技术领域
本发明涉及免疫原性肽以及包含该肽的用于预防或治疗HPV相关疾病的 组合物，更详细地说，涉及诱导生成HLA-A*2402类型子宫颈癌患者特异性的 细胞毒性T淋巴细胞的HPV类型16E7表位、以及包含该肽的用于预防或治 疗HPV相关疾病的组合物。
背景技术
子宫颈癌在女性中发生的恶性肿瘤中发病率高居第二位，全世界每年有 35万名以上的患者死于子宫颈癌，并且其数量继续增加（Pisani P等，Int J Cancer2002;97（1）：72-81.）。已知子宫颈癌主要由人乳头瘤病毒（human papillomavirus：HPV）引起，已证明了超过100多种的HPV中40多种在女 性生殖器中起到作用（de Villiers EM等，Virology 2004;324：17-27）。多种类 型的HPV中，特别是HPV类型16和HPV类型18在子宫颈癌患者中发现最 多，可以预测到其与肿瘤发生有重要关系，已知，其中的HPV类型16在子宫 颈癌患者中的感染率最高（Munoz N等，N Engl J Med2003;348（6）：518-27）。
已证明，当HPV感染正常细胞时，病毒癌基因插入宿主细胞（host cell） 基因，表达多种病毒蛋白质，其中E6和E7是强力的癌蛋白，其抑制作为肿 瘤抑制因子的p53和RB的作用，并促进向癌细胞转变以及持续生长（zur Hausen H.Nat Rev Cancer 2002;2（5）：342-50）。已知，E7抑制肿瘤抑制因子 即RB的功能，促进S期基因即细胞周期蛋白A和细胞周期蛋白E的活性（zur Hausen H等，Nat Rev Cancer 2002;2（5）：342-50;Phelps WC等，Cell 1988;53 （4）：539-47），并且，通过抑制细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂即CIP1（p21） 和KIP1（p27）的功能等的作用，妨碍感染细胞的细胞凋亡，诱导向肿瘤转变 （Funk JO等，Genes Dev1997;11（16）：2090-100;Zerfass-Thome K等，Oncogene 1996;13（11）：2323-30）。这样的病毒癌蛋白由于在正常细胞中未发现，因此 在以各种类型癌为对象的免疫治疗中，成为非常有力的靶（target），并且逐渐 成为为了生成能够治疗子宫颈癌的细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte：CTL）而要查名HPV表位这样的研究的主要对象。
至今为止，对于为了治疗子宫颈癌而开发出诱导生成HPV类型16特异性 的细胞毒性T淋巴细胞的特定的E7表位的研究而言，虽然有以在人类的人白 细胞抗原（human leukocyte antigen：HLA）等位基因（allele）中占大部分的 HLA-A*0201类型患者为中心进行研究而证明的结果（Kast WM等，J Immunol 1994;152：3904-12），但是几乎没有在作为人类的另一个主要人类白细胞抗原 等位基因的HLA-A*2402类型患者中证明的研究内容，这就是实情。
因此，在本发明中，通过流式细胞测定法（flow cytometry）和细胞毒性 （cytotoxicity）试验，要查明诱导生成细胞毒性T淋巴细胞的HPV类型16E7 表位，其中，所述细胞毒性T淋巴细胞能够治疗具有HLA-A*2402类型的子 宫颈癌患者。
发明内容
技术课题
本发明是鉴于上述的必要性而提出的，本发明的目的在于，提供一种诱导 生成细胞毒性T淋巴细胞的HPV类型16E7肽，其中，所述细胞毒性T淋巴 细胞能够治疗具有HLA-A*2402类型的子宫颈癌患者。
本发明的另一个目的在于，提供一种用于预防或治疗上述HPV相关疾病 的组合物。
解决课题手段
为了实现上述目的，本发明提供具有9个-10个源自HPV类型16E7蛋白 质的氨基酸序列的肽及其功能上相同的突变体。
此外，在本发明中，上述肽序列优选包含CDSTLRLCV（序列号16）或 LCVQSTHVDI（序列号35）的氨基酸序列，但并不限于此。
在本发明中，“功能上相同”及“实质上相同的生物学功能或活性”分别是 指，在通过相同的步骤来测定各自的多肽的生物学活性的情况下，其生物学活 性的约50%至约100%或其以上程度的生物学活性在与该多肽相比较的多肽中 显示。例如，图3的利用流式细胞测定法来确认HPV类型16E7表位特异性 的IFN-γ的生成和/或图4的利用51Cr释放法（51Cr release assay）来确认HPV 类型16E7表位（9mer，10mer）特异性的杀伤子宫颈癌细胞的效果的试验结 果是，本发明的功能上相同的肽是指，通过如图6b所示的步骤在图6c和图 6d中显示出与本发明的肽实质上相同的生物活性的肽，优选地，上述功能上 相同的肽优选具有CYQSTHVDI（序列号43）或CYVTLRVCL（序列号47） 的氨基酸序列，但并不限于此。
此外，本发明提供一种编码上述本发明序列号16或序列号35的肽的核酸。
另外，本发明中，优选编码序列号16的肽的基因具有序列号48的碱基序 列，并且编码序列号35的肽的基因具有序列号49的碱基序列，但诱发这些碱 基序列上发生一个以上的置换、缺失、增添等突然变异，显示出与本发明的目 标效果相同的活性的所有突然变异基因也包括在本发明的范围内。
此外，本发明提供分别编码序列号43或序列号47的肽的核酸。
这些CYQSTHVDI（m3，被置换的肽3号）和CYVTLRVCL（m7，被置 换的肽7号）肽可利用RNA密码子来推测其基因序列，可以出现如下的多种 组合（例如，序列号50-107）。
表1
