功 能基因克隆。近等基因系是指除了某一两个基因外，其他基因都相同的两个遗 传材料，通常是经过饱和回交形成的除了目标性状有差异，其他遗传背景完全 相同的两个遗传材料。理论上，开展每一对近等基因系研究只能克隆到1个目 标基因或位于一个位点的1-2个基因。由于数量性状含多个功能基因，所以需 构建多对近等基因系，并且分别进行研究才能达到分离数量性状多个基因的目 的。该方法存在以下几个不足之处：1)只能克隆大效应的功能基因，针对小 效应的基因位点，因为影响性状差异不大，从而无法筛选出相应的近等基因系； 而数量性状往往有多个微效功能基因共同影响，所以该方法有一定未知性；2) 实验周期长，仅近等基因系的构建就需要5年左右的时间；3)工作量及工作 成本大，针对数量性状的每一个调控基因均需开展类似重复的研究工作，而数 量性状是多基因控制的，要分离多个基因，工作成本和工作量翻好几倍。
近年来，也存在一种e-QTL筛选功能基因的方法，该方法以基因表达作为 一种标记在相应群体中进行QTL分析，查找候选基因。其存在一个最大的缺 点就是人力物力投入巨大，针对群体中每一个个体都必须进行大规模基因表达 分析，适用面很窄，只能针对某些模式作物开展研究，这也是该技术没能广泛 推广的原因。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种高通量的数量性状调控基因分离的方法， 该方法为分子生物学和功能基因组学研究数量性状基因的分离提供了一种有 效的工具，本发明的主要特点是：方法简单，假阳性率低，时间周期短，耗资 少，高效，比一般常规方法节省人力物力五倍以上，相对常规方法一次只能克 隆一个基因，该方法一次同时可克隆基因10个功能基因以上。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：
本发明的原理是：植物基因分离一直是当今生物技术研究的热点。分离作 物重要农艺性状的功能基因利于对基因的结构和表达进行研究，经转基因技术进 行分子育种是现代农业的发展方向。近年来随着生物技术的发展，转基因技术取 得飞速进步，而基因分离技术特别是数量性状基因分离还存在很大障碍，这也成 为制约现代农业发展的重要瓶颈之一，所以开发新型高效的高通量基因分离技术 对现代生物技术和农业发展都具有重大意义。本发明的基本思想是由分离群体分 组混合分析法(BSA法)衍生而来，根据目标性状的表现型将分离群体两个极端 的样本分别进行混合，再针对混合样本展开基因表达分析。其基本原理是，依据 目标性状表型的相对差异(如抗病与感病、含油量高与低)，将目标性状表现为 两个极端的个体或株系各分成一组，然后分别将两组中的个体或株系的总RNA 混合，形成相对的RNA池。可以推测，这两个混合样本池之间除了目标性状的基 因表达存在差异之外，来自基因组其它性状调控基因的表达是基本相同的，都是 该群体中的一个随机样本。换句话说，两样本池间基因表达的差异相当于两近等 基因系基因表达之间的差异，仅在目标性状调控基因表达上存在不同，而整个遗 传背景是基本相同的，亦即这是一对近等基因池。因此，在这两个RNA池间表现 出差异表达的基因就有可能是目标基因。基于性状的混合分析方法的突出优点 是，可以大幅度减少需要检测的样品的数量，从而降低费用。它还有一个特点就 是一次能检测出10-30个效应较大的功能基因。
一种高通量的数量性状调控基因分离的方法，其步骤如下：
1)目标性状分离群体的构建：群体为两亲本杂交后代F2，F3，DH系和RIL (来源于《遗传学》2002，第三版，朱军主编，中国农业出版社出版)中的某一 群体。
2)群体中极端样本的混合和总RNA分离：将后代分离群体按性状表型划 分为三类：性状表型极端强，性状表型中等，性状表型极端弱。并将极端强或 极端弱的同一类样本分别等量混合成两个极端群体混合样本。
