齐墩果烷型三帖类化合物及其制备方法和医疗用途.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102286057 A (43)申请公布日 2011.12.21 CN 102286057 A *CN102286057A* (21)申请号 201110190153.3 (22)申请日 2011.07.07 C07J 63/00(2006.01) A61K 31/56(2006.01) A61P 3/10(2006.01) A61P 3/04(2006.01) A61P 5/50(2006.01) (71)申请人 北华大学 地址 132013 吉林省吉林市华山路 3999 号 (72)发明人 崔龙 李志 李宣善 (74)专利代理机构 吉林长春新纪元专利代理有 限责任。

2、公司 22100 代理人 陈宏伟 (54) 发明名称 齐墩果烷型三帖类化合物及其制备方法和医 疗用途 (57) 摘要 本发明公开一种齐墩果烷型三帖类化合物， 同时还提供了其制备方法以及在医疗用途， 是一 类从虎耳草科植物丹顶草中提取、 分离获得的具 有抑制蛋白酪氨酸磷酸酯酶 1B 活性的齐墩果烷 型 （oleanane-type） 三帖类化合物， 结构上 ： R1为 羟基、 乙酰氧基， R2为羧基、 羟亚甲基， R3 为甲基、 羧基， R4 为羧基、 甲基。经多次体外蛋白酪氨酸磷 酸酯酶 1B 抑制实验表明， 该类化合物具有明显的 PTP1B 抑制活性， 可在制备糖尿病、 肥胖症及并发 症药物。

3、应用。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 3 页 说明书 7 页 附图 5 页 CN 102286067 A1/3 页 2 1. 一种齐墩果烷型三帖类化合物， 具有如下的化学结构通式 ： 其中， R1为羟基或乙酰氧基 ； R2为羧基或羟亚甲基 ； R3 为甲基或羧基 ； R4 为羧基或甲 基。 2. 一种化合物 1， 具有以下的化学结构式 ： 理化性质如下 ： 无色， 溶点为252 ， 负离子模式点喷雾离子质谱m/z 486.33 M-H-； 分子式为 C30H46O5； 其 1H 和13C-NMR（Pyridine-d5） 图谱如。

4、图 1、 图 2。 3. 一种化合物 2， 具有以下的化学结构式 ： 理化性质如下 ： 无色， 溶点为307 ， 负离子模式点喷雾离子质谱m/z 486.33 M-H-； 分子式为 C30H46O5； 其 1H 和13C-NMR（Pyridine-d5） 图谱如图 3、 图 4。 4. 一种化合物 3， 具有以下的化学结构式 ： 权 利 要 求 书 CN 102286057 A CN 102286067 A2/3 页 3 理化性质如下 ： 白色， 溶点为312 ， 负离子模式点喷雾离子质谱m/z 472.35 M-H-； 分子式为 C30H48O4； 其 1H 和13C-NMR（Pyridin。

5、e-d5） 图谱如图 5、 图 6。 5. 一种化合物 4， 具有以下的化学结构式 ： 理化性质如下 ： 无色， 溶点为261 ， 负离子模式点喷雾离子质谱m/z 528.34 M-H-； 分子式为 C32H48O6； 其 1H 和13C-NMR（Pyridine-d5） 图谱如图 7、 图 8。 6. 根据权利要求 1 所述齐墩果烷型三帖类化合物的提取方法， 包括以下步骤 ： 将干燥粉碎的丹顶草 （Aceriphyllum rossii Engler） 根部 1.5-2.5 Kg 用 10L 甲醇 室温浸泡 3 天提取一次， 总共提取三次。合并甲醇提取液， 减压浓缩得浸膏 ； 将浸膏溶于 1。

