技术领域：
本发明涉及异麦芽低聚糖磺化产物的生产，广义上属于糖类衍生 物的生产。
背景技术：
异麦芽低聚糖硫酸酯(1MOS)是一种新型的生物科技产品。它除 具有其他多糖硫酸酯的生物学特征外，由于它的分子量较低，有可能 直接进入病变细胞发挥特殊的药理作用，因而在许多疾病，如爱滋病、 疯牛病、骨关节炎的防治研究中受到极大的重视。近年来又报导，一 种分子量1000～1500的异麦芽低聚糖所合成的硫酸酯具有特异地结 合人体血液中致动脉粥样硬化脂蛋白(LDL)的功能，这将为人类防治 高脂血症和冠心病提供另一新的途径。遗憾的是这类产品目前尚处在 研发的初级阶段，价格昂贵，且乏供应，主要原因是其制备过程涉及 生物合成和化学合成，其中有不少问题尚待研究解决。
发明内容：
发明的目的是提供一种科学而又实用的制备方法，能用于大规模 工业生产优质的IMOS，以满足国际市场的迫切需求。
本发明的依据是：根据右旋糖酐生物合成过程中的受体机理，右 旋糖酐蔗糖酶能以麦芽糖为受体，将蔗糖分子中的葡萄糖部分转移到 麦芽糖分子上，从而使其碳链不断延伸而生成异麦芽低聚糖。通过控 制合成过程，可以获得不同分子量的产品，再经过沉淀、超滤等技术， 除去杂质，实现产品的纯化。使用硼氢化钠，在改良的操作条件下， 使产品高效和充分氢化。最后用吡啶(或甲酰胺)为溶剂，通过合理控 制氯磺酸用量及操作过程，可合成不同含硫量的优质IMOS。
本发明的内容是包括异麦芽低聚糖的生物合成及其氢化和磺化 三个方面。
1、异麦芽低聚糖的生物合成
(1)基质液的配制
甲液：30％蔗糖溶液即于300克纯蔗糖中，加入500毫升蒸馏 水，搅拌使溶，再用蒸馏水加至总容积1000毫升。
乙液：10％麦芽糖溶液即称取纯度99％麦芽糖100克，加500 毫升蒸馏水，搅拌使溶，再加蒸馏水至总容积1000毫升。
丙液：0.2M乙酸钠-钙离子缓冲溶液即称取16.4克无水乙酸钠 和5.0克无水氯化钙，溶解于900毫升蒸馏水中，用30％冰乙酸调节 pH至5.2～5.4，再用蒸馏水加至总容积1000毫升。
将上述甲、乙、丙三种溶液按1∶0.5∶0.2比例进行混合。(适当改 变上述比例，可制得不同分子量产品，详见实施例)
(2)酶反应
按上述基质液容积，每毫升加入12单位纯化右旋糖酐蔗糖酶， 混合后将pH调至5.2～5.4，维持温度在25～27℃，并不断搅拌(50 转/分)24～48小时至反应完成(可用高压液相和粘度监测)。然后 升温至80-85℃半小时以终止反应。
(3)分离与纯化
过滤：将上述酶反应液，于温度60～70℃时，加入0.5％糖用 活性炭，轻微搅拌30分钟后，经板框压过滤。或将酶反应液直接 经陶瓷膜系统处理以除去不溶性高分子物质。
沉淀：过滤后的液体用等体积98％以上的异丙醇或乙醇沉淀， 沉淀物再用1/4上述有机溶剂洗涤一次。然后将沉淀物溶解于10 倍原体积的蒸馏水中。
超滤：将上述溶液转移至膜孔为800～1000的超滤膜系统进行 循环超滤，并用高压液相进行监测，直至出现单峰。纯度在98％ 以上，即可进行下一步化学反应。
2、异麦芽低聚糖的氢化反应
(1)10％硼氢化钠碱性溶液的制备
每10克硼氢化钠溶解于100毫升30％氢氧化钠溶液中。(临用 前配制)
(2)氢化反应