3)基因表达分析：利用常规基因表达分析方法(植物基因差异表达的研究 方法及进展A Review of Methods and Progress in Plant Gene Differential Expression Researches<<海南大学学报(自然科学版)>>2006年03期汤 华，帅爱华，向福英)，可以为芯片、大规模EST测序、差减和cDNA-AFLP 等方法中任一种，比较两个极端混合样本之间基因表达的异同。
4)候选基因的获得和验证：找出两个极端混样之间的差异表达基因，为目 标性状相关的候选调控基因。通过转基因、基因表达、分子标记相关性和贡献 率分析等方法验证基因的功能，最终筛选得到可调控性状表型的目标基因。如 以分离油菜高含油量调控基因为例，利用该发明方法可筛选得到调控油脂合成 相关基因，通过改变这些基因的表达量可以达到提高油菜含油量的目的。 本发明的特征：
本发明特征在于上述步骤的2)--4)。首先，步骤2)将性状表现相同的极 端材料聚类作为一个整体分析，避免每个个体独立展开分析，节省了几十倍的 劳动力和成本。同时通过聚类直接找到极端材料的共性，提高了效率，避免了 独立个体的假阳性。例如针对两个材料进行差异表达基因的分析可以得到200 个或更多的差异表达基因；但如果把群体放大，针对十个材料与另十个材料相 比，寻找共同差异表达基因，只能获得小于30个的差异基因，这样缩小了范 围提高了效率。第二，步骤3)利用基因表达作为研究手段，相对于分子标记 提高了基因筛选效率。因为与一个DNA分子标记连锁的基因最少也有几十个， 给候选基因的筛选增加了很大的难度，而基因表达直接对应一个候选基因。所 以该方法在提高基因筛选效率的同时，也进一步降低了实验成本和时间。第三， 基因功能的表现很大程度上与基因的表达量紧密连锁，该发明步骤4)选用基 因表达量作为一种标记比传统的DNA分子标记更具有准确性。第四，对比传 统的数量性状基因分离方法，该发明减少了BAC库的构建和基因组序列分析 这两个最费时、消耗大的步骤。第五，该方法一次可分离出多个与目标性状相 关的功能基因。
本发明的实用范围
本发明针对的性状为数量性状，即由多基因控制的性状，包括农作物产量、 作物品质等性状。本发明适用于各类生物数量性状基因的分离，针对的材料为 目标性状差异较大的任一群体，是一种适用范围广，简单高效的基因分离方法。
本发明涉及的表达分析方法可以是分析基因表达方法中的任一种，如 SSH，SAGE，EST，Microarray。
本发明优点在于：简单高效，经济实用，并且一次可以综合分离大量的效 应较大的数量性状调控基因。正如上述本发明的特征，该发明比起常规的基因 分离方法不仅操作简化、人力物力投入少、而且效率提高，基因分离准确性得 到保证。
本发明所涉及的实验方法如群体的构建、基因表达分析、标记多态性研究及 其相关性分析均为分子生物学和遗传学常规技术手段，为已有技术；各类试剂 均可从商业途径获得。
附图说明
图1为一种高低含油量亲本杂交F2代分离群体的含油量数据的分布示意 图。横坐标代表含油量的数值，纵坐标代表位于该这段含油量区域F2的单株 数。例如在图中显示有一个F2株系含油量大于51％，3个株系含油量位于 48％-50％之间，其他以此类推。
图2为一种混合样本H和L总RNA电泳示意图。M道为分子量标记；H 道为几个高含油量F2代胚珠混样的RNA；L道为几个低含油量F2代胚珠混样 的RNA。电泳结果显示两个样本RNA合格，可以用于后续实验。