6、.0-0.6L 水中， 成混悬液后用 3.0-2.0L 正己烷萃取， 正己烷萃取液减压浓缩得正己烷浸 膏 ； 将正己烷浸膏经过 200-300 目硅胶柱层析， 用以正己烷 / 乙酸乙酯 (V/V， 10:1-0:1) 为 流动相进行梯度洗脱， 收集的分离组分利用硅胶薄层层析检测， 成份相同的分离组分合并、 浓缩后得到 F1 至 F10 十个分离组分。 7. 根据权利要求 2 所述化合物 1 的制备方法， 其特征在于 ： 将权利要求 6 制备的 F10（1263.4 mg， 12-15% 乙酸乙酯） 部分， 经 200-300 目硅胶柱层 析， 用以氯仿 / 丙酮 (V/V， 10:1-1:1)。

7、 为流动相进行梯度洗脱， 收集的分离组分利用硅胶薄 层层析检测， 成份相同的分离组分合并、 浓缩后得到H1至H7七个分离组分 ； 浓缩的H1组分 （191.2mg， 氯仿 / 丙酮， 10:1-10:2） 得化合物 1。 8. 根据权利要求 3 所述化合物 2 的制备方法， 其特征在于 ： 将权利要求 7 制备的 H7(466.9 mg， 氯仿 / 丙酮， 4:5-5:5) 部分， 经 200-300 目硅胶柱 层析， 用以正己烷 / 乙酸乙酯 (V/V， 15:1-5:1) 为流动相进行梯度洗脱， 收集的分离组分利 用硅胶薄层层析检测， 成份相同的分离组分合并、 浓缩后得到 G1 至 G6 。

8、六个分离组分 ； 收集 的 G5 分离组分 (188.9 mg， 正己烷 / 乙酸乙酯， 6:1)， 经反相高效液相色谱法， 使用 C18柱 权 利 要 求 书 CN 102286057 A CN 102286067 A3/3 页 4 (10m， 25010 mm)， 以乙腈 :H2O=50:1-100:1（V/V） 作为流动相梯度洗脱， 流速为 2mL/ min， 柱温 25， 210nm 波长下检测 70min ； 收集 22.3-26.9 min 洗脱液， 浓缩收集液得化合 物 2。 9. 根据权利要求 4 所述化合物 3 的制备方法， 其特征在于 ： 将权利要求 7 制备的 H5(26。

9、8.9 mg， 氯仿 / 丙酮， 1:1) 部分， 经反相高效液相色谱法， 使 用 C18柱 (10m， 25010 mm)， 以甲醇 : H2O =10:1-100:0（V/V） 作为流动相梯度洗脱， 流 速为 2mL/min， 柱温 25， 210nm 波长下检测 70min。收集 18.3-21.9 min 洗脱液， 浓缩收集 液得化合物 3。 10. 根据权利要求 5 所述化合物 4 的制备方法， 其特征在于 ： 将权利要求 8 制备的 G4(151.9 mg， 氯仿 / 丙酮， 1:1) 部分， 经反相高效液相色谱法， 使 用 C18柱 (10m， 25010 mm)， 以乙腈 : 。

10、H2O =50:1-100:1（V/V） 作为流动相梯度洗脱， 流 速为 2mL/min， 柱温 25， 210nm 波长下检测 70min。收集 25.3-27.9 min 洗脱液， 浓缩收集 液得化合物 4。 11.根据权利要求1至5所述的化合物在制备治疗各种糖尿病、 肥胖症及其并发症药物 中应用。 12. 根据权利要求 1 至 5 所述的化合物在制备胰岛素增敏剂中的用途。 权 利 要 求 书 CN 102286057 A CN 102286067 A1/7 页 5 齐墩果烷型三帖类化合物及其制备方法和医疗用途 技术领域 0001 本发明公开一种齐墩果烷型三帖类化合物， 同时还提供了其制备。

