技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种CYP2C9和VKORC1基因SNP检测特异性引物、液相芯片及方法。
背景技术
华法林(Warfarin)是新一代抗凝剂，于2000年2月获美国FDA正式批准上市。其作用机制为竞争性对抗维生素K的作用，抑制肝细胞中凝血因子的合成，降低凝血酶诱导的血小板聚集反应，从而具有抗凝和抗血小板聚集功能。作为第一个口服抗凝药，华法林已经统治术后抗血栓、中风以及房颤的市场近十年之久。在美国，该药的处方量每年超过200万。
但是华法林的药理作用易受多种因素影响，个体差异大，治疗窗窄，半数有效量与半数致死量的INR水平仅仅相差1倍左右，即使很小的剂量变化也可能导致出血等不良反应，因而剂量调整十分重要。研究证明CYP2C9和VKORC1基因突变导致35-50％的患者对华法林反应存在个体差异，他们需要更低的起始剂量。2007年8月，美国FDA批准更新华法林的产品说明书，要求在警示信息中标明服用者的遗传差异将影响其对该药物的反应，同时提醒医生如果患者存在这两个基因的变异，在处方华法林时应该采用较低的初始剂量。因此，检测患者这两个基因的多态性情况能科学指导华法林的临床使用。
CYP2C9是华法林的主要代谢酶，它的4种常见等位基因型CYP2C9*2、CYP2C9*3、CYP2C9*5和CYP2C9*6会导致该酶的功能减弱，从而使药物活性成分在血液中停留时间延长。其中等位基因型CYP2C9*3在中国人群中的分布频率约是2.5％。而VKORC1是华法林的主要作用靶点，其SNP位点G-1639A、C1173T和G3730A变异会显著增加患者对华法林的敏感性。
目前国内外已有同时检测华法林疗效相关的两个基因-CYP2C9和VKORC1基因多态性的产品上市，如Quest Diagnosis，Paragon DX和台湾定势生医科技公司等。目前的产品主要建立在传统固相芯片的基础上，价格昂贵，而且敏感度不高，检测结果的可重复性差。而其它以PCR为基础的SNPs检测技术，如直接测序法，半定量PCR技术，PCR-单链构象多态性分析(SSCP)检测等，存在灵敏度低，样品易污染、假阳性率高的缺点。普通PCR方法和荧光定量PCR由于检测通量的局限性不能满足临床的需要，而聚合酶链式反应-限制性片段长度多态(PCR-RFLP)分析技术和基于TaqMan技术的等位基因差异分析法一次只能进行一种突变的检测，耗时费力。
基于芯片的原理，美国Luminex公司开发出了以微球为载体的悬浮液相芯片技术。该项技术利用聚苯乙烯微球作为反应的载体，以荧光检测仪作为检测平台，对核酸和蛋白质等生物大分子进行高通量的多指标并行检测。在微球的制造过程中，掺入不同比例的红光及红外光染色剂，从而形成多至100种不同颜色编码的微球。不同的微球共价结合了针对不同待检测物的蛋白质或核酸分子作为探针分子，报告分子以生物素标记，并用高灵敏的荧光染料染色。这些微球与待测物、报告分子、荧光标记物就形成完整的微球检测体系用于Luminex系统的读取。Luminex阅读系统分别激发红色激光和绿色激光用于微球体系的检测，其中红色激光检测微球表面红色分类荧光的强度，并根据微球中不同色彩而编号分类，从而确定反应的类型；绿色激光检测样本中荧光标记物的荧光强度，再通过机器与计算机自动统计分析激光所检测到微球种类、数量，从而判定待测样本多种目标测试物各自的浓度。因此，液相芯片技术既满足了高通量检测的要求，同时具备了快速准确，灵敏度高，特异性好，结果重复性好等优点。我们采用xTAG液相芯片技术可以同时检测多种SNPs，实现高通量快速简便化操作，大大提高了检测效率，在同类检测技术中处于领先地位。
发明内容
本发明的目的之一是提供CYP2C9和VKORC1基因SNP检测液相芯片。该液相芯片可用于检测CYP2C9基因四种常见基因型CYP2C9*2、CYP2C9*3、CYP2C9*5和CYP2C9*6的野生型和突变型，以及VKORC1基因的正常基因型和G-1639A、C1173T和G3730A等位基因的变异。
一种CYP2C9和VKORC1基因SNP检测液相芯片，包括有：
(1)针对每种型别的SNP位点分别设计的野生型和突变型ASPE引物对，每种ASPE引物对由5’端的tag序列和3’端的针对目的基因SNP位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列分别选自：针对CYP2C9基因的SEQ ID NO.15及SEQID NO.16、SEQ ID NO.17及SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19及SEQ ID NO.20、和SEQ ID NO.21及SEQ ID NO.22中的一对或多对；和/或针对VKORC1基因的SEQID NO.23及SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25及SEQ ID NO.26、和SEQ ID NO.27及SEQ ID NO.28中的一对或多对；所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.14中的序列；
(2)分别包被有特异的anti-tag序列的微球，所述anti-tag序列能相应地与(1)中所选tag序列互补配对，所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.29～SEQ ID NO.42中的序列；
(3)用于扩增具有CYP2C9*2、CYP2C9*3、CYP2C9*5和CYP2C9*6一个或多个SNP位点的CYP2C9基因目标序列的引物，和/或用于扩增具有G-1639A、C1173T和G3730A一个或多个SNP位点的VKORC1基因目标序列的引物。