图3为一种芯片分析散点图(三次重复)和差异表达基因筛选示意图。A、 B和C图为芯片杂交的散点图。横坐标和纵坐标分别代表两个不同的的荧光信 号通道的荧光强度值。图片上每一个点代表芯片上的一个基因。每个点的纵坐 标和横坐标值分别代表了这个基因在样品1和样品2中的荧光强度(或基因表 达的丰度)，因而每个点的斜率就对应了这个基因在样品1和2中样品1相对 于样品2差异表达的Ratio值。斜率为45度表示基因表达无差异，斜率距离 45度越接近表示差异越不显著，斜率距离45度越远表示差异越显著。45度线 上方的差异点表示在样品1中上调的基因，45度线下方的差异点表示在样品2 中下调的基因。A、B、C分别为相同样品1和2的三次重复试验，三次试验发 现有19个对应基因点都在1中上调表达或下调表达为所需挑选基因。
图4A RT-PCR分析HD1基因在12个材料分别包括5个F2代极端高含 油量个体编号为H1、H2、H3、H4、H5；5个极端低含油量个体编号为L1、 L2、L3、L4、L5；高油亲本P1即zy036和低油亲本P2即Y817的基因表达情 况琼脂糖电泳图。
图4B以低油亲本P2HD1基因的表达量设为1，以此为对照将图4A中个 体基因表达量数字化示意图。横坐标表示具体个体，纵坐标表示每个体的表达 量相对值。软件分析显示HD1表达量与含油量相关性达极显著水平(P<0.001)
图5标记HDsnp在F2代分离群体中的分布及连锁程度分析示意图，同图 4，P1P2分别代表两高低含油量亲本，H1-10为10个F2代极端高含油量个体， L1-10为10个F2代极端低含油量个体。从图上可以看出标记在两亲本中存在 多态性，10个极端高含油量F2代个体均表现出与高含油量亲本一致的多态性； 10个极端低含油量F2代个体有7个表现出与低含油量亲本一致的多态性；利 用软件进行标记多态性与含油量相关性分析证明该标记与含油量达极显著相 关(p<0.001)。
图6at2g20560基因的植物表达载体构建示意图 将at2g20560基因编码区序列与PCR8/GW/TOPO质粒连接后筛选正向载体，获得 PCR8/GW/TOPO-at2g20560，然后PCR8/GW/TOPO-at2g20560质粒与表达载体 Pearleygate100进行重组，并筛选阳性克隆获得Pearleygate100-at2g20560。
具体实施方式
本发明突出的实质性特点可从下述实施例得以体现，但它们并不对本发明作 任何限制。本实施例选择的目标性状为含油量；以分离油菜高含油量调控基因为 研究对象。性状分离群体为两高低含油量甘蓝型油菜(含油量分别为51％和35％) 杂交的F2代。针对极端混合F2群体基因表达比较筛选出19个与含油量相关基 因，其中一个基因HD1基因表达和分子标记均证明其参与含油量调控，并可调 控约3个百分点的含油量，为所需克隆的目标基因。该实施例证明了本发明方法 (一种数量性状调控基因的高通量分离技术)具有可行性和高效性。
实施例1：
一种高通量的油菜含油量调控基因分离的方法，其步骤如下：
1)油菜含油量分离群体的构建：油菜含油量性状为一典型的数量性状， 实施例中使用的群体为高低含油量亲本(含油量分别为51％的zy036和35％的 Y817)杂交后代--F2代。
2)群体中极端样本的混合和总RNA分离：将F2后代分离群体按含油量 高低性状表型划分为三类：含油量极端高即含油量大于47％的个体(47-51％)， 含油量中等即含油量位于39-47％之间的个体，含油量极端低即含油量小于39％ (35-39％)的个体。并将含油量极端高或极端低的同一类个体分别等量混合成 两个极端群体混合样本。
3)基因表达分析：利用常规差异基因表达分析方法芯片杂交比较两个极 端混合样本之间基因表达的异同。
4)候选基因的获得和验证：找出两个极端混样之间的差异表达基因，为 目标性状相关的候选调控基因如：与拟南芥At2g20560、At1g67090、At1g79040、 At5g59720等同源的一类基因。基因表达、分子标记相关性和贡献率分析方法 验证了一个目标基因可调控3个百分点的含油量。