先将上述纯化的异麦芽低聚糖配制成25％浓度的水溶液。按4％ 异麦芽糖量，缓慢滴加10％硼氢化钠碱性溶液。反应宜在25～30 ℃温度下进行，搅拌速度应控制在10～20转/分，间隙进行，4小 时后，当产生的氢气小泡消失时，可用6N盐酸缓慢滴加至pH2～3 时，再继续搅拌4小时，测定反应物中还原糖含量，若低于0.1％， 则可停止反应，将溶液pH调至5～7。
(3)纯化
氢化异麦芽低聚糖溶液可通过超滤膜系统、离子交换或有机溶 剂(异丙醇或乙醇)沉淀等方法进行纯化。最后喷雾干燥成粉，也可用 有机溶剂脱水后真空干燥。
3、异麦芽低聚糖的磺化反应
基本步骤如下：
(1)将一定容量(如1000毫升)的吡啶置于干燥洁净的2000 毫升圆底三口烧瓶中，置冰水溶液使内温降至10℃以下。
(2)在慢速(50转/分)搅拌下，缓慢滴加氯磺酸(滴加量取 决于产品所需含硫量，可自0.6至1.25吡啶容积)。滴加过程中温 度应控制在15℃以下。
(3)滴加完毕后立即升温至50′℃，加快搅拌机转速至80 转/分，使冷凝的固含物充分溶解。
(4)在搅拌条件下，逐渐加入1/10吡啶量(W/V)的氢化异麦 芽低聚糖。
(5)待全部溶解后，继续升温至70～75℃，并维持此温度 范围，持续搅拌(50转/分)反应4小时。然后将温度降至50′℃以 下。
(6)于反应物中加入200毫升蒸馏水，搅拌混匀后，用 40％NaOH溶液调pH至3～4，然后加入1倍体积99％甲醇沉淀， 静置30分钟后，吸去上清液，沉淀，再用1/4体积99％甲醇洗涤 一次。
(7)重复上述方法，再用甲醇沉淀洗涤2～3次，直到游离 硫和氯含量低于100ppm。
(8)将溶液pH调至6.8～7.2，并加入0.5％磷酸缓冲液，最 后喷雾干燥。
本发明与现有技术对比，具有的优点：科学性与实用性的结合。
1、从异麦芽低聚糖的生物合成看：目前国内外普遍采用葡萄糖苷酶 方法，其产物多为5个葡萄糖以下的低分子聚合物，伴葡萄糖等副产 品，故仅能用于食品营养方面。本发明则根据右旋糖酐酶一受体合成 机理，采用科学的配方和合成过程，以及先进的分离纯化技术，获得 5～10个葡萄糖(即分子量为1000～1800)的超高纯异麦芽低聚糖，是 若干重要药物的最佳载体。
2、从氢化技术看：以往一般采用硼氢化钠直接加于右旋糖酐溶液中， 这种方法不仅原料用量明显增加，而且操作不便。本发明先将硼氢化 钠溶解于碱性溶液中，然后再缓慢滴加于异麦芽低聚糖溶液中，使反 应温和、充分、利用率高，操作也比较方便，而且硼氢化钠用量约节 省一半。
3、磺化方面：本发明提供了如何对分子量较低的糖类合成具有不同 含硫量和纯度较高的磺化产品。
具体实施方式：
以下本发明的具体实施例：
实施例1
(1)称取150克纯蔗糖加于有刻度的1000毫升三角瓶中，加 少量蒸馏水搅拌使溶，再加蒸馏水至500毫升刻度。
(2)称取25克纯度为99％的麦芽糖，溶于250毫升蒸馏水中， 搅拌使溶，然后倒于上述蔗糖溶液中，混合。
(3)加入100ml0.22M乙酸钠钙离子溶液(内含1.64克无水乙 酸钠和0.5克无水氯化钙)。
(4)将上述溶液混匀后，用30％冰乙酸调pH至5.2～5.4。
(5) 按每毫升溶液12单位计算，加入足够的右旋糖酐蔗糖酶， 搅拌均匀后，再调pH在5.2～5.4范围，维持温度在25～27℃，连续 搅拌24～48小时，至反应完成后，即可升温至80-85℃半小时，以 终止反应。
