发明领域
本发明涉及与MeaB蛋白同源的蛋白质用于增加3-羟基羧酸- CoA-变位酶的酶促活性的用途、包含3-羟基羧酸-CoA-变位酶和与 MeaB蛋白同源的蛋白质序列的融合蛋白以及用于制备2-羟基异丁酸 的酶促方法。
现有技术
2-羟基异丁酸(2-HIB)可以作为反应物通过脱水转化为甲基丙烯 酸，一种商业上重要的原料，从而实现工业应用。
WO2007/110394描述了用于从3-羟基羧酸酶促制备2-羟基-2-甲 基羧酸的方法，其中使用了具有3-羟基羧酸-CoA-变位酶活性的单元， 所述单元既具有3-羟基羰基-CoA-酯产生活性，又拥有3-羟基羰基 -CoA-酯异构化活性，并且导致3-羟基羧酸转化为相应的2-羟基-2甲 基羧酸。钴胺素依赖性变位酶（其作为合适的具有3-羟基羧酸-CoA- 变位酶活性的单元而提及）是来自HCM-10(DSM 18028)、Methylibium petroleiphilum PM1、Methylibium物种R8(德国UFZ Leipzig的菌 种保藏)、自养黄色杆菌（Xanthobacter autotrophicus）Py2、类球 红细菌（Rhodobacter sphaeroides）(ATCC 17029)或类诺卡氏菌属 物种（Nocardioides sp.）JS614的那些。
在DE102008002715中描述了在WO2007/110394中所描述的3- 羟基羧酸-CoA-变位酶用于在细胞中制备2-羟基异丁酸的重组用途， 在所述细胞中2-羟基-2-甲基羧酸经由作为中间产物的乙酰乙酰基辅 酶A和作为前体的3-羟基丁酰辅酶A来实现；在此，作为另外的、合 适的3-羟基羧酸-CoA-变位酶将提及可以从Aquincola tertiaricarbonis L108、Aquincola tertiaricarbonis DSM 18512、 栖藻海杆菌（Marinobacter algicola）DG893、苜蓿中华根瘤菌 （Sinorhizobium medicae）WSM419、玫瑰变色菌属物种（Roseovarius sp.）217、激烈火球菌（Pyrococcus furiosus）DSM 3638分离出的 那些。
在A.Tertiaricarbonis基因组中在编码3-羟基羧酸-CoA-变位 酶的大亚基的基因hcmA的上游，有编码具有迄今未知功能的假定蛋白 质（在下文也称为MeaB）的基因。序列比较指出与具有ATPase/GTPase 功能的酶的同源性。
所描述的用于制备2-羟基异丁酸的酶促方法的共同特征在于产 率低，这是因为酶促转换率低。
因此，本发明的任务是提供用于以较高产率制备2-羟基异丁酸的 方法。
发明描述
令人意外地，发现在下文描述的与MeaB蛋白同源的蛋白质序列的 用途中以及在下文描述的融合蛋白为解决所述目的作出了贡献。
因此，本发明涉及与MeaB蛋白同源的蛋白质用于增加3-羟基羧 酸-CoA-变位酶的酶促活性的用途。本发明还涉及包含3-羟基羧酸 -CoA-变位酶和与MeaB蛋白同源的蛋白质序列的融合蛋白。
本发明还涉及用于制备2-羟基异丁酸的酶促方法。
应用这样的蛋白质以增加3-羟基羧酸-CoA-变位酶的酶促活性为 解决开头提及的目的作出了贡献，所述蛋白质包含与MeaB蛋白同源的 蛋白质序列，所述蛋白质序列具有至少100个，优选地至少200个， 特别是至少300个氨基酸并且与MeaB蛋白具有至少60%，优选地至少 80%，特别优选地至少95%，十分特别优选地至少99%，特别是100%的 序列同一性。
“3-羟基羧酸-CoA-变位酶”，下文缩写为Hcm，表示这样的酶， 其催化3-羟基羧基-CoA-酯产生相应的2-羟基-2-甲基羧酸-CoA-酯， 特别是3-羟基丁酰辅酶A产生2-羟基异丁酰辅酶A的反应。
术语“MeaB蛋白”，在本发明的上下文中表示选自以下列登录号 所指示的蛋白质：
SEQ ID No.1(Aquincola tertiaricarbonis DSM 18512),
YP_001023545(Methylibium petroleiphilum PM1),
YP_001409454(自养黄色杆菌Py2),
YP_001045518(类球红细菌ATCC 17029),
YP_002520048(类球红细菌),
AAL86727[扭脱甲基杆菌（Methylobacterium extorquens）AM1],
