技术领域
本发明涉及源自发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)NXTag-1的一种耐高温L-阿拉伯糖异构酶、耐高温L-阿拉伯糖异构酶工程菌的构建以及耐高温L-阿拉伯糖异构酶的应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
塔格糖是一种自然界中较为稀有的天然己酮糖，属于稀少糖的一种，国际稀少糖协会(ISRS)对稀少糖的定义为“自然界中存在但含量极少的一类单糖及其衍生物”。D-塔格糖(D-tagatose)是果糖的“差向异构体”，广泛存在于自然界中，许多食品，如灭菌牛乳、乳粉、热可可、各种干酪、某些品种的酸乳以及某些植物中都存在有一定量的塔格糖。D-塔格糖是作为一种具有特殊保健功能的功能性甜味剂，工业生产中由D-半乳糖经异构化制得，外形及甜味特征与蔗糖相似，无任何不良异味或后味，热量较低(1.5kcal/g)，具有改善肠道菌群、降低血糖、抗龋齿等多种生理功能，并且还具有良好的美拉德反应和焦糖化反应等优点。2001年被美国食品与药物管理局(FDA)确定为公认安全食品(GRAS)，随后D-塔格糖在美国被通用于健康饮料及酸乳、果汁等产品，作为蔗糖的代用品；欧盟也于2003年批准D-塔格糖在欧洲上市。
L-阿拉伯糖异构酶(EC 5.3.1.4，L-arabinose isomerase，L-AI)不仅催化L-阿拉伯糖异构化为L-核酮糖还能催化D-半乳糖生成D-塔格糖，是生物转化生产D-塔格糖最有效的酶，因此通过L-AI实现D-塔格糖的产业化正成为人们研究的热点。1993年，Cheetham等首次报道了利用L-AI催化D-半乳糖生产D-塔格糖的研究。随后，多种微生物来源的L-AI被发现，大肠杆菌、植物乳杆菌、枯草杆菌、嗜热芽孢杆菌等多种L-阿拉伯糖异构酶生产菌的L-AI编码基因(araA)被克隆和外源表达。反应温度是生物催化醛酮糖异构反应中一个非常重要的参数，D-半乳糖与D-塔格糖之间的异构反应的平衡受温度影响较大，反应温度越高，异构反应平衡越偏向D-塔格糖，底物转化率越高；较高温度条件下(60℃以上)更有利于D-塔格糖的生成，有利于降低D-塔格糖的生产成本和提高产物产量。尽管很多种属的araA基因已被鉴定，但是被用于D-塔格糖生产研究的L-AI并不多，因为大多L-AI酶的热稳定性较差、最适反应温度较低，不利于工业应用。例如大肠杆菌L-AI、耻垢分枝杆菌L-AI等，其最适反应温度仅有30～45℃。因此耐热性的L-阿拉伯糖异构酶将具有更好的应用前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种耐高温L-阿拉伯糖异构酶。
本发明还要解决的技术问题是提供编码上述L-阿拉伯糖异构酶的基因序列。
本发明还要解决的另一个技术问题是提供包含上述L-阿拉伯糖异构酶的基因工程菌及其构建方法。
本发明还要解决的另一个技术问题是提供上述L-阿拉伯糖异构酶的表达方法。
本发明还要解决的另一个技术问题是提供上述L-阿拉伯糖异构酶在制备D-塔格糖中的应用。
本发明最后要解决的技术问题是提供上述产L-阿拉伯糖异构酶的基因工程菌在制备D-塔格糖中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种耐高温L-阿拉伯糖异构酶，它具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，包含474个氨基酸。其来源于发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)NXTag-1CGMCCNO.2921(专利申请号200910025982.9)。
上述耐高温L-阿拉伯糖异构酶的编码基因，它具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，其含有1425bp碱基。
一种耐高温L-阿拉伯糖异构酶的基因工程菌，它包含如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
上述基因工程菌的构建方法，该方法包括如下步骤：
(1)构建含有耐高温L-阿拉伯糖异构酶基因的表达质粒：
取发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)NXTag-1CGMCC NO.2921基因组DNA作为模版，以包含EcoRI和XhoI的酶切位点的下列核苷酸序列作为引物，进行PCR扩增：
引物1：5’-AGAGAATTCATGCGTAAGATGCAAGATTAC-3’
引物2：5’-AAGCTCGAGCTACTTGATGTTGATAAAGT-3’
PCR扩增体系为：基因组DNA2μL，引物1和引物2各1μL，dNTP2μL，10×Tag缓冲液2.5μL，ExTag聚合酶0.5μL，ddH2O 14μL；
PCR反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性2min；然后60℃退火30s，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸1min；
回收PCR扩增产物，经限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切，与经过同样双酶切的质粒pET-28a(+)，在T4连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pET-araA