表1是编码修饰肽（modified peptide）3即序列号43的肽的基因序列表。
表2
表2是编码修饰肽7即序列号47的基因序列表。
此外，本发明提供包含（a）上述的肽和（b）可药用的载体的药物组合物。
上述组合物对于治疗或预防HPV感染相关疾病，例如鲍温样丘疹病 （bowenoid papulosis）、肛门异常（anal dysplasia）、呼吸道或结膜乳头状瘤、 宫颈非典类型增生、子宫颈癌,外阴癌（vulval cancer）、或前列腺癌是有用的， 但并不限于此。
在本发明中，上述组合物的特征在于，其是HLA-A*2402类型患者特异性 的。
此外，本发明的肽或核酸可以选择性地制成微粒、脂质体或免疫刺激复合 物（ISCOM）（可以仅包含皂苷作为活性成分）、或者将本发明的肽放入适于 供给到施用对象的其他的输送手段中制成制剂。在使用微粒的情况下，其优选 具有如聚乳酸-羟基乙酸共聚物（poly-lactic-co-glycolic acid，PLGA）之类的共 聚物即聚合物基质。
哺乳类中，免疫反应（例如，包括MHC class I-介导或class II-介导免疫反 应的细胞免疫反应）可以通过将免疫原性肽施用于具有与免疫原性肽结合的 MHC分子的哺乳类，即人类、类人猿、狗、猫、兔子、牛、鼠而触发。上述 本发明的肽可以以微粒、脂质体或者ISCOM或溶液的一部分施用。
施用本发明的肽的另一个方法利用包含编码本发明的肽的核酸序列的表 达载体。该核酸序列也可以选择性地编码与上述本发明的肽连接的信号序列。 当该核酸编码信号序列时，优选其编码来自HLA-DR.alpha的信号序列Met Ala Ile Ser Gly Val Pro Val Leu Gly Phe Phe Ile Ile Ala Val Leu Met Ser Ala Gln Glu Ser Trp Ala（序列号108）。该情况下，本发明的序列可以具有例如序列号16 或35或其突然变异体的序列。优选该核酸不包含引起核酸感染的病毒基因， 并且不编码完整（intact）E7蛋白质。
本发明的核酸可以包含在质粒内，可以选择性地提供到包含聚合物基质的 微粒内。在优选的实施例中，聚合物基质必需由PLGA的共聚物构成。优选 该微粒具有例如0.02～20微米或约11微米以下的直径。优选多个微粒具有 0.02～20微米或约11微米以下的直径。
包含本发明的质粒的细胞也属于本发明的范围内。该细胞例如可以为B 细胞或其他抗原提呈细胞（APC）。该细胞在能够从编码它的质粒表达肽的条 件下进行培养或维持。
本发明的核酸和质粒对于例如将上述提及的质粒以“裸DNA”施用于哺乳 类而在哺乳类例如人类中诱导免疫反应的方法有用。该哺乳类可以具有HPV 感染、宫颈非典型增生、和/或子宫颈癌的危险或疾病。本发明的核酸和质粒 也可以插入微粒、脂质体、ISCOMS或如上述记载那样的其他适宜的输送手段 中。
如果在说明书中没有特别的定义，则本说明书中使用的所有的科学术语和 技术术语具有与本发明所属技术领域的技术人员通常所理解的意思相同的意 思。
本发明中所记载的肽和编码该肽的核酸可以用于引起针对HPV E7蛋白质 的免疫反应。
本发明的肽可以连接有将该肽输送到细胞内器官的运输（trafficking）序 列。该运输序列是起到调节附着有该运输序列的肽的细胞内运输（指引从小器 官到小器官或细胞表面移动）的功能的氨基酸序列。这样的运输序列可以将该 多肽运输到ER、溶酶体或核内体，可以包含信号肽（翻译期间将蛋白质指引 到ER的N-末端序列），例如KDEL之类的ER滞留序列、和KFERQ或QREFK 之类的溶酶体靶序列。
短的氨基酸序列可以起到将蛋白质靶向特定细胞内器官的信号的功能。例 如在前往ER的蛋白质的氨基酸末端发现疏水性信号肽。
这样的运输序列可以为HLA-DR.alpha前导序列即Met Ala Ile Ser Gly Val Pro Val Leu Gly Phe Phe Ile Ile Ala Val Leu Met Ser Ala Gln Glu Ser Trp Ala（序列 号108）。如果该部分足以将本发明的多肽运输到ER，则可以仅包含该信号肽 的上述特定的25个残基序列中的一部分（例如至少9个氨基酸残基）。
在一些情况下，为了能够利用信号肽酶来进行加工（即剪切），优选将编 码本发明的HPV E7抗原性肽的序列和运输序列连接的部分有变异。针对信号 肽的识别序列记载于Von Heijne,NAR14：4683,1986。
当构建编码本发明的肽的DNA时，可以使用标准技术（例如参见WO 94/04171中所记载的技术）。该构建体可以包括在人类细胞中增加表达的附加 序列，例如适当的启动子、编码序列的RNA稳定5′和3′序列、内含子（可以 位于被编码的序列内5′或3′中的任一侧）、和Poly（A）附加位点，以及使得 该构建体能够对原核和/或真核宿主进行选择和复制的复制起点和选择标记。
本发明的质粒内可以具有卡那霉素抗性基因（519-1313部位）、SV40早 期启动子（131-484部位）以及胸苷激酶（thymidine kinase，TK）多聚腺苷化 位点（1314-1758部位）。卡那霉素抗性基因以及相关调节序列只是用于选择的 目的，如果不需要选择或不优选，则可以从质粒中除去。
在已知被HPV感染、怀疑被HPV感染、或有可能被HPV感染的对象中， 可以使用本发明的肽和核酸作为预防或治疗疫苗。其他适宜对象包括呈现 HPV-相关疾病的症状或好像要发生疾病的人。本发明的肽和疫苗可以用作治 疗或预防HPV菌株16的感染相关疾病的疫苗，例如治疗或预防鲍温样丘疹病 （bowenoid papulosis）、肛门异常（anal dysplasia）、呼吸道或结膜乳头状瘤、 宫颈非典类型增生、子宫颈癌、外阴癌（vulval cancer）、或前列腺癌的疫苗。