CAX21841(扭脱甲基杆菌DM4),
YP_001637793(扭脱甲基杆菌PA1),
AAT28130[红霉素气微菌（Aeromicrobium erythreum)）,
CAJ91091[纤维多囊菌（Polyangium cellulosum）]，
AAM77046[红色糖多孢菌（Saccharopolyspora erythraea）]和
NP_417393[大肠杆菌（Escherichia coli）K-12菌株MG1655亚 株]。
所提及的序列同一性根据blastp算法来测定，其中采用10的期 望阈值，3的字长，存在的缺口罚分为11和延伸的缺口罚分为1的 blosum62矩阵，以及条件合成得分矩阵调整（conditional compositional score matrixa djustment）。
与MeaB蛋白具有至少60%，优选地至少80%，特别优选地至少95%， 十分特别优选地至少99%，特别是100%的序列同一性的至少100个， 优选地至少200个，特别是至少300个氨基酸的蛋白质序列，在下文 也被称为“与MeaB蛋白同源的蛋白质序列”。
术语“2-羟基异丁酸”或“3-羟基丁酸”，特别地表示其盐，也 表示质子化形式，以及由各个酸的单体组成的聚羟基链烷酸。
所有指出的百分比（%），除非另外指出，为质量百分比。
对技术人员显而易见的是，通过本文指出的核苷酸序列或针对具 体的已公开基因的参考使得能够产生探针和引物，所述探针和引物可 用于鉴定和/或克隆待产生的其他细胞类型或生物中的同源序列以便 例如鉴定在此本文未明确提及的其他MeaB蛋白或hcm。这样的探针或 引物通常包含核苷酸序列区，其在“严谨”条件（参见下文）与核酸 序列的有义链或相应反义链的至少大约12个，优选地至少大约25个， 例如大约40个、50个或75个连续的核苷酸杂交。
核酸序列可以例如用传统的杂交方法或PCR技术从其他生物分离 出，例如通过基因组或cDNA文库。这些DNA序列在标准条件下与所提 及的序列杂交。为了进行杂交，有利地使用保守区的，例如来自活性 中心的短的寡核苷酸，其可以通过以技术人员已知的方法与根据本发 明的变位酶或ATPase/GTPase进行比较来决定。但是也可以使用所提 及的核酸的较长片段或完整序列进行杂交。依据所使用的核酸（寡核 苷酸、较长的片段或完整序列）或依据使用何种核酸（DNA或RNA）进 行杂交，这些标准条件可以变化。因此例如，DNA:DNA杂交物的解链 温度比相同长度的DNA:RNA杂交物的低大约10℃。
依据核酸，“标准条件”理解为例如，在42与58℃之间的温度， 在具有0.1-5xSSC(1XSSC=0.15M NaCl，15mM柠檬酸钠，pH7.2) 之间的浓度的水性缓冲溶液中，或者此外在50%甲酰胺存在下，例如， 42℃，在5xSSC中，50%甲酰胺。DNA:DNA杂交物的杂交条件有利地 为0.1xSSC和温度在大约20℃至45℃之间，优选地在大约30℃至 45℃之间。DNA:RNA杂交物的杂交条件有利地为0.1xSSC和温度在 大约30℃至55℃之间，优选地在大约45℃至55℃之间。这些指出的 杂交温度是例如在没有甲酰胺下对具有大约100个核苷酸的长度和 50%的G+C含量的核酸所计算出的解链温度。DNA杂交的实验条件描 述于有关的遗传学教科书，例如Sambrook等人，"Molecular Cloning″， Cold Spring Harbor Laboratory，1989中，并且可以根据技术人员 已知的公式（例如取决于核酸的长度、杂交物的类型或G+C含量） 进行计算。
“严谨条件”在Northern印迹技术例如表示使用在50-70℃， 优选地60-65℃的洗涤溶液，例如含有0.1％SDS的0.1xSSC缓 冲液(20xSSC:3M NaCl，0.3M柠檬酸钠，pH7.0)，以洗脱非特异 性地杂交的cDNA探针或寡核苷酸。在这过程中，只有高度互补的核酸 保持相互结合。设定严谨条件是技术人员已知的并且在例如Ausubel 等人，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons, N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中作了描述。