11、方法以及在医疗 用途， 涉及医药技术领域。 背景技术 0002 目前临床上常将糖尿病分为胰岛素依赖型 （IDDM， 型糖尿病） 和非胰岛素依赖型 （NIDDM， 型糖尿病） 两类， 其中型糖尿病在糖尿病中占 90%。WHO 预计， 由于人口老龄化、 肥胖、 不健康的饮食以及缺乏运动的生活方式， 到 2025 年， 糖尿病患者的数目将由 1995 年 的 1.35 亿上升为 3 亿。 0003 型糖尿病的特征是胰岛素敏感组织如骨骼肌、 肝、 脂肪组织对胰岛素作用的抵 抗。虽然其具体机制尚不清楚， 但胰岛素信号在其传导通路中的减弱甚至阻断必定是直接 关系。 PTPases在胰岛素信号通路中多个环节。

12、起作用， 如将自身磷酸活化的IR去磷酸化， 从 而降低受体激酶活性 ； 或将 IRS-1、 IRS-2、 Shc 等胰岛素受体的底物中蛋白酪氨酸残基至去 磷酸化， 从而负调控胰岛素作用受体后通路。特定 PTPases 和胰岛素通路中的酪氨酸激酶 间的酶活性不平衡可能是引起型糖尿病胰岛素抵抗的原因。因此， 通过寻找选择性作用 于该通路中 PTPases 的抑制剂抑制其活性， 加强和延长胰岛素信号， 成为越来越受重视的 治疗型糖尿病的新途径。 0004 PTP1B 选择性抑制剂的研究取得了一定的进展， 但大多研究局限于肽类和类 肽化合物， 例比如根据 PTP1B 去磷酸化的底物序列设计的抑制剂 E。

13、EDE（F2PMP） M 、 Glu-F2PMP-F2PMP， 虽然这些肽类化合物具有较强高的选择性和较强的抑制活性， 但它们的 不易穿透细胞膜和其肽类磷酸结构使很难成为药物候选化合物。最近， 在非肽类 PTP1B 抑 制剂的报道中 2- 羧甲氧基苯甲酸类化合物对 PTP1B 有很强的抑制作用， 更重要的事， 其中 (2S)-2-4?-(2- 苄基 - 苯并呋喃 )-3- 联苯 -4- 氧 -3- 苯基 - 丙酸化合物不仅对 PTP1B 有很强的选择抑制性， 还对降低 ob/ob 小鼠血浆中的葡萄糖和胰岛素水平有显著作用。这 是第一例从药理学上直接证明PTP1B抑制剂具有抗糖尿病活性的证据Ma。

14、lamas, M. S. et al. J. Med. Chem. 2000, 43, 1293-1310。这为我们从天然资源里寻找高效、 高选择性 的小分子非肽类 PTP1B 抑制剂提供了机遇。 0005 丹顶草 （Aceriphyllum rossii Engler） 为虎耳草科多年生植物， 生于山谷岩石上 或山坡石粒子上， 主要分布在我国东北三省， 其新鲜的嫩叶和茎可食用。 0006 本发明是首次从虎耳草科植物丹顶草中分离得到齐墩果烷型 （oleanane-type） 三 帖类化合物， 经多次药理实验研究表明， 该类化合物具有抑制蛋白酪氨酸磷酸酯酶 1B 的显 著活性， 经文献检索， 未。

15、见该类化合物具有此方面的报道。 发明内容 0007 本发明提供一种齐墩果烷型三帖类化合物， 为一种新化合物， 具有抑制蛋白酪氨 酸磷酸酯酶 1B 的活性。 说 明 书 CN 102286057 A CN 102286067 A2/7 页 6 0008 本发明还进一步提供上述化合物的制备方法， 从植物丹顶草中提取分离提取。 0009 本发明的另一个目的是提供了该化合物的医疗用途， 作为抑制蛋白酪氨酸磷酸酯 酶 1B（PTP1B） 的抑制剂和胰岛素增敏剂， 可用于治疗各种糖尿病、 肥胖症及其它由此引发 的并发症。 0010 本发明的齐墩果烷型 （oleanane-type） 三帖类化合物， 具有如。