优选地，所述野生型及突变型ASPE引物对选自：针对CYP2C9*2SNP位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.15组成的序列及由SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.16组成的序列；针对CYP2C9*3 SNP位点的由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.17组成的序列及由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.18组成的序列；针对CYP2C9*5 SNP位点的由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.19组成的序列及由SEQ ID NO.6和SEQ IDNO.20组成的序列；和针对CYP2C9*6SNP位点的由SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.21组成的序列及由SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.22组成的序列中的一对或一对以上；和/或针对VKORC1基因的G-1639A SNP位点的由SEQ ID NO.9和SEQID NO.23组成的序列及由SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.24组成的序列；针对VKORC1基因的C1173T SNP位点的由SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.25组成的序列及由SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.26组成的序列；和针对VKORC1基因的G3730A SNP位点的由SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.27组成的序列及由SEQ IDNO.14和SEQ ID NO.28组成的序列中的一对或一对以上。
优选地，所述用于扩增的引物包括：针对CYP2C9*2SNP位点的SEQ IDNO.43和SEQ ID NO.44，针对CYP2C9*6SNP位点的SEQ ID NO.45和SEQ IDNO.46，和针对CYP2C9*3/CYP2C9*5SNP位点的SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48中的一对或一对以上；和/或针对VKORC1基因的G-1639ASNP位点的SEQ IDNO.49和SEQ ID NO.50，针对VKORC1基因的C1173T SNP位点的SEQ ID NO.51和SEQ ID NO.52；和针对VKORC1基因的G3730A SNP位点的SEQ ID NO.53和SEQ ID NO.54中的序列一对或一对以上。
优选地，(2)中所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列，所述间隔臂更优选为5-10T。
本发明的另一目的是提供CYP2C9和VKORC1基因SNP检测的特异性引物序列，该引物序列特异性强，能准确区分各种基因型，并且多位点同步检测不存在交叉反应率。
所述用于CYP2C9、VKORC1基因SNP检测的特异性引物序列，包括：针对CYP2C9*2SNP位点的野生型和突变型的SEQ ID NO.15及SEQ ID NO.16；针对CYP2C9*3SNP位点的野生型和突变型的SEQ ID NO.17及SEQ ID NO.18；针对CYP2C9*5SNP位点的野生型和突变型的SEQ ID NO.19及SEQ ID NO.20；和/或针对CYP2C9*6SNP位点的野生型和突变型的SEQ IDNO.21及SEQ IDNO.22；和/或针对VKORC1基因G-1639ASNP位点的野生型和突变型的SEQ ID NO.23及SEQ ID NO.24；针对VKORC1基因C1173T SNP位点的野生型和突变型的SEQ IDNO.25及SEQ ID NO.26；针对VKORC1基因G3730A SNP位点的野生型和突变型的SEQ ID NO.27及SEQ ID NO.28。
本发明的另一目的是提供使用上述液相芯片对CYP2C9和VKORC1基因SNP进行检测的方法。
一种使用上述液相芯片对CYP2C9和VKORC1基因SNP检测的方法，主要包括以下步骤：
(一)PCR扩增待测样品DNA；
(二)PCR反应产物用ExoSAP-IT试剂盒进行酶切处理；
(三)用所述ASPE引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记；
(四)将对应ASPE引物的包被有特异的anti-tag序列的微球与上述延伸反应后的产物进行杂交反应；
(五)杂交反应后的产物与链霉亲和素-藻红蛋白进行反应；
(六)通过荧光检测仪检测。
本发明的主要优点在于：
1.本发明所提供的检测方法与测序法的吻合率高达100％。所制备的CYP2C9和VKORC1基因SNP检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应，tag标签序列、anti-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE引物的结合，能够避免交叉反应，实现多个SNP位点的并行检测。
2.本发明设计的ASPE型特异性引物具有非常好的特异性，能准确区分各种型别的基因型。
3.本发明的检测方法步骤简单，七种SNPs检测可通过一步多重PCR即可完成六个具有SNP位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。
4.本发明所提供的检测方法所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合临床需要。
5.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
具体实施方式
实施例1 CYP2C9和VKORC1基因SNP检测液相芯片，主要包括有：
一、ASPE引物
针对CYP2C9的四种常见SNP位点和VKORC1基因的三种常见SNP位点分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“Tag+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示：
表1 ASPE引物序列(Tag+特异性引物序列)
每条ASPE引物包括两个部分，5’端为针对相应微球上anti-tag序列的特异性tag序列，3’端为突变型或野生型特异的引物片段(如上述表1所示)。所有ASPE引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。