包含与MeaB蛋白同源的蛋白质序列的蛋白质的根据本发明的用 途尤其表示在微生物或在其细胞提取物中的用途。
为此优选的是，包含与MeaB蛋白同源的蛋白质序列的蛋白质相比 于微生物的野生型而言在该微生物中的存在得到增强。
“得到增强”也表示在修饰之前，野生型不具有包含与MeaB蛋白 同源的蛋白质序列的蛋白质。
所述增强优选地通过引入包含核酸序列的外源核酸而实现，所述 核酸序列编码包含与MeaB蛋白同源的蛋白质序列的蛋白质。
因此，在本发明中的“野生型”表示在将外源核酸引入微生物之 前的起始微生物。
原则上，所述增强可以通过下述来实现，即增加一种或多种基因 序列的拷贝数，所述基因序列编码包含与MeaB蛋白同源的蛋白质序列 的蛋白质；通过使用增强的启动子；和任选地，组合这些方法。
所述外源核酸优选地是表达载体，特别是染色体外复制的表达载 体，其中启动子确保包含与MeaB蛋白同源的蛋白质序列的蛋白质的表 达。
同样优选的是这样的外源核酸，其能够导致编码包含与MeaB蛋白 同源的蛋白质序列的蛋白质的核酸序列整合入微生物的基因组中。在 这种情况下可设想的是，包含与MeaB蛋白同源的蛋白质序列的蛋白质 的表达通过微生物自己的启动子得以确保，或者也可以是所整合的核 酸自身携带对包含与MeaB蛋白同源的蛋白质序列的蛋白质的表达起 积极作用的启动子。
用于特定目标生物的合适表达载体和整合盒是技术人员已知的。 备选地，在根据本发明的用途中，包含与MeaB蛋白同源的蛋白质序列 的蛋白质还可以在微生物的细胞提取物中的存在得到增强，例如通过 向所述细胞提取物直接添加所述蛋白质或通过添加适合于所述蛋白质 的体外翻译混合物。
包含与MeaB蛋白同源的蛋白质序列的蛋白质相比于野生型而言 的增强可以用常规方法进行测定。因此，可以通过下列方式来分析蛋 白质浓度：用对于待检测的蛋白质特异的抗体来进行Western-印迹杂 交（Sambrook等人,Molecular Cloning：a laboratory manual，第 二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, N.Y.USA,1989），随后用用于浓度测定的合适软件来进行光学评价 [Lohaus和Meyer(1989)Biospektrum,5:32-39；Lottspeich(1999), Angewandte Chemie 111:2630-2647]。
根据本发明的用途在微生物或在其细胞提取物中，优选地所述微 生物以及如上文对包含与MeaB蛋白同源的蛋白质序列的蛋白质所描 述的3-羟基羧酸-CoA-变位酶得到增强。同样的情况适合于在细胞提 取物中所述蛋白质的增强。
在这种情况下，优选的微生物是在下文与用于制备2-羟基异丁酸 的根据本发明的方法相关进行描述的那些。
根据本发明，优选地使用3-羟基羧酸-CoA-变位酶，其可以从选 自下述的微生物分离：Aquincola tertiaricarbonis L108、Aquincola tertiaricarbonis DSM 18028、Aquincola tertiaricarbonis DSM 18512、Methylibium petroleiphilum PM1、Methylibium物种R8、 自养黄色杆菌Py2、类球红细菌ATCC 17029、类诺卡氏菌属物种 JS 614、栖藻海杆菌DG893、苜蓿中华根瘤菌WSM419、玫瑰变色菌属 物种217、激烈火球菌DSM 3638、肉桂地链霉菌（Streptomyces cinnamonensis）和天蓝色链霉菌（Strep tomyces coelicolor）， 特别优选的是在PCT/EP2007/052830中描述的辅酶B12依赖性变位酶。
优选的3-羟基羧酸-CoA-变位酶可以在美国国家生物技术信息中 心（National Center for Biotechnology Information）的数据库 中以下列登录号找到：
ABM97311和ABM97308.1(M.petroleiphilum PM1)
YP_001045519和YP_001045516(类球红细菌ATCC 17029)
YP_001409455和YP_001409452(自养黄色杆菌Py2)
YP_923327和YP_923324(类诺卡氏菌属物种JS614)