16、下化学结构 ： 其中 R1为羟基或乙酰氧基 ； R2为羧基或羟亚甲基 ； R3 为甲基或羧基 ； R4 为羧基或甲 基。如 CH3、 OH、 COOH、 CH3COO 等。 0011 化合物 1 ： R1=-OH， R2=COOH， R3=CH3， R4=COOH 化合物 2 ： R1=-OH， R2=COOH， R3=CH3， R4=COOH 化合物 3 ： R1=-OH， R2=CH2OH， R3=CH3， R4=COOH 化合物 4 ： R1=-OCOCH3， R2=COOH， R3=COOH， R4=CH3 其中 ： 化合物 1（命名为 3-hydroxyolean-12-en-23,。

17、29-dioic acid） 的立体构型如下 ： 理化性质如下 ： 无色， 溶点为252 ， 负离子模式点喷雾离子质谱m/z 486.33 M-H-； 分子式为 C30H46O5； 其 1H 和13C-NMR（Pyridine-d5） 图谱如图 1、 图 2。 0012 化合物 2 ( 命名为 3-hydroxyolean-12-en-23,29-dioic acid） 的立体构型如 下 ： 说 明 书 CN 102286057 A CN 102286067 A3/7 页 7 理化性质如下 ： 无色， 溶点为307 ， 负离子模式点喷雾离子质谱m/z 486.33 M-H-； 分子式为 C30。

18、H46O5； 其 1H 和13C-NMR（Pyridine-d5） 图谱如图 3、 图 4。 0013 化合物 3（命名为 3,23-dihydroxyolean-12-en-29-oic acid） 的立体构型如 下 ： 理化性质如下 ： 白色， 溶点为312 ， 负离子模式点喷雾离子质谱m/z 472.35 M-H-； 分子式为 C30H48O4； 其 1H 和13C-NMR（Pyridine-d5） 图谱如图 5、 图 6。 0014 化合物 4（命名为 3-O-acetylolean-12-en-23,27-dioic acid） 的立体构型如 下 ： 理化性质如下 ： 无色， 溶点为。

19、261 ， 负离子模式点喷雾离子质谱m/z 528.34 M-H-； 分子式为 C32H48O6； 其 1H 和13C-NMR（Pyridine-d5） 图谱如图 7、 图 8。 0015 本发明齐墩果烷型三帖类化合物的提取方法， 包括以下步骤 ： 将干燥粉碎的丹顶草 （Aceriphyllum rossii Engler） 根部 1.5-2.5 Kg 用 10L 甲醇 室温浸泡 3 天提取一次， 总共提取三次。合并甲醇提取液， 减压浓缩得浸膏 （178g） 。将浸 膏溶于 1.0-0.6L 水中， 成混悬液后用 3.0-2.0L 正己烷萃取， 正己烷萃取液减压浓缩得正 说 明 书 CN 10。

20、2286057 A CN 102286067 A4/7 页 8 己烷浸膏 （89g） ； 将正己烷浸膏经过 200-300 目硅胶柱层析， 用以正己烷 / 乙酸乙酯 (V/V, 10:1-0:1) 为流动相进行梯度洗脱， 收集的分离组分利用硅胶薄层层析检测， 成份相同的分 离组分合并、 浓缩后得到 F1 至 F10 十个分离组分。 0016 将上述制备的 F10（1263.4 mg, 12-15% 乙酸乙酯） 部分， 经 200-300 目硅胶柱层 析， 用以氯芳？氯仿/丙酮(V/V, 10:1-1:1)为流动相进行梯度洗脱， 收集的分离组分利用 硅胶薄层层析检测， 成份相同的分离组分合并、 。