二、anti-tag序列包被的微球
根据所设计的ASPE特异性引物片段，选择tag序列，最大限度地减少各微球的anti-tag序列之间以及tag与ASPE特异性引物片段可能形成的二级结构，选择的十四种微球编号与微球上相应的anti-tag序列如表2所示：
表2 微球编号与微球上相应的anti-tag序列
选择的十四种微球购自美国Luminex公司，将anti-tag序列包被与微球上。anti-tag序列与微球之间连接有5-10个T的间隔臂序，即在每个anti-tag序列前加上一段5-10个T的间隔臂序列，anti-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的anti-tag序列用灭菌ddH2O配成100nmol/ml的贮存液。所述间隔臂为用于将anti-tag与微球表面间隔开来或是将anti-tag置于亲水性环境中的序列。通过在anti-tag序列与微球之间设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n间隔臂(n≥3)，如(CH2)12、(CH2)18等。另外，如果存在poly(dA)干扰，还可以用poly(TTG)作为间隔臂。本发明间隔臂优选为5-10个T，微球包被的过程如下：
分别取5×106个上述编号的羧基化的微球(购自Luminex公司)悬浮于50ul0.1mol/L的MES溶液中(pH4.5)，加入10ul合成的anti-tag分子(100nmol/ml)。配制10ng/ml的EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl-N-ethylcarbodiimide)(购自PierceChemical公司)工作液。往微球悬液中加入2.5ul的EDC工作液，恒温孵育30分钟，再加入2.5ul的EDC工作液，再恒温孵育30分钟。反应结束后，用0.02％的Tween-20洗涤一次，再用0.1％的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有anti-tag序列的微球重悬于100ul的Tris-EDTA溶液[10mmol/L Tris(pH8.0)，1mmol/L EDTA中，2-8℃避光保存。
三、扩增出具有突变位点的目标序列的引物
CYP2C9基因的四种常见的SNP位点为CYP2C9*2、CYP2C9*3、CYP2C9*5和CYP2C9*6，VKORC1基因的三种常见的SNP位点为G-1639A、C1173T和G3730A。它们的多态性位点在不同的外显子上。CYP2C9*2为C430T突变，发生在外显子3；CYP2C9*3为A1075C突变，CYP2C9*5为C1080G突变，都发生在外显子7；CYP2C9*6为818delA，发生在外显子5。而VKORC1基因G-1639A发生在启动子；C1173T发生在内含子1；G3730A发生在3’UTR。利用Primer5.0设计六对引物(见表3)，分别扩增出六条具有SNP位点的目标序列。
表3 扩增出具有SNP位点的目标序列的引物
所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。
实施例2 运用CYP2C9和VKORC1基因SNP检测液相芯片对临床样本的检测所述各种溶液的配方如下：
50mM的MES缓冲液(pH5.0)配方(250ml)：
试剂 来源 终浓度 每250ml的用量 MES(2[N-Morpholino] ethanesulfonic acid) Sigma M-2933 0.05M 2.44g 5MNaOH Fisher SS256-500 --- 5滴
2×Tm杂交缓冲液
试剂 来源 终浓度 每250ml的用量 1MTris-HCl，pH8.0 SigmaT3038 0.2M 50ml 5MNaCl Sigma S5150 0.4M 20ml Triton X-100 Sigma T8787 0.16％ 0.4ml
过滤后贮存于4℃。
ExoSAP-IT试剂盒购自美国USB公司。
生物素标记的dCTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
一、样本的DNA提取：
参照AxyPrep全血基因组小量提取试剂盒说明，得到待检测的DNA。
二、待测样品的PCR扩增
利用Primer5.0设计六对引物，多重PCR一步扩增出CYP2C9的外显子3、外显子5和外显子7，以及VKORC1的启动子、内含子1和3’UTR共六条具有突变位点的目标序列，产物大小分别为306bp、430bp、399bp、560bp、128bp和138bp。引物序列(SEQ NO.43-54)见上述表3所示。
首先配制多重PCR引物工作液：分别各取SEQ NO.43-54的引物贮存液100ul于1.5ml微量离心管中，混合均匀即为多重PCR引物工作液。多重PCR反应体系如下：
10×缓冲液(含Mg2+) 5ul
dNTP(各2.5mmol/L) 4ul
Taq酶(5U/ul) 0.5ul
多重PCR引物工作液(各8.3pmol/mL) 12ul
模板DNA(10ng/ul) 1ul
ddH2O 27.5ul
共 50ul
PCR扩增程序为：95℃3min；94℃20s，56℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min；4℃保存备用。
三、PCR产物的酶切处理
参照ExoSAP-IT试剂盒说明，详细步骤如下：
1.取7.5ul PCR反应后的产物，加入3ul ExoSAP-IT酶；
2.37℃孵育15min。80℃孵育15min，使多余的酶灭活。酶切处理后的产物直接用于后续的ASPE引物延伸反应。
四、位点特异的引物延伸反应(ASPE)
利用上述设计的位点特异性引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。
首先配制混合的ASPE引物工作液：分别各取C430T-w、C430T-m、A1075C-w、A1075C-m、C1080G-w、C1080G-m、818delA-w、818delA-m、G-1639A-w、G-1639A-m、C1173T-w、C1173T-m、G3730A-w、G3730A-m相应的ASPE引物贮存液10ul于1.5ml微量离心管中，加入10mmol/L Tris Buffer补至200ul，混合均匀即为ASPE混合引物工作液。ASPE反应的体系如下：