为了治疗HPV感染或HPV感染相关疾病，本发明的肽或核酸可以单独施 用、或者与本领域中公知的其他治疗法例如化学治疗药、放射线和手术一起施 用。此外，本发明的肽和核酸可以与为了增进免疫反应而想出的其他治疗、例 如本领域中周知的佐剂或细胞因子（或编码细胞因子的核酸）混合施用。
本发明的肽或核酸可以用于制造HPV感染或HPV感染相关疾病的预防或 治疗用药物。
本发明的输送系统可以用于将肽或表达该肽的DNA构建体输送到欲促进 对HPV的免疫反应的适当的细胞中。
本发明的肽或编码该肽的核酸可以使用标准方法、例如Donnelly et al.,J. Imm.Methods176：145,1994和Vitiello et al.,J.Clin.Invest.95：341,1995中 所记载的方法那样的方法来施用。
本发明的肽或核酸可以以本领域中公知的形态，例如以肌肉注射、静脉注 射、动脉注射、皮内注射、腹腔注射、鼻内、阴道内、灌肠、皮下注射方式施 用，或者它们可以通过例如包含微粒的粉末或溶液的吸入而施用于胃肠道、粘 膜或呼吸器官内。可以局部（例如子宫颈部或感染部位）或全身施用。
本发明的肽或编码该肽的核酸可以用胶体悬浮液、粉末、生理盐水、脂质、 脂质体、微球（microspheres）、或纳米球形粒子之类的可药用的载体输送。它 们可以与输送手段形成复合物或相关、或者是裸露的，可以使用脂质、脂质体、 微粒、金、纳米粒子、聚合物、缩合剂、多糖类、聚氨基酸、树状物、皂苷、 吸附增强物质或脂肪酸之类的本领域中公知的输送系统来输送。
用量优选1次每1kg体重施用约0.1～100微摩尔的肽或约1～200微克的 DNA。当然，如本领域中周知，规定的对患者的用量依赖于多种因素，该因 素包括患者的身高、体表面积、年龄、施用的特定化合物、性别、施用时间和 途径、一般健康状态以及同时施用的其他药物。在具有通常的知识的药剂师的 能力范围内灵活地决定适宜施用量。
也可以使用基因枪（biolistic）传递或体外（ex vivo）处理之类的其他标 准传递方法。体外处理中，可以从患者或适宜的捐献者得到例如抗原提呈细胞 （APCs）、树突状细胞、外周血单核细胞、或骨髓细胞，用本免疫组合物在体 外活化后，施用于该患者。
可以使用将美国专利第5,783,567中所记载的物质包括在内的微粒作为用 于将DNA或肽之类的巨大分子输送到细胞内的输送手段。它们包括包围在聚 合物的壳内或进入聚合物基质的巨大分子。微粒例如发挥以未分解的状态维持 已进入的DNA那样的维持巨大分子的特性的作用。微粒还可以用于将巨大分 子脉冲输送、以及输送到特定位置或者输送到特定细胞或靶细胞群。
聚合物基质可以为聚乳酸-羟基乙酸共聚物、淀粉、明胶或甲壳素之类的 生物降解型共聚物。微粒可以特别用于使DNA分子向对象的吞噬细胞的转移 最大化。或者该微粒可以注射或植入到组织。
本发明的肽可以通过本领域中周知的脂质、树状物或脂质体施用于对象。 众所周知，例如输送免疫肽或编码该肽的核酸的脂质体在体内引起CTL反应 （Reddy et al.,J.Immunol.148：1585,1992;Collins et al.,J.Immunol.148： 3336-3341,1992;Fries et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：358,1992;Nabel et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.（USA）89：5157,1992）.
本发明的肽和核酸可以使用大小为30-40nm、带负电荷、具有笼状结构的 免疫刺激复合物（Immune Stimulating Complexes，ISCOMS）来施用，该免疫 刺激复合物是将皂苷单独或者将胆固醇和Quil A（皂苷）同时混合而成。本发 明的肽和核酸可以与ISCOMS同时施用或分别施用。
保护性免疫是在包括使用ISCOMS作为针对抗原的输送手段的弓形虫病、 及Epstein-Barr病毒诱发的肿瘤在内的多种感染实验模型中生成（Mowat et al., Immunology Today12：383-385,1991）。已发现，被制成胶囊的1ug的低抗原 量的ISCOMS产生class I介导的CTL反应（Takahashi et al.,Nature344：873-875, 1990）。
引起免疫反应的本发明的肽和核酸的能力可以使用本领域中周知的测定 免疫反应的方法来分析。例如，细胞毒性T细胞的生成可以通过使用MHC四 聚物、测定细胞内细胞因子的表达、或者标准51Cr释放法来显示。ELISA或 ELISPOT之类的标准分析也可以用于测定有助于T细胞活化的细胞因子谱。T 细胞增殖还可以使用本领域中公知的其他分析和3H-胸腺嘧啶脱氧核苷摄取法 之类的分析来测定。B细胞反应可以使用ELISA之类的分析来测定。
数字图像、细胞学阴道镜和组织学检查之类的其他方法可以用于测定本发 明的肽和核酸对于乳头瘤病毒相关病灶或乳头瘤病毒水平的效果。
以下详细说明本发明。
之前进行的关于以HPV类型16E7为对象的过继性CD8+T细胞治疗的 研究是以具有HLA-A*0201类型的白色人种（cacasian）为主进行，并表明了 显示出抗癌效果的几个特异性的E7表位。但在实际上，根本没有为了占全世 界人口一半以上的黄色人种（Asian）中占多数的HLA-A*2402类型患者的过 继性CD8+T细胞治疗而进行得到的HPV类型16E7表位的研究成果。