21、浓缩后得到 H1 至 H7 七个分离组分。浓缩的 H1 组分 （191.2mg, 氯芳 / 丙酮 ,10:1-10:2） 经 400MHz 核磁共振检测氢谱， 判定为单体化 合物， 既化合物 1 (191.2 mg)。 0017 将上述制备的 H7(466.9 mg, 氯芳 / 丙酮 ,4:5-5:5) 部分， 经 200-300 目硅胶柱 层析， 用以正己烷/乙酸乙酯(V/V, 15:1-5:1)为流动相进行梯度洗脱， 收集的分离组分利 用硅胶薄层层析检测， 成份相同的分离组分合并、 浓缩后得到 G1 至 G6 六个分离组分。收集 的 G5 分离组分 (188.9 mg, 正己烷 / 乙酸乙。

22、酯 ,6:1)， 经反相高效液相色谱法， 使用 C18柱 (10m, 25010 mm)， 以乙腈 :H2O=50:1-100:1（V/V） 作为流动相梯度洗脱， 流速为 2mL/ min， 柱温 25， 210nm 波长下检测 70min。收集 22.3-26.9 min 洗脱液， 浓缩收集液得化合 物 2 (35.8 mg)。 0018 将上述制备的 H5(268.9 mg, 氯芳 / 丙酮 ,1:1) 部分， 经反相高效液相色谱法， 使 用 C18柱 (10m, 25010 mm)， 以甲醇 : H2O =10:1-100:0（V/V） 作为流动相梯度洗脱， 流 速为 2mL/min， 。

23、柱温 25， 210nm 波长下检测 70min。收集 18.3-21.9 min 洗脱液， 浓缩收集 液得化合物 3 (77.9 mg)。 0019 将上述制备的 G4(151.9 mg, 氯芳 / 丙酮 ,1:1) 部分， 经反相高效液相色谱法， 使 用 C18柱 (10m, 25010 mm)， 以乙腈 : H2O =50:1-100:1（V/V） 作为流动相梯度洗脱， 流 速为 2mL/min， 柱温 25， 210nm 波长下检测 70min。收集 25.3-27.9 min 洗脱液， 浓缩收集 液得化合物 4 (57.9 mg)。 0020 本发明对所得齐墩果烷型三帖类化合物进行了。

24、蛋白酪氨酸磷酸酯酶 1B 抑制活性 试验， 表明其具有明显的抑制活性。 0021 测试原理 ： 利用分子生物学手段在大肠杆菌系统表达人源蛋白质酪氨酸磷酸酯酶 1B（hPTP1B） 催化结构域， 经纯化后的 hPTP1B 重组蛋白能水解底物pNPP 的磷脂键， 得到的 产物在 410 nm 处有很强的光吸收， 因此可以通过直接检测 410 nm 处光吸收的变化以观察 酶的活性变化以及化合物对酶活性的抑制情况。标准的测活体系如下 ： 10 mM 、 Tris. CI， PH 7.6， 10 mM pNPP， 2% DMSO， 100 nM hPTP1B。 0022 观察指标 ： 动态测定波长为 4。

25、10nm 处的光吸收， 时间为 3 分钟， 其动力学曲线一级 反应的斜率作为酶活性指标。 0023 试验例 1 齐墩果烷型三帖类化合物的 PTP1B 抑制活性试验 实验方法 ： 用于筛选的蛋白酪氨酸磷酸酯酶 PTP1B 是从大肠杆菌中表达并纯化的 GST 融合蛋白。采用紫外底物 pNPP， 观察不同浓度对重组酶的活性抑制， 以初步评价化合物的 药用效果。PTP1B 水解底物pNPP 的磷脂得到的产物在 410nm 处有很强的光吸收。因此可以 直接检测 410nm 处光吸收的变化以观察酶的活性变化以及化合物对其的抑制情况。阳性对 照正钒酸钠的 IC50为 2.0 uM。实验结果如下 ： 说 明 。

