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1、(10)授权公告号 CN 101831444 B (45)授权公告日 2012.01.11 CN 101831444 B *CN101831444B* (21)申请号 201010163607.3 (22)申请日 2010.04.30 C12N 15/52(2006.01) C12N 15/113(2010.01) A01N 61/00(2006.01) A01P 7/04(2006.01) (73)专利权人 山西大学 地址 030006 山西省太原市小店区坞城路 92 号 (72)发明人 张建珍 刘晓健 马恩波 杨美玲 郭亚平 (74)专利代理机构 山西五维专利事务所 ( 有限 公司 ) 1。
2、4105 代理人 杨耀田 CN 101343637 A,2009.01.14, 全文 . US 5124149 A,1992.06.23, 全文 . CN 101370940 A,2009.02.18, 全文 . (54) 发明名称 昆虫几丁质合成酶 1 基因片段及其 dsRNA 和 应用 (57) 摘要 本发明提供一种昆虫几丁质合成酶 1 的基因 片段及其 dsRNA 的应用， 通过对中华稻蝗几丁质 合成酶 1 的克隆和测序， 得到核苷酸序列为 SEQ ID NO ： 1 的几丁质合成酶基因 1， 从中选出序列 为 SEQ ID NO ： 2 的几丁质合成酶基因片段， 用于 dsRNA 的合。
3、成。将上述 dsRNA 注入昆虫的体腔后， 昆虫因蜕皮困难死亡。为安全无公害的害虫防治 方法的研制提供新的途径。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 高宇 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 3 页 序列表 2 页 附图 1 页 CN 101831444 B1/1 页 2 1. 一种中华稻蝗几丁质合成酶 1 基因片段 2， 其核苷酸序列是 SEQ ID NO ： 2。 2. 如权利要求 1 所述的一种中华稻蝗几丁质合成酶 1 基因片段 2 合成的 dsRNA。 3.如权利要求2所述的一种中华稻蝗几丁质合成酶1基因片段2合成的dsRN。
4、A在致死 中华稻蝗中的应用。 权 利 要 求 书 CN 101831444 B1/3 页 3 昆虫几丁质合成酶 1 基因片段及其 dsRNA 和应用 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域。具体涉及昆虫几丁质合成酶 1 基因片段及其 dsRNA 和 dsRNA 致死害虫中的应用。 背景技术 0002 农业害虫为害是我国农业产量的重要制约因素， 长期施用化学杀虫剂导致一系列 问题 ： 1) 昆虫出现抗药性， 用药剂量加大， 防治成本提高 ； 2) 农药残留导致环境污染严重 ； 3) 对非靶标生物有较大影响。现有生物杀虫剂在害虫防治中应用较广， 但杀虫时间较长且 效果缓慢。 0003 RNA 。
5、干扰 (RNAi) 是一种由双链 RNA 分子引起的特异性转录后基因沉默现象， 2006 年获诺贝尔奖。RNAi 的发现不仅为基因的功能研究提供了方法上的突破， 同时也为人类疾 病治疗和作物害虫防治开辟了新的途径。2007 年，“Nature Biotechnology” 杂志先后两篇 论文报道了施用表达靶向害虫重要致死基因 V-ATPase A， CYP6AE14 and GST1 的 dsRNA 转 基因植物作为一种控制病虫害的新方法 (Baum et al， 2007 ； Mao et al， 2007)。2008 年， Price 和 Gatehouse 提出了基于 RNAi 的害虫防。
6、治策略。基于 RNA 干扰技术的害虫防治具有 如下优势 ： 1) 选择对害虫专一的基因进行干扰， 对高等动物和人类是安全的 ； 2) 抗虫具有 专一性， 对非靶标生物无杀伤作用 ； 3) 对环境无毒无害。 0004 研究表明， RNA 干扰技术能够有效控制特殊的植物害虫， 在害虫防治领域具有重要 的发展前景。而实现基于 RNAi 进行害虫有效控制的关键是筛选对昆虫高效致死的 dsRNA。 0005 几丁质合成和代谢是昆虫等节肢动物特有的生物学现象， 由于人类和其它高等动 物没有几丁质， 因此昆虫几丁质合成系统已被公认为新型杀虫剂作用的靶标。几丁质合 成酶在昆虫几丁质合成的最后一步起着关键作用，。
