一种豆渣和菌糠混合发酵制备凝乳酶的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 101974503 A (43)申请公布日 2011.02.16 CN 101974503 A *CN101974503A* (21)申请号 201010531995.6 (22)申请日 2010.11.04 C12N 9/58(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (71)申请人 福建省农业科学院农业工程技术研 究所 地址 350003 福建省福州市五四路 247 号 (72)发明人 郑恒光 陈君琛 沈恒胜 汤葆莎 (74)专利代理机构 福州元创专利商标代理有限 公司 35100 代理人 蔡学俊 (54) 发明名称 一种豆渣和菌糠混合发酵制备凝乳。

2、酶的方法 (57) 摘要 本发明提供了一种豆渣和菌糠混合发酵制备 凝乳酶的方法， 该方法在湿豆渣中加入菌糠， 然后 接种微小毛霉菌种进行固体发酵， 从发酵产物中 提取凝乳酶。本发明巧妙利用了豆渣和菌糠的各 自特点， 将晒干的食用菌菌糠和湿豆渣混合来调 节固体发酵培养基的水分和干料比例， 这样既可 以防止因湿豆渣水分太高而结团， 省去干燥豆渣 的环节， 又保证了发酵所得酶活力不因为食用菌 菌糠的掺入而降低。 总之， 将湿豆渣和干食用菌菌 糠混合， 替代麦麸进行凝乳酶固体发酵， 可以变废 为宝、 降低凝乳酶的生产成本， 技术简便易行， 省 时经济、 酶活力较高。 (51)Int.Cl. (19)中。

3、华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 CN 101974507 A1/1 页 2 1. 一种豆渣和菌糠混合发酵制备凝乳酶的方法， 其特征在于 ： 在湿豆渣中加入菌糠， 然后接种微小毛霉菌种进行固体发酵， 从发酵产物中提取凝乳酶。 2. 根据权利要求 1 所述的豆渣和菌糠混合发酵制备凝乳酶的方法， 其特征在于 ： 所述 方法具体包括以下步骤 ： （1） 豆渣机械脱水 ： 将含水量为 80 85% 的湿豆渣通过机械压榨脱水， 使其含水量降 至 60% 70% ； （2） 配制培养料 ： 按脱水后的湿豆渣 ： 菌糠 =3 4:1（w:w） 的比例将二者。

4、搅拌混合， 使 固体发酵培养基水分含量为 50 65%（w/w） ； （3） 装料灭菌 ： 将拌混好的培养料装入三角瓶或固体发酵罐中， 控制装料量， 使料层厚 度为 0.2 3cm， 瓶口塞入棉塞或封闭发酵罐进料口， 121灭菌 30 分钟 ； （4） 接种培养 ： 冷却后按常规方法在培养料中接入 5%（v/v） 稀释后的微小毛霉孢子悬 液， 在 25 35和 70% 90% 相对湿度环境下培养 72 96h ； （5） 提取凝乳酶 ： 发酵结束， 将培养料从三角瓶或固体发酵罐中取出， 加入1020倍重 量的 4水， 0 4环境下放置 4 12 小时 ； 过滤除去不溶物， 2000 4000r。

5、pm 离心 2 10 分钟， 收集上清液， 获得凝乳酶粗提取液。 3. 根据权利要求 2 所述的豆渣和菌糠混合发酵制备凝乳酶的方法， 其特征在于 ： 所述 菌糠事先经过充分洗涤然后晒干， 含水量为 7 9%。 4. 根据权利要求 2 所述的豆渣和菌糠混合发酵制备凝乳酶的方法， 其特征在于 ： 所述 微小毛霉孢子悬液是将微小毛霉母种用无菌水分散， 然后用 4 层纱布过滤， 再用无菌水将 滤液中的孢子悬液浓度稀释到 106 107个 /mL。 5. 根据权利要求 2 所述的豆渣和菌糠混合发酵制备凝乳酶的方法， 其特征在于 ： 所述 配制培养料 ： 按脱水后的湿豆渣 ： 菌糠 =3:1 （w:w） 。

6、的比例将二者搅拌混合， 使固体发酵培养 基水分含量为 50%（w/w） 。 权 利 要 求 书 CN 101974503 A CN 101974507 A1/4 页 3 一种豆渣和菌糠混合发酵制备凝乳酶的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种微生物凝乳酶的制备方法， 更具体地涉及一种豆渣和食用菌菌糠 混合发酵制备凝乳酶的方法， 属于利用废弃资源进行固体发酵生产凝乳酶技术领域。 背景技术 0002 豆渣是大豆加工的主要副产物， 多年来被当成低附加值的饲料或肥料处理掉， 有 些甚至被直接抛弃， 不仅经济效益低， 浪费资源， 也造成了环境污染。 利用发酵技术、 酶技术 等现代生物科技手段对豆渣进行。