26、书 CN 102286057 A CN 102286067 A5/7 页 9 贝壳杉烷型二帖类化合物 IC50(uM) 化合物 1 6.6 化合物 2 7.4 化合物 3 11.1 化合物 4 6.8 实验结果显示， 当化合物 1-4 的浓度分别为 6.6， 7.4， 21.3 和 6.8 uM 时， 对 PTP1B 有 50% 抑制作用 （IC50） ， 其中化合物 1， 2 和 4 的抑制 PTP1B 活性强于化合物 3。 0024 试验例 2 ： 齐墩果烷型三帖类化合物 (1-4) 分别对 STZ 致高血糖大鼠降血糖实验 以昆明大鼠 46 只 （雄性） ， 随机分组成空白组、 模型组 （。

27、Diabetic control） 、 实验组 （分 别用化合物 1， 2， 3， 4） 、 消渴丸对照组 （XKW） 。除空白组外， 各组禁食不禁水 1 d， 以 STZ（在 4 冰浴中用 0.05 mol/ml 柠檬酸 pH4.5 溶液配制， 立即使用） 腹腔注射 60 mg/kg， 造糖尿 病模型。注射后 72 h 断尾取血测定血糖 （测前禁食 6 h） ， 血糖值高于 11.1 mmol/L 用于实 验。 0025 实验组分别以化合物1、 2、 3和4 灌胃 （200 mg/kg） ； XKW组以消渴丸灌胃 （250 mg/ kg） ； 空白组、 模型组灌胃等体积生理盐水。给药 12 。

28、d， 每天称重、 给药一次。末次给药后， 断尾取血测定血糖 （测前禁食 6 h） 。实验结果如下 ： 实验开始前血糖值 （mmol/L） 试验结束后血糖值 （mmol/L） 空白组 7.2 8.0 模型组 25.0 23.7 化合物 1 组 22.7 13.6 化合物 2 组 27.6 15.9 化合物 3 组 26.1 21.9 化合物 4 组 26.8 10.9 消渴丸对照组 24.7 14.8 实验结果显示， 化合物1、 2和3组与模型组比较， 对链脲佐菌素致高血糖大鼠有显著的 降糖效果， 其中化合物 4 组的降糖效果优于消渴丸对照组。 0026 试验例 3 ： 齐墩果烷型三帖类化合物 。

29、(1-4) 分别对 STZ 致高血糖大鼠胰岛素敏感性的影响 实验组分别以化合物 1、 2， 3 和 4 灌胃 （200 mg/kg） ； 模型组灌胃等体积生理盐水。给 药 12 d， 每天称重、 给药一次。以上各组在给药 12 d 内， 每天腹腔注射长效人胰岛素 1 IU/ kg。12 d 后， 各组大鼠四天内每天分别腹腔注射速效人胰岛素 0.05、 0.5、 1.0、 2.5 IU/kg， 测定给速效人胰岛素前后的血糖， 计算比值。实验结果如下 ： 图 9。 0027 实验结果显示， 化合物 1-4 对链脲佐菌素致高血糖大鼠胰岛素敏感性均有改善， 其中化合物 1， 2 和 4 的作用强于化合。

30、物 3。 0028 试验例 4 ： 齐墩果烷型三帖类化合物 (1-4) 分别对 STZ 致高血糖大鼠体重变化实验 实验组分别以化合物 1、 2， 3 和 4 灌胃 （200 mg/kg） ； 对照组以消渴丸灌胃 （250 mg/kg） ； 模型组灌胃等体积生理盐水。给药 12 d， 每天称重、 给药一次。 实验结果如下 ： 实验开始前体重 （g） 试验结束后体重 （g） 空白组 147 213 化合物 1 组 151 156 化合物 2 组 148 160 说 明 书 CN 102286057 A CN 102286067 A6/7 页 10 化合物 3 组 143 175 化合物 4 组 1。