(2)将该重组质粒pET-araA转化至宿主细胞中：
将重组质粒pET-araA转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布含有25μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养18～24h得到初步阳性克隆；
(3)经抗性培养基筛选得到阳性克隆：
分别挑取初步阳性克隆于5mL含有25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养过夜，提取质粒，经限制性内切酶EcoRI和XhoI酶切质粒，根据电泳结果判断具有序列表SEQ ID NO：1的DNA片段的质粒为重组质粒pET-araA，具有该质粒的菌落为阳性克隆，即为基因工程菌。对重组质粒pET-araA进行测序，结果表明插入片段为一个含有1425bp，编码474个氨基酸组成的蛋白质。
上述耐高温L-阿拉伯糖异构酶的表达方法，将包含如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的基因工程菌接种于添加了25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜；再以5％(v/v)的接种量转接到含25μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃发酵培养2～3小时，至OD600为0.6时加入0.2～1mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)或0.5～2g/L的乳糖，继续诱导表达6～12小时后，离心收集菌体。
上述耐高温L-阿拉伯糖异构酶的纯化方法，将包含如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的基因工程菌悬于缓冲液(即pH 7.0磷酸钾缓冲液)中，利用超声波破碎细胞，离心上清液为粗酶液，粗酶液经0.2μm滤膜过滤后，使用Ni-NTA亲和树脂进行纯化，纯化后经SDS-PAGE检测为单一条带，分子量约为55kDa(图3)。
上述耐高温L-阿拉伯糖异构酶在制备D-塔格糖中的应用。具体为：以1～100g/L的D-半乳糖为底物，加入纯化后的耐高温L-阿拉伯糖异构酶进行酶转化反应，耐高温L-阿拉伯糖异构酶的用量为10～500mg/L，反应温度40～70℃，转化时间8～15h，通过半胱氨酸-咔唑法测定转化液中D-塔格糖生成量。优选的方式为：以1～100g/L的D-半乳糖为底物，添加0.5～2mmol/L Mn2+离子和1～3mmol/L Co2+离子，加入纯化后的耐高温L-阿拉伯糖异构酶进行酶转化反应，耐高温L-阿拉伯糖异构酶的用量为10～500mg/L，反应温度40～70℃，转化时间8～15h。
上述产耐高温L-阿拉伯糖异构酶的基因工程菌可不需要经过提取纯酶的过程，直接将基因工程菌应用于D-塔格糖的制备。具体为：以1～100g/L的D-半乳糖为底物，加入经上述表达方法诱导后的产耐高温L-阿拉伯糖异构酶的基因工程菌进行转化反应，产耐高温L-阿拉伯糖异构酶的基因工程菌的用量为10～100g/L(湿菌体)，反应温度40～70℃，转化时间12～48h。通过半胱氨酸-咔唑法测定转化液中D-塔格糖生成量。优选的方式为：以1～100g/L的D-半乳糖为底物，添加0.5～2mmol/L Mn2+离子和1～3mmol/L Co2+离子，加入诱导后的产耐高温L-阿拉伯糖异构酶的基因工程菌进行转化反应，产耐高温L-阿拉伯糖异构酶的基因工程菌的用量为10～100g/L(湿菌体)，反应温度40～70℃，转化时间12～48h。
有益效果：本发明的耐高温L-阿拉伯糖异构酶的反应温度为40～70℃，反应pH为5.5～7.5。该重组酶显示出良好的热稳定性与pH耐受性，75℃热处理1～3h后存留80～90％酶活力，pH 6.5微酸条件处理0～48h酶活性无损失。
低浓度Mn2+和Co2+离子的添加可以大幅提高酶活力和热稳定性，添加0.5～2mmol/L MnCl2，1～3mmol/L CoCl2后65℃下酶活力相比于不添加金属离子的对照组提高2倍，达到10U/mg(一个单位的重组L-阿拉伯糖异构酶酶活U定义为在65℃下，pH为6.5的条件下每分钟生成1μmol的D-塔格糖的酶量)，65℃热处理6h酶活力损失低于10％。
该耐高温L-阿拉伯糖异构酶在较高温度条件下具有较好的活性和稳定性，对于新型功能性甜味剂D-塔格糖的工业化生产具有广泛的应用前景和经济意义。
附图说明
图1为重组质粒pET-araA的构建示意图。
图2为重组质粒pET-araA的单双酶切鉴定(8g/L琼脂糖凝胶电泳)。其中泳道1为EcoRI单酶切产物，泳道2为标准DNA分子量，自上向下的条带分别为(kb)：15.0，10.0，7.5，5.0，2.5，1.0，泳道3为EcoRI和XhoI双酶切产物。
图3为重组耐高温L-阿拉伯糖异构酶SDS-PAGE电泳图。泳道1为标准蛋白分子量，自上向下的条带分别为(kDa)：116.0，66.2，45.0，35.0，25.0。
图4为MnCl2和CoCl2的添加浓度对重组耐高温L-阿拉伯糖异构酶酶活性的影响。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)NXTag-1基因组DNA的提取。