YP_001313797和YP_001313799(苜蓿中华根瘤菌WSM419)
ZP_01035346和ZP_01035348(玫瑰变色菌属物种217)
NP_579206(激烈火球菌DSM 3638)
ZP_01892066和ZP_01892069(栖藻海杆菌DG893)
AAC08713和CAB59633(肉桂地链霉菌),
CAB40912和NP_628957(天蓝色链霉菌A3(2))，
以及特别是SEQ ID No.21和SEQ ID No.22(以ABD93936和 ABD93937不完整地列出，A.tertiaricarbonis DSM 18512)。
在这方面，根据本发明优选的3-羟基羧酸-CoA-变位酶与在 PCT/EP2007/052830中描述的变位酶的小或大亚基的氨基酸序列（SEQ ID No.21和SEQ ID No.22）具有在氨基酸水平上至少60%,优选地 至少80%,特别优选地至少95%,十分特别优选地至少99%,特别是100% 的序列同一性。
根据本发明，优选地，与MeaB蛋白同源的蛋白质序列可以衍生自 下列：
SEQ ID No.1(Aquincola tertiaricarbonis DSM 18512),
YP_001023545(Methylibium petroleiphilum PM1),
YP_001409454(自养黄色杆菌Py2),
YP_001045518(类球红细菌ATCC 17029),
YP_002520048(类球红细菌),
AAL86727(扭脱甲基杆菌AM1)。
根据本发明特别优选的是，与MeaB同源的蛋白质序列包含与相关 MeaB蛋白本身相同的氨基酸数目。
根据本发明，优选地使用包含与MeaB蛋白同源的蛋白质序列的蛋 白质作为下文描述的根据本发明的融合蛋白，所述蛋白质导致3-羟基 羧酸-CoA-变位酶的酶促活性的增加。
因此，包含3-羟基羧酸-CoA-变位酶和与MeaB蛋白具有至少60%, 优选地至少80%,特别优选地至少95%,十分特别优选地至少99%,特别 是100%的序列同一性的至少100个，优选地至少200个，特别是至少 300个氨基酸的蛋白质序列的融合蛋白为解决开头提及的目的作出了 贡献。
术语“融合蛋白”根据本发明表示，至少一条对于3-羟基羧酸 -CoA-变位酶活性必需的多肽链包含有另外的蛋白质序列，所述多肽链 与MeaB蛋白具有的所需序列同一性。因为3-羟基羧酸-CoA-变位酶可 以是寡聚蛋白质，因此术语“融合蛋白”也表示蛋白质复合体，其例 如由3-羟基羧酸-CoA-变位酶的多个不同亚基构成，其中所述亚基之 一另外具有MeaB同源氨基酸序列。优选地，根据本发明的融合蛋白是 经分离的融合蛋白。
优选地，根据本发明的融合蛋白包含3-羟基羧酸-CoA-变位酶， 其对于上面提及的根据本发明的用途是优选的；优选地，这同样适合 于在根据本发明包含的与MeaB蛋白同源的蛋白质序列。
可以将与MeaB蛋白同源的蛋白质序列这样安排于融合蛋白中，使 得它紧在3-羟基羧酸-CoA-变位酶上游（N-末端），或在寡聚3-羟基 羧酸-CoA-变位酶的情况下，紧在3-羟基羧酸-CoA-变位酶的一个亚基 上游，或者在3-羟基羧酸-CoA-变位酶或其一个亚基下游（C-末端）。
优选地，与MeaB蛋白同源的蛋白质序列以N-末端与3-羟基羧酸 -CoA-变位酶，优选地与3-羟基羧酸-CoA-变位酶的大亚基相融合。
在与MeaB蛋白同源的蛋白质序列和3-羟基羧酸-CoA-变位酶之间 可以存在另外的氨基酸。这样的“连接子”可以是有利地，因为它们 可以影响蛋白质的三维排列。位于与MeaB蛋白同源的蛋白质序列和 3-羟基羧酸-CoA-变位酶之间的连接子具有4至20个，优选地6至12 个，特别是8个氨基酸。已经证明由氨基酸序列Cys Ala Gly Ser Phe Pro Thr Ile（SEQ ID No.2）组成的连接子是特别有利的。
根据本发明优选的融合蛋白的特征在于选自下列的3-羟基羧酸 -CoA-变位酶：SEQ ID No.21和22(A.tertiaricarbonis DSM 18512) 以及ABM97311和ABM97308.1(M.petroleiphilum PM1)，