10×缓冲液 2ul
MgCl2(50mmol/L) 0.5ul
Biotin-dCTP(400umol/L) 0.25ul
dATP、dGTP、dTTP混合液(各100umol/L) 1ul
Tsp酶(5U/ul) 0.25ul
混合的ASPE引物工作液(各500nmol/L) 1ul
酶切处理的PCR扩增产物 5ul
ddH2O 10ul
共 20ul
PCR程序为：96℃2min；94℃30s，58℃1min，72℃2min，30个循环；4℃保存备用。
五、杂交反应
1.根据设计的ASPE引物，选择相应的最优的十四种微球(微球浓度均为2.5×105个/ml)。每种微球分别带有不同颜色编码，同时每种微球表面分别连接有一段24bp的特异性的寡核苷酸序列(anti-tag)，这些anti-tag序列能分别与对应的ASPE引物5’端的tag序列特异结合；本实施例每组样品检测中都分别选择微球号为35、16、33、18、56、62、45、48、85、47、21、58、75、86共十四种微球；
2.分别取1ul每种编号的微球于1.5ml的微量离心管中；
3.微球于≥10000g离心1-2min；
4.弃去上清，微球重悬于100ul的2×Tm杂交缓冲液中，涡旋混匀；
5.取25ul上述微球悬液于96孔滤板相应的孔中，对照孔加25ul的ddH2O；
6.取5-25ul的ASPE反应液于相应的孔中，用ddH2O补足至50ul；
7.用锡箔纸包住96孔板以避光，95℃60s，37℃15min孵育杂交；
8.杂交后的微球于≥3000g离心2-5min；
9.去上清，将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中；
10.微球于≥3000g离心2-5min；
11将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中，加入15ul浓度为10ug/ml的链酶亲和素-藻红蛋白(SA-PE)；
12.37℃孵育15min，于Luminex仪器上检测。
六、结果检测与数据分析
反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测。以聚苯乙烯微球作为反应的载体，以荧光检测仪作为检测平台，对核酸分子进行高通量的多指标并行检测。在微球的制造过程中，掺入不同比例的红光及红外光染色剂，从而形成多至100种不同颜色编码的微球。不同的微球共价结合了针对不同待检测物的核酸分子作为探针分子，报告分子以生物素标记，并用高灵敏的荧光染料染色。这些微球与待测物、报告分子、荧光标记物就形成完整的微球检测体系用于Luminex系统的读取。Luminex阅读系统分别激发红色激光和绿色激光用于微球体系的检测，检测结果如表4、表5和表6所示。
对荧光值(MFI)和数据处理有以下要求：
1.每个位点需至少有一个等位基因MFI大于300而且大于10×PCR阴性对照MFI；
2.NET MFI＝样品MFI-PCR阴性对照MFI(NET MFI小于0的以0表示)；
3.满足以上两个条件的数据，按下列公式计算突变比值：
突变比值＝突变型NET MFI÷(突变型NET MFI+野生型NET MFI)
4.根据经验对每个检测位点的突变比值确定阈值(cut-off值)，以划分野生型纯合子、杂合子和突变型纯合子。
使用本方法检测20份样本的CYP2C9和VKORC1基因多态性，实验数据符合上述要求，因此可计算得它们的突变比值。阈值(cut-off值)的设置如下：突变比值范围在0％-20％视为野生型纯合子；30％-70％视为杂合子；80％-100％视为变异型纯合子。以测序法检测与液相芯片结果作对照，计算本发明所提供的分型方法检测结果的吻合率。本方法检测20份样本的CYP2C9和VKORC1基因型检测结果与测序结果吻合率达到100％。可见本发明所提供的CYP2C9和VKORC1基因SNP检测液相芯片能够准确地检测出CYP2C9和VKORC1基因的SNP类型，且结果稳定可靠。
表4 样本检测结果(MFI)
序号 NO. C430 T-w C430 T-m A107 5C-w A107 5C-m C108 0G-w C108 0G-m 818de 1A-w 818de 1A-m G- 1639 A-w G- 1639 A-m C117 3T-w C117 3T-m G373 0A-w G373 0A-m 阴性 对照 16 5 0 3 14 2 1 12 10 14 19 0 18 8 1 2528 12 2181 12 2097 19 2062 22 2097 48 2679 33 2138 21 2 3119 15 2374 45 2283 43 1945 17 2397 34 2186 32 2577 13 3 2836 46 2274 47 2629 33 1783 38 2363 12 2412 44 2117 44 4 2852 26 2709 40 2255 28 1891 34 2742 23 2073 12 2437 33 5 3083 33 2161 17 2159 30 1877 38 2311 43 2856 25 2262 46 6 3439 27 2537 37 2395 46 2172 46 2214 17 2999 35 2851 44 7 2569 23 2865 36 2968 23 2264 25 2464 15 2840 34 2541 45 8 2828 39 2882 45 2377 48 2108 31 603 585 643 652 598 565 9 2907 20 2933 15 2653 43 2370 14 562 607 2089 24 2939 32 10 2533 40 2173 25 2842 22 2295 47 2139 47 2836 27 2326 44 11 3469 49 2907 25 2586 45 1570 46 2054 35 2673 23 2896 31