(6)乘热加入0.5％糖用活性炭，轻度搅拌半小时后，布氏漏斗 过滤，溶液再经0.45微米超滤膜除碳。
(7)于滤液中加入1000毫升99％异丙醇沉淀，静置半小时后 除去上清液，沉淀，再用250毫升99％异丙醇洗涤一次。
(8)将沉淀物溶解于4000毫升蒸馏水中，然后经超滤膜系统 循环除去小分子物质，最后浓缩至500毫升左右。
(9)于上述溶液中，缓慢滴加30毫升10％硼氢化钠碱性溶液。 在25～30℃溶液中反应4小时，待气泡消失后，逐渐滴加6N盐酸至 pH 2～3时再搅拌4小时，然后加1倍体积的99％异丙醇沉淀、洗涤， 沉淀物溶解于1000毫升蒸馏水，再经复合离子交换树脂柱(或超滤系 统)除去盐类，最后用有机溶剂脱水，真空干燥，磨粉。
(10)磺化反应吡啶法：将500毫升吡啶倒入1000毫升圆底三 口烧瓶中，置冰水溶液中，使瓶内吡啶温度降至10℃以下，开始滴 加50毫升氯磺酸，并维持温度在15℃以下，待滴加完毕后逐渐升温 至50℃，加入上述氢化异麦芽糖干粉50克。然后升温至70～75℃反 应4小时，即可停止，并降温至50℃以下，然后加50毫升蒸馏水， 调pH至3，再用99％甲醇沉淀、洗涤，并重复3次至沉淀物的游离 硫和氯离子含量降至标准范围(低于100ppm)即可干燥制粉。
本例异麦芽低聚糖分子量为1000～1300，含硫量18.0～19.0％。
实施例2
(1)异麦芽低聚糖的制备(10L)
称取1.5公斤纯蔗糖和0.3公斤纯度为99％的麦芽糖，置15升的 玻璃反应器中，加蒸馏水5升，搅拌使溶，再加入新鲜配制的1升 0.2M乙酸钠---钙离子溶液(内含乙酸钠16.4克，氯化钙5.0克)，充分 混合后，用30％冰乙酸调pH至5.2～5.4，然后加入100,000单位右 旋糖酐蔗糖酶，再加蒸馏水至总容积10升，搅拌混匀后调pH至5.2～ 5.4。于25～27℃温度下，搅拌24～48小时，反应完成后即可升温灭 酶过滤纯化(步骤同实施例1)。
本例纯化异麦芽低聚糖产量为750克。
(2)氢化反应
将纯化异麦芽低聚糖配制成25％浓度溶液，缓慢滴加入300毫升 10％硼氢化钠碱性溶液(即30克硼氢化钠溶解于300毫升30％NaOH溶液中，临用前配制)。轻度间隙搅拌，使氢化反应温和进行，约4 小时，使氢气完全耗尽，即可用6N盐酸，将pH调至2～3，此时 仍有氢气发生，故再搅拌4小时，使氢化反应充分完成，然后按实施 例1的步骤进行纯化，最后喷雾干燥。
(3)磺化反应(甲酰胺法)
将5升甲酰胺加于10升玻璃反应器中，将内温降至15℃以下， 在搅拌(50转/分)条件下，缓慢和小心地滴加300毫升氯磺酸，过程 中应维持温度在20℃以下，滴加完毕后即可升温至50℃，使固体物 质完全溶解后即可逐步加入500克干燥的氢化异麦芽低聚糖。然后将 温度升高至70～75℃并维持搅拌4小时。反应完成后，立即降温至 50℃以下，加入蒸馏水，搅拌后调pH至3～4，然后加入99％异丙醇 6升，搅拌15分钟后静置30分钟，吸去上清液，回收。沉淀再用1 升99％异丙醇洗涤一次。同样方法重复2～3次，直至游离硫和氯含 量低于标准范围，即可将pH调至6.5～7.5，并加入0.5％磷酸缓冲液， 最后喷雾干燥。
本例制得的异麦芽低聚糖分子量为1300～1800，含硫量为12％。