并且，与MeaB蛋白同源的蛋白质序列与3-羟基羧酸-CoA-变位酶 的大亚基以N-末端融合，所述与MeaB蛋白同源的蛋白质序列可以衍 生自下列：SEQ ID No 1(A.tertiaricarbonis DSM 18512), YP_001023545(M.petroleiphilum PM1),
其中所述连接子由氨基酸序列Cys Ala Gly Ser Phe Pro Thr Ile 组成。
特别地，优选的融合蛋白的特征在于异源二聚体蛋白质，所述异 源二聚体蛋白质包含SEQ ID No.3和SEQ ID No.4，特别是由SEQ ID No.3和SEQ ID No.4组成。
用于产生编码根据本发明的融合蛋白的合适核酸构建体的分子生 物学方法是技术人员已知的并且例如在Joseph Sambrook等人的标准 著作“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”(第三版)中可以 获悉。因此，可以通过例如PCR方法扩增编码待融合的蛋白质片段的 核酸，提供核酸内切酶切割位点并通过合适的限制酶切和连接的组合 进行连接。备选地，可以例如通过SOE-PCR[交错延伸剪接－聚合酶 链式反应（splicing by overlap extension-polymerase cha in reaction)）来产生核酸，其融合两个编码基因并且例如，此外测定连 接子的长度。
简化地，如今这样的核酸已经被商业服务提供者人工地合成了， 其中已经可以针对待使用的生物对密码子使用进行优化。
因此，编码根据本发明的融合蛋白的分离的核酸序列（单链和双 链DNA和RNA序列，例如DNA、cDNA和mRNA）为解决开头提及的目的 作出了进一步的贡献。
“编码”在此表示具有密码子使用的遗传密码，如例如在大肠杆 菌（E.Coli）中可以发现的那样；但是，也可以设想非常规的密码子 使用的情况，例如在四膜虫属（Tetrahymena）、疟原虫属（Plasmodium）、 肺炎分支杆菌（Mycobacterium pneumoniae）或热带假丝酵母（Candida tropicalis）中的，可以产生根据本发明的融合蛋白。这些核酸也被 认为“编码根据本发明的融合蛋白”。
根据本发明的优选的核酸编码根据本发明的优选的融合蛋白。
特别地，具有SEQ ID No.5的核酸是特别优选的。
本发明还包括与所描述的核酸序列互补的核酸分子。
一种用于酶促制备2-羟基异丁酸的方法为解决上面提出的目的 作出了进一步的贡献，所述方法包括下列步骤：
a)使
a1)具有3-羟基羧酸-CoA-变位酶的酶促活性的微生物或所述微 生物的细胞提取物，其中包含与MeaB蛋白同源的蛋白质序列的蛋白 质相比于微生物的野生型而言在所述微生物中或在细胞提取物本身中 的存在得到增强，或者
a2)具有根据本发明的融合蛋白的单元，
与包含3-羟基异丁酸的水性介质相接触，以及任选地，
b)从水性介质或从具有融合蛋白的单元纯化2-羟基异丁酸。
显而易见的是，也可以使用根据a1)的各种微生物或其提取物的 混合物，根据a2)的各种具有根据本发明的融合蛋白的单元的混合物， 以及其组合。
优选地，a2)中的具有融合蛋白的单元是微生物或其细胞提取物。
通常，这些微生物如此地经基因工程改造，从而它本身产生根据 本发明的融合蛋白。这例如通过用表达载体转化所述微生物来实现， 所述表达载体包含根据本发明的核酸。
在a1)或a 2)中合适的微生物是细菌、酵母或真菌，特别是以细菌、 酵母或真菌菌株形式保藏于德意志微生物和细胞培养物保藏中心 （Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkul turen GmbH (DSMZ),Brauns chweig,德国）中的合适的那些细菌、酵母或真菌。 根据本发明合适的细菌属于在 http://www.dsmz.de/species/bacteria.htm中所列出的那些种属， 根据本发明合适的酵母属于在http://www.dsmz.de/species/ yeasts.htm中所列出的那些种属，和根据本发明合适的真菌属于在 http://www.dsmz.de/species/fungi.htm中所列出的那些种属。