本实施例中油菜品系zy036和Y817均来源于中国农科院油料所生物技术 育种课题，zy036是由中双4号、中双7号、中双9号、华双3号、油研9号 构建轮回选择群体，轮回选择两代后选优良单株进行小孢子培养轮回选择第三 代，最终经高油定向选择得到，产权归属于本发明第一发明人，Y817是杂交品 种中油杂1号的保持系。群体的构建、标记分析和基因表达半定量方法是本领 域中所常采用的方法。提取RNA的方法也有多种成熟的技术，试剂盒(QIAGEN 公司购买)可从商业途径获得，而芯片杂交由上海芯片有限公司商业化完成， 所用芯片为Agilent拟南芥芯片；使用的生物信息学软件均是网站公开供免费 使用的。方法中所涉及的质粒和各类试剂均可从商业途径获得。
实施例2：
一种高通量的油菜含油量调控基因分离的方法，其步骤如下：(含油量性状分离 遗传群体的构建和极端材料混合样品的组成)
1)以高低含油量品系zy036与y817(含油量分别为51％和35％)杂交构建F2代群体共得到169个后代单株；
2)分别收集各F2单株开花后25天左右的角果(带角果皮和胚珠)；
3)各单株进行含油量检测，分布图如图例1。F2代种子含油量变幅35.1-51.5％， 其中含油量大于47％的有11株，含油量小于38.5％的有11株；
4)将含油量检测大于47％和小于38.5％的单株的角果分别取等量200mg混合 组成两极端含油量混合样本分别编号H和L。两个混样平均含油量相差11.1％。
结果：含油量数据结果(图例1)可以说明所构建的F2代群体含油量表现分 布呈连续性分布，变异分布呈正态分布，且变异范围很宽，证明含油量属于数 量性状。高含油量混样H含有11个单株的角果；低含油量混样L含有11个单 株的角果。
实施例3：
一种高通量的油菜含油量调控基因分离的方法，其步骤如下：(利用Microarray 技术分析两极端混样H和L基因表达)
1)首先用常规Trizol试剂盒(从promega公司购买)分离H和L各自的总 RNA如图例2；
2)利用逆转录的方法首先合成cDNA第一链和第二链，双链cDNA在转录 酶作用下转录成cRNA；
3)用荧光cy5和cy3分别标记H和L样的cRNA，经RNeasy柱子(从Qiagen 公司购买)纯化，分光光度计定量检测合格后制成探针；
4)选用拟南芥50mer长度的全基因组oligo芯片将上述两探针进行杂交；
5)60℃滚动杂交16小时后，芯片洗涤三次，最后芯片扫描和生物信息分析 结果如图例3。
结果：样本H和L总RNA电泳图如图2；芯片分析散点图如图3。
实施例4：
在芯片分析的基础上筛选出两个样品H和L差异表达基因
芯片杂交共进行三次重复，结果采用Agilent扫描仪进行扫描，Feature Extraction软件(来源于Agilent公司官方公开网站见附录网 站，.http://www.chem.agilent.com/en-US/products/instruments/dnamicroarrays/featu reextractionsoftware/Pages/default.aspx)读取数据Scan resolution 5μm，PMT100％， 10％最后采用Feature Extration(同上)进行Normalize处理分析。 Ratio(Cy3/Cy5)>＝2或<＝0.5，Flag为0，SN>2.6，pValueLogRatio<0.05。选出三 次试验中共同差异表达基因(表达量相差2倍以上)。
结果：共找到18个基因在高含油量样本H中高表达，1个在低含油量样本 L中高表达。
实施例5：候选基因HD1的表达验证