本发明中，对于从正常HLA-A*2402类型血液捐献者得以供给的PBMC， 用所合成的E7肽进行处理，培养1周或2周后，测定IFN-γ的表达程度，选 定诱导向CD8+T细胞分化的肽的候选，使用细胞毒性实验、即51Cr释放法， 确认实际抗癌效果。如图1所示，所合成的14个15mer肽中，E761-75 （CDSTLRLCVQSTHVD）、E7 67-81（LCVQSTHVDIRTLED）肽与其他E7肽 相比，显示出高值的IFN-γ的生成，为了确认使用流式细胞测定法来筛选的 E7 61-75（CDSTLRLCVQSTHVD）和E767-81（LCVQSTHVDIRTLED）表位 是否实际上对HLA-A*2402类型子宫颈癌细胞显示出抗癌效果，利用51Cr释 放法，测定细胞杀伤效果，结果可知，用E7 67-81（LCVQSTHVDIRTLED） 表位进行处理的试验组显示出与阴性对照组相比明显高的细胞杀伤效果。另一 方面，流式细胞测定法中IFN-γ和CD69的表达程度显示出与E7 67-81 （LCVQSTHVDIRTLED）表位相似的E7 61-75（CDSTLRLCVQSTHVD）表 位与E7 67-81（LCVQSTHVDIRTLED）表位相比，细胞杀伤效果显示出乎意 料地低（图2）。出现这样的结果的原因被预测为，由两个E7表位的氨基酸序 列差异引起的实际对子宫颈癌细胞的诱发免疫性程度不同。
实际上，利用为了查找癌细胞的MHC class I分子中所呈现的正确的表位 而如上查明的15mer肽，分别合成长度为9mer和10mer的肽，该长度被已知 作为与MHC class I分子结合的表位的长度，并利用流式细胞测定法进行分析， 结果显示出E761-69（CDSTLRLCV）和E7 67-76（LCVQSTHVDI）肽有效地 诱导细胞毒性T细胞的活性，从而可以预测到其具有高的免疫原性 （immunogenic）（图3）。此外，利用筛选出的E7 61-69（CDSTLRLCV）和 E7 67-76（LCVQSTHVDI）肽，培养PBMC后，利用51Cr释放法，测定子宫 颈癌细胞杀伤效果，结果可确认到，两种肽均显示出与E7 67-81 （LCVQSTHVDIRTLED）表位相比更高的效应（图4）。
与此同时，利用预测分子结合力的计算机程序，将E7 61-69 （CDSTLRLCV）和E7 67-76（LCVQSTHVDI）肽的氨基酸序列置换成与 HLA-A*2402分子结合力高的形态，用这样合成的CYQSTHVDI（m3，被置 换的肽3号）和CYVTLRVCL（m7，被置换的肽7号）肽进行处理并培养PBMC 后，实施流式细胞测定法，结果可确认，与现有肽相比，诱导更高的细胞毒性 T细胞的活性（图6～9）。此外，将E7 61-69（CDSTLRLCV）和E7 67-76 （LCVQSTHVDI）肽置换成与HLA-A*2402分子结合力高的形态，用这样合 成的CYQSTHVDI（m3，被置换的肽3号）和CYVTLRVCL（m7，被置换的 肽7号）肽进行处理并培养PBMC后，测定细胞杀伤效果，结果可知，与现 有肽相比，显示出更高的细胞杀伤效应（图6～9）。由此可确认，通过利用E7 61-69（CDSTLRLCV）和E767-76（LCVQSTHVDI）表位来诱导细胞毒性T 细胞的活性，可以实际有效地作用于子宫颈癌细胞的杀伤，并且可确认，其变 异肽、即CYQSTHVDI（m3，被置换的肽3号）和CYVTLRVCL（m7，被置 换的肽7号）可有效地应用于HLA-A*2402类型子宫颈癌患者的治疗和疫苗开 发（图10～12）。
通过以往研究，在利用子宫颈癌动物模型的实验中确认了细胞毒性T细 胞的抗癌效果（Patel S等，Curr Opin Obstet Gynecol2009;21（1）：54-9;Kim TY 等，Cancer Res2002;62：7234-40）。本发明中，为了在活体内确认筛选出的 E7表位的抗癌效应，利用HLA-A*2402类型子宫颈癌细胞珠即SiHa，构建小 鼠模型。对5周龄的BALB/c裸鼠注入子宫颈癌细胞株即SiHa，形成肿瘤后， 施用了用筛选出的E7肽进行处理并培养的PBMC或CD8+T细胞，并确认了 细胞毒性T细胞的肿瘤清除或抑制效果。由结果所示可知，当将用E7 67-76 （LCVQSTHVDI）进行处理并培养的PBMC施用于形成有肿瘤的小鼠时，与 未进行任何处理的阴性对照组相比，肿瘤的生长得以抑制（图10）。
此外，在将用E7 61-69（CDSTLRLCV）、E7 67-76（LCVQSTHVDI）、 CYQSTHVDI（m3，被置换的肽3号）和CYVTLRVCL（m7，被置换的肽7 号）进行处理并培养的CD8+T细胞施用于小鼠后，确认肿瘤的大小时，可确 认到与未进行任何处理的阴性对照组相比肿瘤的生长得以大大抑制（图11和 12）。由此可确认，用通过利用子宫颈癌小鼠模型的动物实验而在活体内试验 中筛选出的E7 61-69（CDSTLRLCV）、E7 67-76（LCVQSTHVDI）、CYQSTHVDI （m3，被置换的肽3号）和CYVTLRVCL（m7，被置换的肽7号）肽进行处 理并培养的细胞毒性T细胞具有子宫颈癌的生长抑制效果。
结果是，通过流式细胞测定法和细胞毒性实验HPV类型16 E7 67-81 （LCVQSTHVDIRTLED）可用作能够生成子宫颈癌特异性的细胞毒性T细胞 的表位，可预测到，E7 67-81（LCVQSTHVDIRTLED）的15个氨基酸序列中 长度为9mer及10mer的E7 61-69（CDSTLRLCV）和E7 67-76（LCVQSTHVDI） 表位确实在HLA-A*2402中有表达而诱导免疫原性。