按照生产商提供的使用说明书，用Genomic DNA Purification Kit(Takara，大连)抽提处于对数生长期的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)NXTag-1CGMCC NO.2921的基因组DNA，并用8g/L琼脂糖凝胶电泳对获得的细菌基因组进行检测。
实施例2：L-阿拉伯糖异构酶编码基因(araA)的克隆和重组菌构建。
2.1araA基因的PCR扩增
根据Gene Bank上已报道发酵乳杆菌L-AI基因的序列，运用Vector NTI软件设计引物Primer1和Primer2，引物序列为：
Primer1：5’-AGAGAATTCATGCGTAAGATGCAAGATTAC-3’
Primer2：5’-AAGCTCGAGCTACTTGATGTTGATAAAGT-3’
以实施例1获得的发酵乳杆菌的基因组DNA为模板，扩增发酵乳杆菌基因片段。
PCR扩增体系为：基因组DNA2μL，引物Primer1和Primer2各1μL，dNTP 2μL，10×Tag缓冲液2.5μL，ExTag聚合酶0.5μL，ddH2O 14μL。
PCR反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性2min；然后60℃退火30s，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸1min。
将扩增条带切胶后用Axygen公司柱式割胶回收试剂盒回收，连接于Takara公司pMD18-T载体上并转化大肠杆菌JM109。通过在氨苄青霉素LB平板上结合质粒单双酶切验证，鉴定出阳性克隆，并在南京金斯瑞生物科技公司进行序列测定。将测得全长序列在GenBank数据库中进行分析，并借助Vector NTI软件确定其中的完整阅读框。
2.2araA基因的表达
利用pET-28a(+)质粒(Novagen)，构建表达载体，表达目的基因，进一步确认基因克隆的正确性。
2.2.1限制性酶切反应，纯化及连接反应
经纯化后的PCR产物，用预先设计在引物序列中酶切位点所对应的酶进行酶切反应。本实验中，所用的酶是EcoRI和XhoI。酶切体系为：PCR产物或质粒溶液100μL，EcoRI 3μL，XhoI 3μL，10×缓冲液10μL，ddH2O 34μL，总体积100μL。
由于所选用的两个酶切位点在pET-28a(+)空质粒上相距很近(约30bp)，因此，酶切之后的PCR产物和质粒载体只需要经过PCR清洁试剂盒即可达到纯化的目的。
经酶切纯化后的PCR产物和质粒载体，可以用于连接反应。连接反应体系为：酶切纯化的PCR产物4μL，酶切纯化的质粒4μL，T4连接酶1μL，10×连接酶缓冲液1μL。连接后获得重组质粒pET-araA，其主要结构如图1所示。
2.2.2质粒制备与转化
质粒抽提采用质粒提取试剂盒，参照生产商的说明书进行操作。
质粒转化细胞使用氯化钙法。
2.2.3重组质粒pET-araA的转化
(1)取0.1-1μg重组质粒pET-araADNA于200μL感受态细胞中，冰浴30分钟。
(2)42℃水浴热激90秒，快速置于冰上1-3分钟。
(3)加入新鲜LB液体培养基800μL，于37℃振荡培养45分钟。
(4)取200μL菌体涂布于选择性LB固体培养基表面。37℃培养12-16个小时至单菌落出现。
2.2.4重组子的鉴定
将阳性菌落接种于含有卡那霉素(25μg/mL)的LB液体培养基中进行培养并提取质粒，按照“限制性酶切反应，纯化及连接反应”中的酶切体系和条件分别用EcoRI、EcoRI和XhoI对重组质粒进行单-双酶切鉴定，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果见图2，实验结果说明获得的重组质粒是正确的。
经电泳结果证实，该阳性克隆菌落含有DNA片段插入质粒pET-araA，含此重组质粒pET-araA的重组大肠杆菌，即为转化的重组大肠杆菌BL21-AI。测序结果显示插入片段含有一个长1425bp的开放阅读框架。
实施例3：L-阿拉伯糖异构酶的诱导表达。
将重组大肠杆菌BL21-AI接种于5mL添加了25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜；再以5％的接种量转接到装有100mL LB培养基(含25μg/mL卡那霉素)的500mL摇瓶中，37℃摇床培养2～3小时，至OD600约为0.6时加入IPTG进行诱导(IPTG终浓度1mmol/L)，或者添加1g/L乳糖进行诱导，然后继续诱导表达6小时后，离心收集菌体。
实施例4：重组L-阿拉伯糖异构酶的纯化。
获得的重组菌E.coli BL21-AI的菌体悬于磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中，用生理盐水清洗两次，使用超声波破碎仪破碎细胞(400W，30min)，12000rpm离心10min，所得上清液为可溶性目标蛋白(粗酶液)。粗酶液经0.2μm滤膜过滤后，将样品加至Ni-NTA亲和树脂中，控制流速在15mL/h左右，用10倍柱床体积Wash-Buffer(300mM NaCl，50mM NaH2PO4，10mM咪唑)冲洗，最后用10倍柱床体积Elution-Buffer(300mMNaCl，50mM NaH2PO4，250mM咪唑)洗脱并收集目标蛋白，将目的蛋白溶液4℃下于磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中过夜透析。纯化后的目的蛋白酶活力达到10U/mg(添加1mmol/L MnCl2和2mmol/L CoCl2)，经SDS-PAGE检测为单一条带，并显示重组L-阿拉伯糖异构酶蛋白的分子量为55kDa。