7、综合利用与加工， 使其营养成分得以全面开发， 解决废弃 豆渣所造成的环境污染， 实现废物的循环利用， 已成为当今研究的热点和趋势。 0003 菌糠是利用秸秆、 木屑等原料进行食用菌代料栽培， 收获后的培养基剩余物， 俗称 食用菌栽培废料、 菌渣或余料 ； 是食用菌菌丝残体及经食用菌酶解， 结构发生质变的粗纤维 等成分的复合物。 食用菌栽培料通常由木屑、 麦麸、 棉籽壳等成分组成。 食用菌栽培结束后， 纤维素、 半纤维素和木质素被大量利用转化成菌丝体， 蛋白质含量得到相应的提高， 一般可 以达到 10% 以上。目前， 一些品种的食用菌采用工厂化栽培， 一般只出 1 潮菇， 因此工厂化 栽培菌糠中。

8、剩余的营养物质比一般农户栽培菌糠丰富， 卫生条件也较好， 由于缺乏菌糠利 用技术， 食用菌菌糠开发利用研究仍处在探索阶段， 包括作为反刍动物饲料、 栽培食用菌、 制作肥料、 转化为沼气等， 食用菌菌糠在酶制剂工业中的应用研究还不多见。 0004 凝乳酶是一种特殊的蛋白水解酶， 它是干酪生产过程中的关键性酶， 其主要功能 是专一性地水解乳中酪蛋白多肽链的 105 106 位苯丙氨酸和甲硫氨酸之间的肽键， 形成 稳定的副酪蛋白及亲水性的糖巨肽， 当酪蛋白被水解到一定程度时， 溶液中的钙离子就可以 通过在酪蛋白胶粒间形成的化学键形成凝块或凝固的乳糖巨肽。凝乳酶属于大宗酶制剂， 其 产量约占全世界酶制。

9、剂总量的 15%， 其产量位居酶制剂工业第二位。传统的凝乳酶来源于小 牛皱胃， 但是单纯依靠宰杀大量的小牛获取凝乳酶仍难以满足世界奶酪产业的需要， 因此必 须依靠微生物凝乳酶替代， 目前微生物凝乳酶份额已经占凝乳酶消费量的一半以上。 0005 理论上， 所有的酸性蛋白酶具有凝乳作用， 但实际上， 仅有少数微生物分泌的蛋白 酶适合用作凝乳酶。理想的微生物应该具备较强的凝乳能力和较小的水解能力， 并且具有 生物安全性。目前， 美国食品和药物管理局 （FDA） 批准用于生产凝乳酶的微生物有 ： 米黑毛 霉、 微小毛霉和粟疫霉。 0006 目前， 微生物凝乳酶发酵培养料通常要采用麦麸、 葡萄糖、 玉米。

10、蛋白浆等原材料。 尽管国内学者鲁绯等曾报道利用雅致放射毛霉 （Actinomucor elegans） 进行豆渣固态发酵 研究， 其蛋白水解酶活力能达600U/g， 但是其研究未涉及微小毛霉 （Mucor pusillus） ， 并且 研究仅限于蛋白水解酶， 未涉及固体发酵生产凝乳酶技术。利用湿豆渣和干食用菌菌糠混 合料培养微小毛霉 （Mucor pusillus） 进行固体发酵制备凝乳酶技术目前尚未见报道。 发明内容 0007 本发明的目的是提供一种豆渣和菌糠混合发酵制备凝乳酶的方法， 不仅为凝乳酶 说 明 书 CN 101974503 A CN 101974507 A2/4 页 4 工业化。

11、生产找到廉价的原料资源， 同时也为豆渣和食用菌菌糠资源的开发利用提供了一条 有效途径。 0008 本发明的技术方案如下 ： 在湿豆渣中加入菌糠， 然后接种微小毛霉菌种进行固体发酵， 从发酵产物中提取凝乳 酶。 0009 所述方法具体包括以下步骤 ： （1） 豆渣机械脱水 ： 将含水量为 80 85% 的湿豆渣通过机械压榨脱水， 使其含水量降 至 60% 70% ； （2） 配制培养料 ： 按脱水后的湿豆渣 ： 菌糠 =3 4:1（w:w） 的比例将二者搅拌混合， 使 固体发酵培养基水分含量为 50 65%（w/w） ； （3） 装料灭菌 ： 将拌混好的培养料装入三角瓶或固体发酵罐中， 控制装料。