此外，E7 61-69（CDSTLRLCV）和E7 67-76（LCVQSTHVDI）肽的氨基 酸被置换的形态的CYQSTHVDI（m3，被置换的肽3号）和CYVTLRVCL（m7， 被置换的肽7号）肽显示出更高的抗癌效果，可以证明它们是对于HLA-A*2402 类型子宫颈癌的疫苗开发和过继性免疫细胞治疗所需的细胞毒性T淋巴细胞 生成有效的表位。
发明效果
通过本发明可知，HPV类型16E7中长度为15mer的67-81（LCVQSTHV DIRTLED）可用作能够生成子宫颈癌特异性的细胞毒性T细胞的表位，已确 认其中E7 61-69（CDSTLRLCV）和E7 67-76（LCVQSTHVDI）表位具有更高 的抗癌效应，E7 61-69（CDSTLRLCV）和E7 67-76（LCVQSTHVDI）肽的氨 基酸被置换的形态的CYQSTHVDI和CYVTLRVCL肽显示出更高的抗癌效 果，可以证明它们是对于HLA-A*2402类型子宫颈癌的疫苗开发和过继性免疫 细胞治疗所需的细胞毒性T淋巴细胞生成有效的表位。
附图说明
图1是利用流式细胞测定法来确认HPV类型16E7表位（15mer）特异性 的IFN-γ的生成的图。捐献者1：HLA-A*2402/2601。
图2是利用51Cr释放法来确认HPV类型16E7表位（15mer）特异性的子 宫颈癌细胞的杀伤效果的图。捐献者2：HLA-A*2402/3303（E：效应细胞 （effector），T：靶细胞（target cell））。
图3是利用流式细胞测定法来确认HPV类型16E7表位（9mer/10mer） 特异性的IFN-γ的生成的图。捐献者3：HLA-A*0203/2402。
图4是利用51Cr释放法来确认HPV类型16E7表位（9mer，10mer）特 异性的子宫颈癌细胞的杀伤效果的图。捐献者4：HLA-A*2402/3101。（E：效 应细胞，T：靶细胞）
图5是利用51Cr释放法来比较从PBMC分离的CTL与CTL被去除的 PBMC的子宫颈癌细胞杀伤效果的图。捐献者5：HLA-A*0206/2402。（E：效 应细胞，T：靶细胞）
图6～9是确认通过置换氨基酸而合成的HPV类型16E7表位特异性的细 胞毒性效果的图，（图6）是E7 61-69（9mer，肽16）和E7 67-76（10mer，肽 35）与HLA-A*2402分子的结合结构预测图，（图7）是计算通过氨基酸置换 而合成的HPV类型16E7肽的结合能的图，（图8）是利用流式细胞测定法来 确认通过置换而合成的HPV类型16E7表位特异性的IFN-γ的生成的图，（图 9）是利用51Cr释放法来确认通过置换而合成的HPV类型16E7表位特异性的 子宫颈癌细胞的杀伤效果的图，（c）捐献者6：HLA-A*2402/2402（d）捐献者 7：HLA-A*2402/3101。（E：效应细胞，T：靶细胞）
图10～12是确认细胞毒性T细胞在子宫颈癌小鼠模型中的抗癌治疗效果 的图，（图10）是将用筛选出的E7肽进行处理并培养的PBMC施用于植入子 宫颈癌肿瘤的小鼠后、测定肿瘤的大小变化的图，（图11）是用筛选出的E7 肽进行处理并培养的CTL施用于植入子宫颈癌肿瘤的小鼠后、测定肿瘤的大 小变化及重量（图12）的图。（a）捐献者8：HLA-A*0206/2402（b）捐献者9： HLA-A*2402/3303。
具体实施方式
下面，通过非限定性实施例更详细说明本发明。但下述实施例只是为了例 示本发明而记载的，不应解释为本发明的范围限定于下述实施例。
实施例1：肽（peptide）的合成
对于HPV类型16E7蛋白质的全部氨基酸序列，利用计算机算法 （computer algorithms），各自以15mer的大小重叠（overlapping）的方式分开 合成后，利用高效液相色谱（high performance liquid chromatography：HPLC） 仪器，最终选择纯度为95%以上的肽，共计合成14个（表3）。为了在14个 所合成的长度为15mer的肽中查出确实在MHC class I分子中呈现的表位，通 过试验筛选出2个抗癌效应高的肽，以已知作为MHC class I分子中呈现的表 位的大小的9mer和10mer重复的方式分开合成后，利用HPLC仪器，共计合 成25个纯度为95%以上的肽（表4）。从25个所合成的长度为9mer和10mer 的肽中筛选出2个抗癌效应高的肽，以此为基础，利用计算机结构分析软件， 预测实际上与HLA-A*2402分子结合力最高的氨基酸序列，置换合成部分氨基 酸（表5）。以这样的方式合成的肽溶解在1%DMSO PBS中后，冷冻保藏于 -20℃，然后在使用之前于室温解冻并使用。本发明的肽是委托韩国燕岐郡的 A&Pep公司来合成。
表3
序列号 氨基酸位置 氨基酸序列 1 1-15 MHGDTPTLHEYMLDL 2 7-21 TLHEYMLDLQPETTD 3 13-27 LDLQPETTDLYCYEQ 4 19-33 TTDLYCYEQLNDSSE 5 25-39 YEQLNDSSEEEDEID 6 3l-45 SSEEEDEIDGPAGQA 7 37-51 EIDGPAGQAEPDRAH 8 43-57 GQAEPDRAHYNIVTF 9 49-63 RAHYNIVTFCCKCDS 10 55-69 VTFCCKCDSTLRLCV 11 6l-75 CDSTLRLCVQSTHVD 12 67-8l LCVQSTHVDIRTLED 13 73-87 HVDIRTLEDLLMGTL 14 79-93 LEDLLMGTLGIVCPI 15 85-98 GTLGIVCPICSQKP
表3中表示所合成的HPV类型16E7肽(15mer)。
表4