实施例5：重组L-阿拉伯糖异构酶热稳定性实验。
取纯化后的重组L-阿拉伯糖异构酶100μL(10mg/mL)于40℃、50℃、60℃、65℃、70℃和75℃不同温度水浴中处理3h，然后加入到900μL含有100mM磷酸钾缓冲液(pH 6.5)的反应体系中，添加D-半乳糖至终浓度100mM，65℃水浴反应30min，通过半胱氨酸-咔唑法测定D-塔格糖生成量。测得结果见表1(一个单位的重组L-阿拉伯糖异构酶酶活U定义为在65℃下，pH为6.5的条件下每分钟生成1μmol的D-塔格糖的酶量)。
表1
实施例6：重组L-阿拉伯糖异构酶pH稳定性实验。
取纯化后的重组L-阿拉伯糖异构酶10μL(10mg/mL)于90μL pH分别为5.5、6.0、6.5和7.5的100mM磷酸钾缓冲液中室温处理0～48h，然后加入到900μL含有100mM磷酸钾缓冲液(pH 6.5)的反应体系中，添加D-半乳糖至终浓度100mM，65℃水浴反应30min，通过半胱氨酸-咔唑法测定D-塔格糖生成量。测得结果见表2。
表2
实施例7：Mn2+和Co2+离子添加浓度对重组L-阿拉伯糖异构酶酶活性的影响。
取纯化后的重组L-阿拉伯糖异构酶2mg于10mL 100mM磷酸钾缓冲液中(pH 7.0，含10mM EDTA)，4℃过夜透析，然后置于100mM磷酸钾缓冲液中透析12h将EDTA除去，分别向酶液加入0～5mM MnCl2和CoCl2，并添加D-半乳糖至终浓度100mM，65℃水浴反应30min，通过半胱氨酸-咔唑法测定D-塔格糖生成量。测得结果如图4(将1mM Mn2+离子条件下测得酶活力设定为100％。
实施例8：重组L-阿拉伯糖异构酶的应用I。
酶转化反应的总体积为10mL，以10g/L D-半乳糖作为转化底物，溶解于100mmol/L磷酸钾缓冲液(pH 6.5)，取2mg实施例4纯化后的重组L-阿拉伯糖异构酶于体系中，65℃反应12h，通过半胱氨酸-咔唑法测定D-塔格糖生成量。经测定，转化液中D-塔格糖浓度为5.5g/L，重组L-阿拉伯糖异构酶对底物D-半乳糖的转化率达到55％。
实施例9：重组L-阿拉伯糖异构酶的应用II。
酶转化反应的总体积为10mL，以10g/L D-半乳糖作为转化底物，溶解于100mmol/L磷酸钾缓冲液(pH 6.5)，取2mg实施例4纯化后的重组L-阿拉伯糖异构酶于体系中，并添加MnCl2(终浓度1mmol/L)和CoCl2(终浓度2mmol/L)，65℃反应12h，通过半胱氨酸-咔唑法测定D-塔格糖生成量。经测定，转化液中D-塔格糖浓度为6.5g/L，重组L-阿拉伯糖异构酶对底物D-半乳糖的转化率达到65％。
实施例10：产重组L-阿拉伯糖异构酶的基因工程菌的应用I。
转化反应的总体积为100mL，以100g/L D-半乳糖作为转化底物，悬浮于100mmol/L磷酸钾缓冲液(pH 6.5)，取5g(湿菌体)实施例3得到的产重组L-阿拉伯糖异构酶的基因工程菌于反应体系中，65℃反应36h，通过半胱氨酸-咔唑法测定D-塔格糖生成量。经测定，转化液中D-塔格糖浓度为60g/L，重组L-阿拉伯糖异构酶对底物D-半乳糖的转化率达到60％。
实施例11：产重组L-阿拉伯糖异构酶的基因工程菌的应用II。
转化反应的总体积为100mL，以100g/L D-半乳糖作为转化底物，悬浮于100mmol/L磷酸钾缓冲液(pH 6.5)，取5g(湿菌体)实施例3得到的产重组L-阿拉伯糖异构酶的基因工程菌于反应体系中，并添加MnCl2(终浓度1mmol/L)和CoCl2(终浓度2mmol/L)，65℃反应36h，通过半胱氨酸-咔唑法测定D-塔格糖生成量。经测定，转化液中D-塔格糖浓度为70g/L，重组L-阿拉伯糖异构酶对底物D-半乳糖的转化率达到70％。
核苷酸或氨基酸序列表
SEQUENCE LISTING
<110>南京工业大学
<120>一种耐高温L-阿拉伯糖异构酶及其应用
<130>njut100413
<160>4
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1425
<212>DNA
<213>发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)NXTag-1
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1425)
<400>1
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Met Arg Lys Met Gln Asp Tyr Lys Phe Trp Phe Val Val Gly Ser Gln
1 5 10 15
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Pro Leu Tyr Gly Pro Glu Ala Leu Ala Glu Val Glu Lys Asp Ala Arg
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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145 150 155 160