12、量， 使料层厚 度为 0.2 3cm， 瓶口塞入棉塞或封闭发酵罐进料口， 121灭菌 30 分钟 ； （4） 接种培养 ： 冷却后按常规方法在培养料中接入 5%（v/v） 稀释后的微小毛霉孢子悬 液， 在 25 35和 70% 90% 相对湿度环境下培养 72 96h ； （5） 提取凝乳酶 ： 发酵结束， 将培养料从三角瓶或固体发酵罐中取出， 加入1020倍重 量的 4水， 0 4环境下放置 4 12 小时 ； 过滤除去不溶物， 2000 4000rpm 离心 2 10 分钟， 收集上清液， 获得凝乳酶粗提取液。 其中所述菌糠事先经过充分洗涤然后晒干， 含水量为 7 9%。 所述微小毛霉孢子。

13、悬液是将微小毛霉母种用无菌水分散， 然后用 4 层纱布过滤， 再用 无菌水将滤液中的孢子悬液浓度稀释到 106 107个 /mL。 0010 所述配制培养料 ： 按脱水后的湿豆渣 ： 菌糠 =3:1 （w:w） 的比例将二者搅拌混合， 使 固体发酵培养基水分含量为 50%（w/w） 。 0011 微小毛霉 (Mucor pusillus) 菌种由中国普通微生物菌种保藏管理中心 （简称 CGMCC） 购得， 保藏编号为 CGMCC No.3.3445， 现保存于中国科学院微生物研究所。 0012 以湿豆渣为单一培养料进行固体发酵时， 由于湿豆渣含水量大， 容易成团， 难以形 成类似于麦麸的松散结。

14、构， 影响培养料散热和气体交换， 所以发酵所得凝乳酶的活力偏低。 为解决这一难题， 本发明在湿豆渣培养料中加入可增加培养料透气性干燥的食用菌菌糠， 既调节了培养基水分， 增加了培养料的透气性， 同时又可利用菌糠的营养物质进行发酵， 其 发酵效果接近或超过对照麦麸发酵。 固体发酵工艺具有加工设备简单， 投资少， 不易感染杂 菌的优点， 适合在中小企业中推广使用。 0013 固体发酵步骤 ： 将湿豆渣和食用菌菌糠以一定比例混合， 将培养料装入三角瓶或 固体发酵罐中， 控制装料量， 使料层厚度为 0.2 3cm， 瓶口塞入棉塞， 或封闭发酵罐进料 口， 121灭菌 30 分钟。冷却后在培养料中接入微。

15、小毛霉菌种， 在 25 35、 70% 90% 相 对湿度环境下培养 72 96h。发酵结束后， 将培养料从发酵容器中取出， 加入 10 20 倍重 量的水， 0 10低温浸泡 4 12 小时， 过滤后得到酶粗提取液。还可以通过超滤、 盐析、 冷冻干燥等步骤将凝乳酶粗提取液精制成酶浓缩液或冷冻干燥粉末。 0014 本发明的显著优点 ： 从豆制品加工厂出来的湿豆渣含水量较高， 即便是通过机械压榨脱水水分含量也难以 达到固体发酵所需的 50% 的水分含量， 并且豆渣水分含量较大时容易结团， 影响固体发酵 说 明 书 CN 101974503 A CN 101974507 A3/4 页 5 效果。若。

16、采用通过干燥降低豆渣水分， 干燥过程不仅耗能而且容易变质发臭。与之相反， 食 用菌菌糠容易干燥且不易变质， 可以通过日晒干燥。本发明巧妙利用了豆渣和菌糠的各自 特点， 将晒干的食用菌菌糠和湿豆渣混合来调节固体发酵培养基的水分和干料比例， 这样 既可以防止因湿豆渣水分太高而结团， 省去干燥豆渣的环节， 又保证了发酵所得酶活力不 因为食用菌菌糠的掺入而降低。 总之， 将湿豆渣和干食用菌菌糠混合， 替代麦麸进行凝乳酶 固体发酵， 可以变废为宝、 降低凝乳酶的生产成本， 技术简便易行， 省时经济、 酶活力较高。 具体实施方式 0015 （1） 豆渣机械脱水 ： 将含水量为 80 85% 的湿豆渣通过机。

17、械压榨脱水， 使其含水 量降至 60% 70% ； （2） 配制培养料 ： 按脱水后的湿豆渣 ： 菌糠 =3 4:1（w:w） 的比例将二者搅拌混合， 使 固体发酵培养基水分含量为 50 65%（w/w） ； 菌糠事先经过充分洗涤然后晒干， 含水量为 7 9% ； （3） 装料灭菌 ： 将拌混好的培养料装入三角瓶或固体发酵罐中， 控制装料量， 使料层厚 度为 0.2 3cm， 瓶口塞入棉塞或封闭发酵罐进料口， 121灭菌 30 分钟 ； （4） 接种培养 ： 冷却后按常规方法在培养料中接入 5%（v/v） 稀释后的微小毛霉孢子悬 液 （所述微小毛霉孢子悬液是将微小毛霉母种用无菌水分散， 然后用。