序列号 氨基酸位置 氨基酸序列 16 6l-69 CDSTLRLCV 17 62-70 DSTLRLCVQ l8 63-7l STLRLCVQS 19 64-72 TLRLCVQST 20 65-73 LRLCVQSTH 21 66-74 RLCVQSTHV 22 67-75 LCVQSTHVD 23 68-76 CVQSTHVDI 24 69-77 VQSTHVDIH 25 70-78 QSTHVDIRT 26 7l-79 STHVDIRTL 27 72-80 THVDIRTLE 28 73-81 HVDIRTLED 29 61-70 CDSTLRLCVQ 30 62-71 DSTLRLCVQS 31 63-72 STLRLCVQST 32 64-73 TLRLCVQSTH 33 65-74 LRLCVQSTHV 34 66-75 RLCVQSTHVD 35 67-76 LCVQSTHVDI 36 68-77 CVQSTHVDIR 37 69-78 VQSTHVDIRT 38 70-78 QSTHVDIRTL 39 7l-80 STHVDIRTLE 40 72-81 THVDIRTLED
表4中表示所合成的HPV类型16E7肽(9mer和10mer)。
表5
序列号 现有氨基酸序列 被置换的氨基酸序列 41 LCVQSTHVDI(68-76) CIQSTHVDI 42 LCVQSTHVDI(68-76) CYQSTSVDL 43 LCVQSTHVDI(68-76) CYQSTHVDI 44 LCVQSTHVDI(68-76) CYQSTHVDL 45 CDSTLRLCV(61-69) CYATLRVCL 46 CDSTLRLCV(61-69) CYSTLRACL 47 CDSTLRLCV(61-69) CYVTLRVCL
表5中表示所合成的HPV类型16E7肽(氨基酸置换)。
实施例2：细胞的准备
从在研究同意书中签名的HLA-A*2402类型血液捐献者(表4)的血液中， 利用离心分离(centrifugation)，分离PBMC(外周血单核细胞，peripheral blood mononuclear cell)。简单说明的话，使用Ficoll-Hypaque 1.077，形成浓度梯度 (density-gradient)后，在其上小心地流入捐献者的血液，接着以2000rpm的 速度在常温下实施离心分离15分钟，然后仅采集白细胞层(buffy coat)，用 PBS清洗2次并用于试验。
表6
血液捐献者(donor) 性别 HLA-A HLA-B HLA-C 1 男 A*2402/2601 15，35 03，04 2 男 A*2402/3303 07，44 07，07 3 男 A*0203/2402 35，5l 07，14 4 男 A*2402/3001 13，55 01，06 5 男 A*0206/2402 07，59 01，07 6 男 A*2402/2402 40，40 03，04 7 男 A*2402/3101 35，51 03，14 8 男 A*0206/2402 35，54 01，03 9 男 A*2402/3303 40，58 03，08
表6是关于HLA-A*2402类型血液捐献者的表。
实施例3：由PBMC生成自体树突状细胞(autologous dendritic cell)
将通过离心分离得到的PBMC放入含有RPMI培养液(10％FBS，5％抗 生素)的T75烧瓶内，在37℃下培养2小时。然后，去除浮游细胞，在附着 于烧瓶的单核细胞(monocyte)中，添加白细胞介素-4(IL-4，1000U/ml)和 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，800U/ml)。培养开始后第2天、 第4天时，分别加入IL-4（1000U/ml）和GM-CSF（1600U/ml）。根据细胞 的生长，随时交换RPMI培养液。培养开始后第5天时，添加肿瘤坏死因子-α （TNF-α，1000u/ml）（Lim JB等，Exp Hematol2006;34（3）：296-307;Provenzano M等，J Immunother2002;25：342-351）。
实施例4：肽特异性的多克隆细胞毒性T细胞的生成
使超低温冷冻的HLA-A*2402类型血液捐献者的PBMC解冻，在每孔各 填充有2ml的RPMI培养液的24孔培养容器内，加入适当数量的细胞。培养 开始后第1天时，将待测试的肽（10μg/ml）和白细胞介素-2（IL-2,1000U/ml） 添加到各孔内。培养期间，每隔两天加入IL-2（1000U/ml），并交换培养液。 培养开始后第7天时，添加用通过上述方法来生成的树突状细胞（细胞数最少 为细胞毒性T细胞数的10分之1以上）和肽（20μg/ml）。
实施例5：利用流式细胞测定法（flow cytometry）来测定细胞内干扰素-γ （IFN-γ）生成