7、 采用 RNA 干扰技术， 开展几丁质合成酶 dsRNA 在害虫防治中的应用具有重要意义。 发明内容 0006 本发明的目的是提供一种昆虫几丁质合成酶 1 基因片段， 由基因片段合成的 dsRNA 和 dsRNA 在致死害虫中的应用。 0007 本发明提供的一种昆虫几丁质合成酶 1 基因片段 1， 其核苷酸序列是 SEQ ID NO ： 1。是通过设计昆虫几丁质合成酶的简并引物后， PCR 扩增获得， 命名为 OcCHS1， 其长度为 312bp， 编码 104 个氨基酸。 0008 本发明提供的一种昆虫几丁质合成酶 1 基因片段 2， 其核苷酸序列是 SEQ ID NO ： 2， 是根据 S。
8、EQ ID NO ： 1 设计上游引物 SEQ ID NO ： 3 和下游引物 SEQ ID NO ： 4， 通过 PCR 扩 增获得。进一步利用相关试剂盒合成 dsRNA。 0009 dsRNA 在致死害虫中的应用 ： 注射 dsRNA 到昆虫体腔， 结果表明 ： dsRNA 可以特异 性地沉默几丁质合成酶 1 基因的 mRNA 表达， 昆虫因蜕皮困难死亡。 说 明 书 CN 101831444 B2/3 页 4 附图说明 0010 图 1 ： 3 龄中华稻蝗若虫注射 dsRNA 后对昆虫生长发育的影响。注射 dsRNA 的实验 组出现蜕皮困难死亡的表型 (1 为注射 dsGFP 的对照组，。
9、 2 注射 dsRNA 的实验组 )。 具体实施方式 0011 实施例 1 ： 中华稻蝗几丁质合成酶 1 基因片段 1 的获得 0012 1)PCR 引物的设计 0013 根据已知昆虫几丁质合成酶的氨基酸保守序列， 设计了如下简并性引物 ： 上游引 物 ： CHS1F 5 -GAYGGNGAYATHGAYTT-3， 下游引物 ： CHS1R 5 -TCYTCNCCYTGRTCRTA-3； 所 有引物均由上海英潍捷基生物有限公司合成。 0014 2) 中华稻蝗总 RNA 的获得 0015 选取大小一致雌雄各半中华稻蝗 5 龄若虫的体表， 四头一组， 冷冻于液氮中， 待提 取 RNA， 提取 RN。
10、A 的具体操作步骤参照 TaKaRa Trizol 试剂盒。 0016 3) 中华稻蝗第一链 cDNA 合成 0017 第一链 cDNA 合成步骤参照 SMARTTM RACE cDNA Amplification 试剂盒。 0018 4)PCR 扩增 0019 以上述第一链 cDNA 为模板， 根据 Taq 多聚酶 (TIANGEN) 说明书进行 PCR 扩增， 将 所扩增的片段进一步克隆、 测序。 0020 5) 序列分析 0021 利用 Expasy 网站中相关在线软件和 GENEDOC、 基因探索者等软件分析所得序列， 在NCBI网站中使用BLAST功能进行序列同源性比对， 确定所获得。
11、的基因片段为中华稻蝗几 丁质合成酶 1 基因片段 1。 0022 实施例 2 ： 中华稻蝗几丁质合成酶 1 基因片段 2 的获得 0023 根据实施例 1 获得的中华稻蝗几丁质合成酶 1 基因片段 1 的核苷酸序列， 采用 primerpremier5.0软件设计特异性的引物， 上游引物序列为SEQ ID NO ： 3， 下游引物序列为 SEQ IDNO ： 4， 所有引物均由上海英潍捷基生物有限公司合成。选取大小一致雌雄各半中华 稻蝗 5 龄若虫， 四头一组， 冷冻于液氮中， 待提取 RNA， 具体操作步骤参照 TaKaRa Trizol 试 剂盒。M-MLV 反转录酶将所提 RNA 反转录。
12、成第一链 cDNA， 以此为模板， PCR 扩增获得几丁质 合成酶基因片段，SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega) 试剂盒进行纯化。 0024 实施例 3 ： 中华稻蝗几丁质合成酶 1 基因片段 2 的 dsRNA 的获得 0025 用实施例 2 获得的几丁质合成酶 1 基因片段 2， 按照 T7RiboMAXTM Express RNAi System(Promega) 试剂盒说明， 体外转录合成 dsRNA。得到的 dsRNA 用 1.5的琼脂糖凝胶 电泳检测其单一性， 用酶标仪 (Molecular Devices SpectraMax 190， 。