18、 4 层纱布过滤， 再用无 菌水将滤液中的孢子悬液浓度稀释到 106 107个 /mL） ， 在 25 35和 70% 90% 相对湿 度环境下培养 72 96h ； （5） 提取凝乳酶 ： 发酵结束， 将培养料从三角瓶或固体发酵罐中取出， 加入1020倍重 量的 4水， 0 4环境下放置 4 12 小时 ； 过滤除去不溶物， 2000 4000rpm 离心 2 10 分钟， 收集上清液， 获得凝乳酶粗提取液。 凝乳酶活力通常采用 Arima 方法， 即用 0.01mol L CaC12溶液配制 10脱脂奶粉 液， 取 5mL 10 % 脱脂奶粉液于 35保温 10min， 加入 5mL 适当。

19、稀释的酶液 （酶液事先也应于 35保温） ， 立即摇匀， 开始计时 ( 凝乳时间一般控制在 40s-90s。)， 并把试管倾斜 45以 上， 沿试管轴方向旋转， 观察管壁上开始出现凝集小颗粒为终点， 记录凝乳时间。在上述条 件下， 40min 凝 l mL 10% 脱脂奶粉的酶量定义为一个 Soxhlet 单位 (SU)。 0016 酶活力 (SU)=( 供试乳液体积凝乳酶体积 )D2400 t 式中 ： D 为酶液稀释倍数 ； t 为反应时间。 0017 实施例 1 将湿豆渣 （含水量为 80 85%） 通过机械压榨脱水， 使其含水量降至 65% 左右， 再以重 量比 3:1 比例拌和食用菌。

20、菌糠 （事先经过充分洗涤然后晒干， 含水量 8%） ， 使固体发酵培养 基水分含量为 50%（w/w） 并且豆渣和菌糠干基重量比约为 1 ： 1。将拌和好的培养基装入三 角瓶或固体发酵罐中， 控制装料量大小使料层厚度不大于 3cm。瓶口塞入棉塞， 或封闭发酵 罐进料口， 121灭菌30分钟， 冷却后在培养料中以5%体积接入微小毛霉孢子悬液 （浓度为 107个 /mL） ， 在 35和 70% 相对湿度环境下培养 72h。发酵结束， 将培养料从发酵容器中取 出， 加入10倍重量的4水， 4环境下放置12小时， 过滤除去不溶物， 将滤液4000rpm离心 2 分钟， 收集上清液， 获得凝乳酶粗提取。

21、液。 0018 经检测， 含水量 50% 的湿豆渣固体发酵酶活为 2295 U/g， 对照麦麸固体发酵凝乳 说 明 书 CN 101974503 A CN 101974507 A4/4 页 6 酶产率 9081 U/g， 豆渣和菌糠混合固体发酵凝乳酶的活力为 9412 U/g。 0019 实施例 2 本发明所述的豆渣和菌糠混合发酵制备凝乳酶的方法， 其特征在于 ： 所述方法具体包 括以下步骤 ： （1） 豆渣机械脱水 ： 将含水量为8085%的湿豆渣通过机械压榨脱水， 使其含水量 降至 60% 70% ； （2） 配制培养料 ： 按脱水后的湿豆渣 ： 菌糠 =4:1（w:w） 的比例将二者搅拌。

22、混合， 使固体 发酵培养基水分含量为 65% （w/w） ， 且豆渣和菌糠干基重量比约为 1: 0.8 ； 菌糠事先经过充 分洗涤然后晒干， 含水量为 7% ； （3） 装料灭菌 ： 将拌混好的培养料装入三角瓶中， 控制装料量， 使料层厚度为 0.2cm， 瓶 口塞入棉塞， 121灭菌 30 分钟 ； （4） 接种培养 ： 冷却后按常规方法在培养料中接入 5%（v/v） 稀释后的微小毛霉孢子悬 液 （浓度为 106个 /mL） ， 在 25和 90% 相对湿度环境下培养 96h ； （5） 提取凝乳酶 ： 发酵结束， 将培养料从三角瓶或固体发酵罐中取出， 加入 20 倍重量的 4水， 0环境下放置 4 小时 ； 过滤除去不溶物， 2000rpm 离心 10 分钟， 收集上清液， 获得凝 乳酶粗提取液。 经检测， 凝乳酶粗提液的酶活力为 548 U/ml。 说 明 书 CN 101974503 A 。