在 a1)或a2)中的根据本发明的优选的微生物是下列属的那些：曲霉属 （Aspergillus）、棒杆菌属（Corynebacterium）、短杆菌属 （Brevibacterium）、芽孢杆菌属（Bacillus）、不动杆菌属 （Acine tobacter）、产碱菌属（Alcaligenes）、乳杆菌属 （Lactobacillus）、副球菌属（Paracoccus）、乳球菌属 （Lactococcus）、假丝酵母属（Candida）、毕赤酵母属（Pichia）、 汉逊酵母属（Hansenula）、克鲁维酵母属（Kluyveromyces）、糖酵 母属（Saccharomyces）、埃希氏菌属（Escherichia）、发酵单胞菌 属（Zymomonas）、耶氏酵母属（Yarrowia）、甲基杆菌属 （Methylobacterium）、罗尔斯通氏菌属（Ralstonia）、假单胞菌属 （Pseudomonas）、红螺菌属（Rhodospirillum）、红细菌属 （Rhodobacter）、伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia）、梭菌属 （Clostridium）和贪铜菌属（Cupriavidus）以及产乙酸微生物，其 中构巢曲霉（Aspergillus nidulans）、黑曲霉（Aspergillus niger）、 广泛产碱菌（Alcaligenes latus）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、黄色短杆菌 （Brevibacterium flavum）、乳发酵短杆菌（Brevibacterium lactofermentum）、大肠杆菌、酿酒糖酵母（Saccharomyces cerevisiae）、乳酸克鲁维酵母（Kluveromyces lactis）、布兰克 假丝酵母（Candida blankii）、皱落假丝酵母（Candida rugosa）、 谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）、有效棒杆菌 （Corynebacterium efficiens）、运动发酵假单胞菌（Zymomonas mobilis）、解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）、多形汉逊酵母 （Hansenula polymorpha）、扭脱甲基杆菌、富养罗尔斯通氏菌 （Ralstonia eutropha）、凯伍热厌氧菌（Thermoanaerobacter kivui）、伍氏醋酸杆菌（Acetobacterium woodii）、潮湿厌氧醋酸 菌（Acetoanaerobium notera）、醋酸梭菌（Clostridium aceticum）、 食甲基丁酸杆菌（Butyribacterium methylotrophicum）、丙酮丁醇 梭菌（Clostridium acetobutylicum）、热醋穆尔氏菌（Moorella thermoacetica）、粘液真杆菌（Eubacterium limosum）、产生消化 链球菌（Peptostreptococcus productus）、扬氏梭菌（Clostridium ljungdahlii）和食羰基化物梭菌（Clostridium carboxidi vorans）, 特别是富养罗尔斯通氏菌H16、富养罗尔斯通氏菌H16PHB-4、深红红 螺菌（Rhodospirillum rubrum）、类球红细菌、善变副球菌（Paracoccus versutus）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、恶臭假单 胞菌（Pseudomonas putida）、乙酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）和巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是特别优选 的。
a1)或a2)中的微生物能够优选地从碳源合成3-羟基异丁酸。作为 提供3-羟基异丁酸的微生物，特别合适的是在WO2007/110394和 DE102008002715中描述的那些。特别是在DE102008002715中，技术 人员发现这样的指导，用其可以用重组方法提高来自碳源的3-羟基异 丁酸的产量。