13、Menlo Park， CA， USA) 将其定量至终浓度为 1g/L。保存至 -70备用。 0026 实施例 4 ： 几丁质合成酶 1 基因片段 2 的 dsRNA 致死中华稻蝗实验 0027 1) 中华稻蝗几丁质合成酶 1 基因片段 2 的 dsRNA 注射 0028 选取 3 龄第四天大小均一、 健康状况一致的若虫用于注射上述合成的 dsRNA。 25l 规格微量注射器用于注射， 注射时不可用力过大， 顺着血液流动的方向， 侧腹部第 2 至 3 腹节的连接处作为注射点， 要避开气门。注射 dsRNA 的量为 3g， 并设置 dsGFP(3g) 说 明 书 CN 101831444 B3/。
14、3 页 5 的对照组， 实验组和对照组各 25 头。注射完毕后， 将虫子用 1L 的烧杯至于人工气候箱中进 行饲养 ( 光照黑暗时间 14h 10h， 温度 302， 湿度 60 )， 给以新鲜小麦幼苗和适 当的光照， 喷水保持湿度。 0029 2) 注入 dsRNA 后中华稻蝗表型的观察 0030 若虫注射完毕后继续饲养， 并及时地观察。注射 dsRNA 中华稻蝗实验组有部分若 虫因蜕皮困难而死亡。 0031 3) 注入 dsRNA 后中华稻蝗死亡情况的观察 0032 注射 dsRNA 的中华稻蝗实验组死亡率为 80。这与注射 dsGFP 的对照组 ( 死亡率 为 0 ) 相比， 致死效果明。
15、显。 说 明 书 CN 101831444 B1/2 页 6 SEQUENCE LISTING 山西大学 昆虫几丁质合成酶 1 基因片段及其 dsRNA 和应用 4 PatentIn version 3.5 1 313 DNA Oxya chinensis(Thunberg) gene (1).(312) 1 gacggggaca tagacttcca acctcatgct gttcatctat tggttcactt gatgaagaag 60 aatagaaatc tgggagcagc atgtggccgc attcaccctg ttggttctgg acccatggtg 120 tggta。
16、tcaaa tgttcgagta tgccattgga cattggctgc agaaagcaac agaacatatg 180 atcggttgtg tcctctgtag ccctggatgt ttctctctct tcagagggaa gtcacttatg 240 gatgattgtg tgatgaacaa atatacaaca cgatcagagg aagctcgaca ctatgtgcaa 300 tacgaccagg gc 312 2 345 DNA Oxya chinensis(Thunberg) gene (1).(345) 2 taatacgact cactataggg gga。
17、catagac ttccaacctc atgctgttca tctattggtt 60 cacttgatga agaagaatag aaatctggga gcagcatgtg gccgcattca ccctgttggt 120 tctggaccca tggtgtggta tcaaatgttc gagtatgcca ttggacattg gctgcagaaa 180 gcaacagaac atatgatcgg ttgtgtcctc tgtagccctg gatgtttctc tctcttcaga 240 gggaagtcac ttatggatga ttgtgtgatg aacaaatata ca。
18、acacgatc agaggaagct 300 cgacactatg tgcaatacga ccaggcccta tagtgagtcg tatta 345 3 40 序 列 表 CN 101831444 B2/2 页 7 DNA 0 xya chinensis(Thunberg) gene (1).(40) 3 taatacgact cactataggg ggacatagac ttccaacctc 40 4 40 DNA 0 xya chinensis(Thunberg) gene (1).(40) 4 taatacgact cactataggg cctggtcgta ttgcacatag 40 序 列 表 CN 101831444 B1/1 页 8 图 1 说 明 书 附 图 。