31、46 145 消渴丸组 153 186 实验结果显示， 化合物 1-4 组与空白组和消渴丸组比较， 均有显著的降低体重效果， 其 中化合物 4 组的降低体重效果最为显著。 0029 实验结果的评价与解释 ： 胰岛素敏感性降低和胰岛细胞功能受损是2型糖尿病 发病机制的主要因数， 而 PTP1B 的高度表达可引起机体对胰岛素敏感性降低和瘦数抵抗， 从而引起 2 型糖尿病和肥胖症。通过我们试验数据显示化合物 （1-4） 有显著抑制 PTP1B 活 性 （试验例 1） 。并通过 STZ 致高血糖大鼠降血糖实验 （试验例 2） ， 充分肯定了其对 DM 模型 动物的降血糖作用， 也提示各组药物均有缓解糖。

32、尿病临床多饮、 多尿症状的作用特点， 进一 步通过 STZ 致高血糖大鼠胰岛素敏感性实验和体重变化实验研究表明 （试验例 3 和试验例 4） ， 化合物 （14) 均能改善机体对胰岛素敏感性、 提高胰岛素的生物利用度， 并且显著降低 体重。通过上述相关试验数据表明， 齐墩果烷型三帖类化合物对治疗 2 型糖尿病、 肥胖症及 并发症有潜在的实际意义。 0030 本发明的积极效果在于 ： 从虎耳草科植物丹顶草中提取、 分离获得的具有抑制蛋 白酪氨酸磷酸酯酶 1B 活性的分离得到齐墩果烷型三帖类化合物， 为一种新化合物， 该类化 合物具有明显的 PTP1B 抑制活性， 可在制备糖尿病、 肥胖症及并发症。

33、药物应用。对开发利用 中国的药用植物资源具有重要意义。 附图说明 0031 图 1 为本发明齐墩果烷型三帖类化合物 1 的 H 谱图 ； 图 2 为本发明齐墩果烷型三帖类化合物 1 的 C 谱图 ； 图 3 为本发明齐墩果烷型三帖类化合物 2 的 H 谱图 ； 图 4 为本发明齐墩果烷型三帖类化合物 2 的 C 谱图 ； 图 5 为本发明齐墩果烷型三帖类化合物 3 的 H 谱图 ； 图 6 为本发明齐墩果烷型三帖类化合物 3 的 C 谱图 ； 图 7 为本发明齐墩果烷型三帖类化合物 4 的 H 谱图 ； 图 8 为本发明齐墩果烷型三帖类化合物 4 的 C 谱图 ； 图 9 为本发明化合物 (1。

34、-4) 分别对 STZ 致高血糖大鼠胰岛素敏感性的影响图。 具体实施方式 0032 下面结合具体实施实例对本发明进一步阐述， 但不限制本发明。 0033 1H-NMR 用 Varian Mercury AMX500 型仪测定 ； MS 用 VG ZAB-HS 或 VG-7070 型仪 测定， 除注明外均为 EI 源 (70ev) ； 所使用的硅胶， 包括 200-300 目和 G254 为青岛海洋化 工厂 ； 所使用的聚酰胺为浙江省台州市路桥四青生化材料厂生产 ； 所使用的 TSK HW-40F 为 日本 TOSOH 公司生产 ； 所使用的 C18 为 E.Merck 公司生产 ； 所使用的 。

35、MCI GEL 20P 为日本 Mitsubishi Chemical Corporation 生产 ； STZ（链脲佐菌素） ， sanland 产品， 分析纯， 临用 前在 4 冰浴中用 0.05 mol/ml 柠檬酸 pH 4.5 溶液配制， 立即使用 ； 消渴丸， 广州中一药 业有限公司， 批号 ： GF0055。 0034 实施例 1 说 明 书 CN 102286057 A CN 102286067 A7/7 页 11 齐墩果烷型三帖类化合物的制备 将干燥粉碎的丹顶草 （Aceriphyllum rossii Engler） 根部 1.5-2.5 Kg 用 10L 甲醇 室温浸泡 。