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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Leu Arg Glu Tyr Leu Gly Ile Lys Lys Phe Leu Asp Asp Asn Gly Tyr
260 265 270
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Asp Ala Phe Thr Asp Asn Phe Gln Asp Leu Glu Gly Leu Glu Gln Leu
275 280 285
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Pro Gly Leu Ala Val Gln Leu Leu Met Ile Asp Gly Tyr Gly Phe Gly
290 295 300
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Pro Glu Gly Asp Phe Lys Met Ala Gly Leu Thr Arg Leu Leu Lys Ile
305 310 315 320
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Ala Ala Asp Asn Lys Gln Thr Ala Leu Met Glu Asp Tyr Thr Leu Asp
325 330 335
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Leu Arg His Gly His Glu Ala Ile Met Gly Ser His Met Leu Glu Val
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Asp Pro Thr Leu Ala Ser Asp Lys Pro Arg Val Glu Val His Pro Leu
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Gly Ile Gly Gly Lys Asp Asp Pro Ala Arg Leu Val Phe Thr Gly Ala
370 375 380
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Glu Gly Lys Gly Tyr Asp Ile Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Asp Gly Tyr
385 390 395 400
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Lys Phe Ile Gly Tyr Pro Val Asp Cys Lys Thr Pro Glu Ala Glu Met
405 410 415
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Pro Lys Leu Pro Val Ala Lys Gln Met Trp Thr Pro Glu Ile Gly Leu
420 425 430
gct gag ggt gct aag caa tgg atg aag tac ggt ggt ggt cac cac acc 1344
Ala Glu Gly Ala Lys Gln Trp Met Lys Tyr Gly Gly Gly His His Thr
435 440 445
gtc ttg acc cta gcc cta agc gaa gaa caa tta gaa caa ttg gca cgt 1392
Val Leu Thr Leu Ala Leu Ser Glu Glu Gln Leu Glu Gln Leu Ala Arg
450 455 460
ttg ttc aag gtc gac ttt atc aac atc aag tag 1425
Leu Phe Lys Val Asp Phe Ile Asn Ile Lys
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<211>474
<212>PRT
<213>发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)NXTag-1
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1 5 10 15
Pro Leu Tyr Gly Pro Glu Ala Leu Ala Glu Val Glu Lys Asp Ala Arg
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Lys Leu Val Asp Gly Leu Asn Lys Gly Gly Lys Leu Asp Tyr Pro Val
35 40 45
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His Thr Phe Ser Pro Ala Lys Asn Trp Ile Arg Gly Thr Glu Leu Leu
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