选择RT-PCR的方法验证上述差异表达基因，材料为两高低油亲本P1、P2和 F2代中极端高含油量个体H1-5及极端低含油量个体L1-5。其中一个热激蛋白基 因HD1表达分析结果如图例4，结果证明该基因在高低含油量个体中均存在显 著差异表达，在6个高含油量个体(高油亲本P1和5个高油F2代H1-5)中HD1 基因的表达量明显高于6个低含油量个体(低油亲本P2和5个低油F2代L1-5)。
结果：基因表达与含油量存在紧密连锁性，相关性达极显著水平(P<0.001)。
实施例6：HD1基因位点对含油量贡献率分析
利用拟南芥HD1基因序列BLAST到油菜EST序列并拼接出油菜HD1基因全 长。设计基因编码序列的两侧引物(正向引物：[5’ ATGGGAGTGGATTACTACAAC3’]；反向引物：[5’CCGACCAAACAGGA TACAAC3’])，分别在zy036与Y817中扩增HD1基因的全长序列。序列比对发 现两亲本之间该基因存在两个位点共四个碱基的缺失，根据缺失位点设计可有效 区分两亲本的功能基因标记HDsnp，引物序列分别为snpL： GGTTCCAAAGGAAGGAATGCC和snpR：CCGACCAAACAGGATACAAC。如 图例5，在F2群体中进行标记HDsnp和含油量性状的关联性分析，结果表明该 标记与含油量性状极显著相关(P<0.001)。利用生物信息学软件winQTLcart2.5 (2..Wang S C，Bastern J，Zeng Z B.2006 Windows QTL Cartographer 2.5. Department of Statistics，North Carolina State University，Raleigh，NC. (http://statgen.ncsu.edu/qtlcart/WQTLCart.htm))计算该基因位点对应一个含油量 QTL，该QTL的LOD值为6.34；对含油量的贡献率R2为18.58％，即贡献率相 当于3个百分点的含油量，计算如下：18.58％X(51％-35％)亲本含油量之差 ＝2.97％。
从以上结果可以得到结论：HD1基因可调控含油量约3个百分点，为所需克 隆的目标基因，同时也证明本发明方法的准确性。
实施例7：at2g20560油菜cDNA同源序列编码区的克隆
在NCBI数据库中检索已发表的拟南芥at2g20560基因序列，BLAST到油菜 EST序列并拼接出油菜at2g20560编码区全长。设计基因编码序列的两侧引物 (正向引物：[5’-ATGGGAGTGGATTACTACAAC-3’]；反向引物：[5’- GTTATCCGAGAAGCTTCTTTAC-3’])，用来从油菜中扩增at2g20560的对应序列。
1、提取油菜mRNA。
RNA的提取(TRIZOL TM Kit提取RNA)
液氮研磨100mg材料
A.加1mlTRIZOL，室温(20-25℃，下同)放置5min。
B.加入200ul氯仿，剧烈振荡30s，室温放置2min。
C.12000g，15min，4℃，取上清至新管中，加入500ul异丙醇，混匀后室温 放置15min。
D.12000g，15min，4℃，去上清，加入1ml70％乙醇。
E.7500g，7min，4℃，去上清，空气干燥。
F.DEPC—H2O溶解。
2、cDNA第一链的反转录采用RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)，操作参照所用试剂盒说明进行。
3、以cDNA为模板进行PCR扩增，得到了油菜基因序列如SEQ ID NO：1所 示。
实施例8：基因表达载体的构建及拟南芥的转化
将PCR扩增得到的基因序列与TOPO入门载体(invitrogen公司)连接后，转化 到感受态细胞DH5α(invitrogen公司)中，壮观酶素筛选，载体引物(T7引 物)与基因引物(基因上游引物)扩增鉴定正向插入克隆，质粒经小量制备后与 Pearleygate100(invitrogen公司)进行重组，并转化到感受态细胞DH5α中， 卡那霉素筛选，其插入片段经载体引物(35S启动字序列引物)与基因引物(基 因下游引物)PCR鉴定，示意图见图6。