序号 NO. C430 T-w C430 T-m A107 5C-w A107 5C-m C108 0G-w C108 0G-m 818de 1A-w 818de 1A-m G- 1639 A-w G- 1639 A-m C117 3T-w C117 3T-m G373 0A-w G373 0A-m 12 2845 22 2008 29 2303 26 1707 48 672 602 2901 18 648 643 13 3208 44 2527 41 2911 19 1869 18 2068 31 2485 26 2366 49 14 2951 10 2612 46 2498 27 2374 22 2554 23 2682 13 2349 19 15 3297 12 2768 22 2452 28 2160 18 2527 20 2286 22 2405 14 16 3157 30 2181 47 2089 38 1935 20 2515 28 2022 45 2652 47 17 3332 46 570 551 2762 30 1817 37 2482 30 2786 16 2264 36 18 3142 46 2298 37 2460 27 2387 20 2627 49 2634 20 2175 34 19 3271 32 2910 14 2817 39 1530 19 2518 29 2720 40 2976 32 20 3153 43 2264 26 2738 38 2187 31 634 586 2917 39 2721 26
表5样本CYP2C9和VKORC1突变比值
表6 样本CYP2C9和VKORC1突变类型分析结果
实施例3 不同的ASPE引物的液相芯片对CYP2C9、VKORC1基因SNP位点的检测
一、液相芯片制备的设计(Tag序列及Anti-Tag序列的选择)
以CYP2C9基因CYP2C9*3(A1075C)位点突变、VKORC1基因C1173T位点突变的检测液相芯片为例，分别针对A1075C、C1173T的野生型和突变型设计ASPE引物3’端的特异性引物，而ASPE引物5’端的Tag序列则选自SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.14中的12条，相应的，包被于微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列选择SEQ ID NO.29-SEQ ID NO.42。具体设计如下表(表7)所示。ASPE引物的合成、Anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。
表7 液相芯片制备的设计
二、样品检测
采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对血清样品21-40进行检测，检测结果如下：
表8 样本检测结果(CYP2C9)与基因多态性分析
表9 样本检测结果(VKORC1)与基因多态性分析
其它针对不同的SNP位点的液相芯片，ASPE引物运用不同的Tag序列，其结果依然稳定可靠，具体数据省略。
以上是针对本发明的可行实施例的具体说明，但该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。
序列表
<110>广州益善生物技术有限公司
<120>一种CYP2C9和VKORC1基因SNP检测特异性引物、液相芯片及方法
<160>54
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
tcatttcaca attcaattac tcaa 24
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<212>DNA
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aatcaatctt cattcaaatc atca 24
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<211>24
<212>DNA
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ctttaatcct ttatcacttt atca 24
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<212>DNA
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ctttctacat tattcacaac atta 24
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<212>DNA
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aaacaaactt cacatctcaa taat 24
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ctatcttcat atttcactat aaac 24
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<212>DNA
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aatctacaaa tccaataatc tcat 24
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tcaatcataa tctcataatc caat 24
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tcaatcatct ttatacttca caat 24
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<212>DNA
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cttctcatta acttacttca taat 24
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ctactataca tcttactata cttt 24