36、3 天提取一次， 总共提取三次。合并甲醇提取液， 减压浓缩得浸膏 （178g） 。将浸 膏溶于 1.0-0.6L 水中， 成混悬液后用 3.0-2.0L 正己烷萃取， 正己烷萃取液减压浓缩得正 己烷浸膏 （89g） ； 将正己烷浸膏经过 200-300 目硅胶柱层析， 用以正己烷 / 乙酸乙酯 (V/V, 10:1-0:1) 为流动相进行梯度洗脱， 收集的分离组分利用硅胶薄层层析检测， 成份相同的分 离组分合并、 浓缩后得到 F1 至 F10 十个分离组分？。 0035 实施例 2 分离化合物 1 ： 将实施例 1 制备的 F10（1263.4 mg, 12-15% 乙酸乙酯） 部分， 经 2。

37、00-300 目硅胶柱层 析， 用以氯芳/丙酮(V/V, 10:1-1:1)为流动相进行梯度洗脱， 收集的分离组分利用硅胶薄 层层析检测， 成份相同的分离组分合并、 浓缩后得到 H1 至 H7 七个分离组分。浓缩的 H1 组 分 （191.2mg, 氯芳 / 丙酮 ,10:1-10:2） 经 400MHz 核磁共振检测氢谱， 判定为单体化合物， 既化合物 1 (191.2 mg)。其 1H 和13C-NMR 图谱如图 1、 图 2。 0036 实施例 3 分离化合物 2 ： 将实施例 2 制备的 H7(466.9 mg, 氯芳 / 丙酮 ,4:5-5:5) 部分， 经 200-300 目硅胶柱。

38、 层析， 用以正己烷/乙酸乙酯(V/V, 15:1-5:1)为流动相进行梯度洗脱， 收集的分离组分利 用硅胶薄层层析检测， 成份相同的分离组分合并、 浓缩后得到 G1 至 G6 六个分离组分。收集 的 G5 分离组分 (188.9 mg, 正己烷 / 乙酸乙酯 ,6:1)， 经反相高效液相色谱法， 使用 C18柱 (10m, 25010 mm)， 以乙腈 :H2O=50:1-100:1（V/V） 作为流动相梯度洗脱， 流速为 2mL/ min， 柱温 25， 210nm 波长下检测 70min。收集 22.3-26.9 min 洗脱液， 浓缩收集液得化合 物 2 (35.8 mg)。其 1H 。

39、和13C-NMR 图谱如图 3、 图 4。 0037 实施例 4 分离化合物 3 ： 将实施例 2 制备的 H5(268.9 mg, 氯芳 / 丙酮 ,1:1) 部分， 经反相高效液相色谱法， 使 用 C18柱 (10m, 25010 mm)， 以甲醇 : H2O =10:1-100:0（V/V） 作为流动相梯度洗脱， 流 速为 2mL/min， 柱温 25， 210nm 波长下检测 70min。收集 18.3-21.9 min 洗脱液， 浓缩收集 液得化合物 3 (77.9 mg)。其 1H 和13C-NMR 图谱如图 5、 图 6。 0038 实施例 5 分离化合物 4 ： 将实施例 3 。

40、制备的 G4(151.9 mg, 氯芳 / 丙酮 ,1:1) 部分， 经反相高效液相色谱法， 使 用 C18柱 (10m, 25010 mm)， 以乙腈 : H2O =50:1-100:1（V/V） 作为流动相梯度洗脱， 流 速为 2mL/min， 柱温 25， 210nm 波长下检测 70min。收集 25.3-27.9 min 洗脱液， 浓缩收集 液得化合物 4 (57.9 mg)。其 1H 和13C-NMR 图谱如图 7、 图 8。 说 明 书 CN 102286057 A CN 102286067 A1/5 页 12 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102286057 A CN 102286067 A2/5 页 13 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102286057 A CN 102286067 A3/5 页 14 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102286057 A CN 102286067 A4/5 页 15 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 102286057 A CN 102286067 A5/5 页 16 图 9 说 明 书 附 图 CN 102286057 A 。