拟南芥的转化过程：
试剂配制
渗透培养基(1L)：1/2xMurashige-Skoog；5％蔗糖；0.5克MES；用KOH调至 pH5.7；再加：10微升1mg/ml的6-BA母液；200微升Silwet L-77
转化步骤
(1)制备好已转化了相应质粒的农杆菌菌液10ml，在转化前一天晚上，转 入大瓶培养过夜，第二天取出使用时农杆菌液O.D600当在1.2到1.6之间。
(2)室温5000rpm离心15分钟。
(3)弃上清，将农杆菌沉淀悬浮于相应体积的渗透培养基里，使O.D600在 0.8左右。
(4)将整个植株直接浸泡至农杆菌悬浮液30s。
(5)避光培养过夜，然后正常培养至结子。
实施例9：转基因拟南芥的筛选和验证
转化子的筛选
将春化过的拟南芥种子种于浇过饱和PNS营养液的人工土中，并用保鲜膜罩 上。两天后光照，三天后揭膜。
人工培养室条件：相对湿度80％，恒温20-240C，光照强度80-200umol/M2/S， 光照周期为8h黑暗、16h光照培养。一周左右，喷除草剂筛选阳性植株。
PCR鉴定
(1)用于PCR的转化植株总DNA的提取
A.70％乙醇擦洗叶片，称取大约100mg
B.加入600ul抽提缓冲液(0.2M Tris—Cl，0.25NaCl，25mM EDTA，0.5％SDS， pH7.5)，室温快速研磨。
C.1.5ml Ependorff管中涡旋混匀5-10s。
D.12000rpm，25min，室温。取上清，加等体积异丙醇，—20摄氏度沉淀过 夜。
E.12000rpm，15min，室温。加入70％乙醇200ul泡洗DNA沉淀。
F.12000rpm，15min，室温。去乙醇。倒置于纸巾上，待乙醇挥发干净。
G.加无菌水100ul溶解粗提DNA沉淀。用分光光度计测定或电泳估测其浓度。 H.以总DNA为模板，进行PCR。
(2)PCR程序
PCR反应混合液的配比同质粒PCR鉴定，依据植物表达载体中目的基因及其上 游35S启动子序列和基因下游引物[5’-TCAGCCAGAGATCTGGATAG-3’]，反应的 时间和温度作如下：
94℃ 3min
94℃ 45s，
59℃ 45s
72℃ 2min 30s，30cycles
72℃ 5min
检测结果显示，大多数转化植株均能够扩增出预期大小的电泳条带，而阴性对照 则没有，表明转基因拟南芥基因组中已经含有外源基因DNA片段。
实施例10：转基因拟南芥含油量的测定
转基因纯合株系生长于23℃/21℃培养箱中，收获种子后测其产量和含油量 的变化。气相色谱测定含油量步骤：称取100mg种子，磨碎，加2mL石油醚； 40℃，1.5小时超声，得提取液；加1mL0.4M KOH-甲醇，微波(2min)或超声 酯化(60度，20min)；加入0.05mL(5mg/mL)内标(十七碳饱和脂肪酸甲酯)； 加2mL饱和NaCl溶液剧烈震荡；离心10min(4500rpm/min)，取上清液到气相 色谱瓶，GC分析。
计算方法：被测物峰面积/内标峰面积＝被测物质量(求得)/0.05mL×5mg/mL 含油量：被测物质量数/种子质量×100％
结果显示，转基因拟南芥种子含油量与野生型拟南芥相比有至少10％以上的 提高(表1)，最高的可达30％左右。
表1
SEQUENCE LISTING
<110>中国农业科学院油料作物研究所
<120>一种高通量的数量性状调控基因分离的方法
<130>一种高通量的数量性状调控基因分离的方法
<160>1
<210>1
<211>1008
<212>DNA
<213>油菜
<400>1