培养开始后第7天时，将添加有树突状细胞和肽的细胞毒性T细胞在37℃ 下培养1小时。此时，向试验组中的一组，加入植物血球凝集素（PHA，0.25 μg/ml）。培养后，分别添加10μg的布雷非德菌素A（brefeldin A，BFA），然 后在37℃下培养5小时。其后，从各个孔收集细胞，用PBS（磷酸盐缓冲液， phosphate-buffered saline）清洗。清洗后，加入含有1mM浓度的EDTA的PBS， 在37℃培养10分钟。当培养结束时，用包含5%FBS的PBS清洗2次，以1： 100比例分别加入荧光标记的抗体、即多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质（PerCP）结 合的小鼠抗人CD3+抗体和藻红蛋白（PE）结合的小鼠抗人CD8+抗体，然后 在4℃下、以黑暗（dark）状态培养15分钟。培养后，分别用裂解液（lysing solution）和破膜剂（permeabilization solution）进行处理，添加异硫氰酸荧光 素（fluorescein isothiocyanate，FITC）结合的小鼠抗人IFN-γ抗体，然后在4℃ 下、以黑暗状态培养30分钟。其后，用包含5%FBS的PBS清洗2次，用1% 甲醛（formaldehyde）固定，然后利用荧光激活细胞分选（fluorescence activated cell sorting，FACS）装置来测定并分析（Kern F等，Eur J Immunol2000;30： 1676-1682;Gratama JW等，Cytometry2004;58：79-86）。
实施例6：细胞毒性实验（cytotoxicity assay）
以子宫颈癌细胞株为靶细胞（target cell），使用51Cr释放法，实施细胞毒 性实验。简单说明的话，向在RPMI培养液中培养的HLA-A*2402类型子宫颈 癌细胞株，添加0.1mCi的Na251CrO4，在37℃下培养45分钟。用PBS清洗 2次后，将适当数量的靶细胞以各种比例加入细胞毒性T细胞中，并在37℃ 下培养5小时。当培养结束时，以1500rpm进行离心分离5钟，在预先准备 的γ-计数器试管（γ-counter tube）中，各移入100μl。利用γ-射线计数器（γ-ray counter）进行测定并分析。细胞毒性T细胞特异性的靶细胞杀伤的程度利用公 式[（实验cpm-自发cpm）/（最大cpm-自发cpm）]×100来计算（Bao L等， Biol Blood Marrow Transplant2008;14：1156-1162）。
实施例7：蛋白质-MHC复合物结合亲和度的计算机模拟（In silico）测定 法
为了测定肽与MHC分子的结合亲和度，构建肽-MHC复合物模型，算出 结合状态与分离状态的能量之差，计算复合物形成能量，假设为更稳定的复合 物具有更高的结合亲和度。首先，肽-MHC复合物结构是以PDB id 2BAK的 结构为基础进行模拟，复合物能量最小化利用以CHARMM（Chemistry at HARvard Macromolecular Mechanics）力场为基础的Insight Ⅱ（Accelrys Software Inc）程序。使能量最小化后，利用蛋白质设计和结合亲和度计算程 序、即EGAD来计算能量对复合物形成的贡献度和各残基（residue）之间的 接触。初期设定被用于复合物形成能量计算（Pokala N等，J Mol Biol2005;347： 203-27）。以程序的计算结果为基础，对于复合物形成能量的比较测定，利用 几个′pseudo_DELTA_G_complex_formation′数值。为了测定各接触点（interface） 残基的能量贡献度测定，收集各水平的1个接触点残基的dG数值。
实施例8：利用子宫颈癌小鼠模型的动物实验
向5周龄的BALB/c裸鼠的右侧肋，注入5×105个子宫颈癌细胞株、即SiHa 细胞（Friedl F等，Proc Soc Exp Biol Med1970;135（2）：543-5），诱导形成肿 瘤。为了确认细胞毒性T细胞对子宫颈癌的治疗效果，而在肿瘤的大小达到 一定数值（40mm3～50mm3）时，将用各个肽进行处理的PBMC（l×107个） 或分离的CTL（3×106）通过小鼠尾静脉注入周围血中。肿瘤的大小利用卡尺 （caliper）每天进行测定，利用公式[（a×b）/2，a为长轴，b为短轴]，计算 平均值并记录。
上述实施例的结果如下。
（1）HLA-A*2402特异性的长度为15mer的HPV类型16E7表位的探究
为了在所合成的14个HPV类型16E7肽中筛选出HLA-A*2402类型患者 特异性地诱导生成细胞毒性T细胞的E7表位的候选，对血液捐献者的PBMC 用各个肽进行处理，在1周后，与所培养的用IL-2（阴性对照组）、pp65328-336 （CMV A24,QYDPVAALF，阳性对照组）（Szmania S等，Blood2001;98（3）： 505-12）和pp65495-493（CMV A02,NLVPMVATV，阴性对照组）（Solache A 等，J Immunol1999;163：5512-8）分别进行处理的对照组进行比较。如图1 所示可知，与仅用IL-2进行处理的对照组相比，14个肽均诱导更高的IFN-γ 的生成，在与阴性对照组（negative control）相比显示出更高的数值的IFN-γ 的生成的肽中，用E761-75（CDSTLRLCVQSTHVD）和E7 67-81 （LCVQSTHVDIRTLED）肽进行处理的试验组显示出IFN-γ的生成数值高， 该值几乎接近阳性对照组（positive control）的水准。为了确认利用流式细胞 测定法来筛选出的E7表位在实际上是否显示出对HLA-A*2402类型子宫颈癌 细胞发生作用并杀伤的效果，利用51Cr释放法进行分析。对于血液捐献者的 PBMC，分别用IL-2、E7 61-75（CDSTLRLCVQSTHVD）、E7 67-81 （LCVQSTHVDIRTLED）和pp65 495-493（CMV A02,NLVPMVATV，阴性对 照组）肽进行处理，1周后与所培养的同一个患者的树突状细胞一起，用各个 肽再次进行处理后培养1周，然后与51Cr标记的HLA-A*2402类型子宫颈癌 细胞混合，培养5小时，利用γ-射线测定器进行分析。查看分析结果，与用IL-2 或pp65 495-493（CMV A02,NLVPMVATV）等进行处理的阴性对照组相比， 用E7 67-81（LCVQSTHVDIRTLED）肽进行处理的试验组显示出明显高的数 值的细胞杀伤效果。可知，用E7 61-75（CDSTLRLCVQSTHVD）肽进行处理 的试验组不如E7 67-81（LCVQSTHVDIRTLED）肽的效果（图2）。