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tcaaaatctc aaatactcaa atca 24
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ggtggggaga aggtcaag 18
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gcttttgttt acattttacc tt 22
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gcttttgttt acattttacc tc 22
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tgaaaaacaa ccattggccg 20
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tgaaaaacaa ccattggcca 20
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gccaggagat catcgact 18
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tttggtccat tgtcatgtgc 20
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tttggtccat tgtcatgtgt 20
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ttgagtaatt gaattgtgaa atga 24
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tgatgatttg aatgaagatt gatt 24
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<212>DNA
<213>人工序列
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tgataaagtg ataaaggatt aaag 24
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<212>DNA
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taatgttgtg aataatgtag aaag 24
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attattgaga tgtgaagttt gttt 24
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gtttatagtg aaatatgaag atag 24
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>35
atgagattat tggatttgta gatt 24
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attggattat gagattatga ttga 24
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attgtgaagt ataaagatga ttga 24
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attatgaagt aagttaatga gaag 24
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<400>39
aaagaaagaa agaaagaaag tgta 24
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<212>DNA
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aaagtatagt aagatgtata gtag 24
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tgatttgagt atttgagatt ttga 24
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tgattgaatt gagtaaaaag gatt 24
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ggatggaaaa cagagactta c 21
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aaggtcagtg atatggagta g 21
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agaattgatc ctctggtcag a 21
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cacaaattca caagcagtca c 21
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ccatcctctc tttaagtttg c 21
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attcacaagt tccagggatt c 21
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gctttggaga ccagccca 18
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ggccctagat gtggggctt 19
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gctttggaga ccagccca 18