（2）HLA-A*2402特异性的长度为9/10mer的HPV类型16E7表位的探 究
通过上述结果，选择E7 61-75（CDSTLRLCVQSTHVD）和E7 67-81 （LCVQSTHVDIRTLED）肽作为有力的表位候选，用以该肽为对象再合成长 度分别为9mer和10mer的肽对PBMC进行处理并培养后，与IL-2（阴性对照 组）、pp65328-336（CMV A24，QYDPVAALF，阳性对照组）和pp6591-100 （CMV A33,SVNVHNPTGR,阴性对照组）进行比较，结果可确认，与阳性 对照组相比，用E7 61-69（CDSTLRLCV）和E7 67-76（LCVQSTHVDI）肽进 行处理的试验组显示出更高的数值（图3）。此外，用以E7 67-81 （LCVQSTHVDIRTLED）肽为基础而合成的长度为9mer和10mer的候选肽、 即E7 61-69（CDSTLRLCV）和E7 67-76（LCVQSTHVDI）对PBMC进行处 理，利用51Cr释放法，与用pp65 495-493（CMV A02,NLVPMVATV,阴性对 照组）以及之前筛选的长度为15mer的E7 67-81（LCVQSTHVDIRTLED）肽 进行处理的对照组相比较，结果可确认，与长度为15mer的E7 67-81 （LCVQSTHVDIRTLED）肽相比，新合成的两种肽显示出更高的或类似的细 胞杀伤效果（图4）。
（3）由CTL引起的HPV 16 E7肽特异性的细胞毒性效果的确认
为了证明之前确认的HPV 16 E7肽特异性的细胞毒性效果由PBMC中所 包含的CTL的作用而引起的，使用抗-CD8+抗体结合的微球（microbead），从 血液捐献者的PBMC分离CD8+T细胞后，分别用筛选出的E7肽进行处理并 培养，然后利用51Cr释放法，与以相同的条件培养的、去除了CD8+T细胞的 PBMC相比较的结果是，去除了CD8+T细胞的PBMC中不显示细胞毒性效果， 可知PBMC中所包含的CTL确实参与细胞毒性作用（图5）。
（4）氨基酸被置换的E7肽的细胞毒性效果确认
为了支持之前出现的结果，利用EGAD程序，计算E7表位与MHC复合 物的结合形成能量结果，算出的E7 61-69（CDSTLRLCV）和E7 67-76 （LCVQSTHVDI）肽与HLA-A*2402复合物的结合形成能量值低，为负值， 可确认其是稳定的结合（图6）。由此可预测，两种肽能够与HLA-A*2402分 子结合而产生免疫活性。
对于以这样的结果为基础筛选出的两种长度为9mer/10mer的肽与 HLA-A*2402分子之间的结合力，利用Insight Ⅱ程序进行计算，预测出通过 对E7 61-69（CDSTLRLCV）和E7 67-76（LCVQSTHVDI）肽的部分氨基酸序 列进行置换而算出更高的结合力数值的肽并合成后（图7），对PBMC进行处 理1周并培养，然后与pp65 328-336（CMV A24，QYDPVAALF，阳性对照组）、 pp65 495-493（CMV A02，NLVPMVATV，阴性对照组）及现有E7 61-69 （CDSTLRLCV）和E7 67-76（LCVQSTHVDI）肽进行比较，结果可确认， 与对照组及现有肽相比，被置换的肽CYQSTHVDI（m-肽3，被置换的肽3号） 和CYVTLRVCL（m-肽7，被置换的肽7号）强烈诱导IFN-γ的生成。（图8）。 此外，为了确认通过流式细胞测定法筛选出的CYQSTHVDI（m-肽3，被置换 的肽3号）和CYVTLRVCL（m-肽7，被置换的肽7号）的细胞杀伤效果，利 用51Cr释放法，将两种肽与现有的E7 61-69（CDSTLRLCV）和E7 67-76 （LCVQSTHVDI）肽进行比较，结果可确认，与现有肽相比，氨基酸被置换 的肽显示出更高的细胞杀伤效果（图9）。由此，可以将E7 61-69（CDSTLRLCV） 和E7 67-76（LCVQSTHVDI）肽预测为有力的特异性E7表位，并且可知，如 果对于两种肽以与HLA-A*2402分子结合力最高的形态置换氨基酸，则更加强 烈的诱导细胞毒性T细胞的活性。
（5）在子宫颈癌小鼠模型中利用细胞毒性T细胞进行的抗癌试验
对BALB/c裸鼠，注入子宫颈癌细胞株即SiHa，形成肿瘤后，利用通过 体外试验筛选出的肽，确认细胞毒性T细胞的抗癌效果。如图10～12所示可 知，与未进行任何处理的阴性对照组（G1）相比，将用E7 67-76（LCVQSTHVDI） 进行处理并培养的PBMC施用于小鼠时，肿瘤的生长得以抑制（图10）。此外 可确认，与未进行任何处理的阴性对照组（G1）相比，在将用E7 61-69 （CDSTLRLCV）、E7 67-76（LCVQSTHVDI）、CYQSTHVDI（m3，被置换的 肽3号）和CYVTLRVCL（m7，被置换的肽7号）进行处理并培养的CD8+T 细胞施用于小鼠后，确认肿瘤的大小时，肿瘤的生长得以大大抑制（图11和 12）。由此可确认，用通过利用子宫颈癌小鼠模型的动物实验、通过流式细胞 测定法和细胞毒性实验筛选出的E7 61-69（CDSTLRLCV）、E7 67-76 （LCVQSTHVDI）CYQSTHVDI（m3，被置换的肽3号）和CYVTLRVCL（m7， 被置换的肽7号）肽进行处理并培养的细胞毒性T细胞抑制子宫颈癌的生长 而具有抗癌效果。