作为碳源，可以使用例如碳水化合物[例如单糖（例如葡萄糖、果 糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖）、寡糖（例如麦芽糖、蔗糖、乳糖) 和多糖（例如淀粉、经水解处理的淀粉、纤维素、经水解处理的纤维 素、半纤维素、经水解处理的半纤维素）]，以及其反应产物，例如糖 醇和多羟基酸；二氧化碳、一氧化碳、废气或合成气；任选地携带1 个或多个（例如1、2、3或4个）羟基的有机的单、二和三羧酸，例 如乙酸、酒石酸、衣康酸、琥珀酸、丙酸、乳酸、3-羟基丙酸、富马 酸、马来酸、2,5-呋喃二羧酸、戊二酸、乙酰丙酸、葡糖酸、乌头酸、 琥珀酸和二氨基庚二酸、柠檬酸；脂质；油或脂肪，例如菜籽油、大 豆油、棕榈油、向日葵油、花生油和椰子油；具有优选地10至22个 碳的饱和和不饱和脂肪酸，例如γ-亚麻酸、二高-γ-亚麻酸、花生四 烯酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、月桂酸、亚油酸、二十碳五烯酸和二 十二碳六烯酸；烃，例如具有一个或多个双或三键的具有1至22个碳 的烃，例如甲烷、乙烷、乙烯(ethene)、乙烯（ethylene）、十二烷、 十八烷；醇，例如具有1至22个碳的醇，例如丁醇、甲醇、乙醇；具 有优选地3至8个碳的二醇，例如丙二醇和丁二醇；具有3个或更多 个（例如3、4、5或6个）OH基团的多元（也称为高价）醇，例如甘 油、山梨醇、甘露醇、木糖醇和阿拉伯糖醇；具有优选地3至10个碳 和任选地1个或多个羟基的酮，例如丙酮和3-羟基丁酮；内酯，例如 γ-丁内酯，环糊精，生物聚合物，例如聚羟基乙酸，聚酯，例如聚交 酯，多糖，聚类异戊二烯，聚酰胺；芳香化合物，例如芳香胺、香草 醛和靛蓝；蛋白质，例如酶，例如淀粉酶，果胶酶，酸性、杂合或中 性纤维素酶，酯酶（例如脂肪酶），胰酶，蛋白酶，木聚糖酶，和氧 化还原酶（例如漆酶、过氧化氢酶和过氧化物酶），葡聚糖酶，植酸 酶；类胡萝卜素，例如番茄红素、β-胡萝卜素、虾青素、玉米黄素和 角黄素；成蛋白质性和非成蛋白质性氨基酸，例如赖氨酸、谷氨酸、 甲硫氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、色氨酸和苏氨酸；嘌呤和嘧啶碱基； 核苷和核苷酸，例如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）和腺苷-5′-单磷酸 （AMP）;以及上述化合物的前体和衍生物，例如在所述酸的情况下为 其盐。
这些物质可以单独地或者作为混合物进行使用。特别优选的是使 用碳水化合物，特别是单糖、寡糖或多糖（如例如在US6,136,576 中所描述的）；使用C5-糖；或者使用甘油。甲醇是优选的待使用的醇， 这是因为它可以由许多各种不同来源例如沼气、生物质、天然气或煤 来制备。
可以在处理（蒸汽爆破、酸预处理、酶预处理）之前或之后，从 不同的加工阶段（例如甘蔗汁，糖浆，糖蜜，粗糖，砂糖；玉米粒， 面粉，淀粉，糊精，葡萄糖），以不同的形式（纯的或者以溶液/悬浮 液）和以不同的组成（纯化的或作为粗产物）来使用碳源。
在根据本发明的方法的一个优选的备选实施方案中，从其合成3- 羟基异丁酸的碳源包括CO2或CO，特别是合成气或废气。为此使用的 a1)或a2)中的微生物为产乙酸微生物，例如醋酸杆菌属 （Acetobacterium）的物种，例如伍氏醋酸杆菌（A.Woodii）和醋酸 梭菌。更具体而言，所述产乙酸细胞选自潮湿厌氧醋酸菌、伍氏醋酸 杆菌、闪烁古生球菌（Archaeoglobus fulgidus）、食甲基丁酸杆菌、 食甲基丁酸杆菌、Carboxydibrachium pacificus、Carboxydocella sporoproducens、Carboxydocella thermoautotrophica、生氢氧化 碳嗜热菌（Carboxydothermus hydrogenoformans）、柠檬酸杆菌属 物种（Citrobacter sp.）Y19、醋酸杆菌、丙酮丁醇梭菌、自养产乙 烷梭菌（Clostridium autoethanogenum）、食羰基化物梭菌、扬氏 梭菌、食羰基化物脱硫肠状菌（Desulfotomaculum carboxydivorans）、 库氏脱硫肠状菌（Desulfotomaculum kuznetsovii）、热苯脱硫肠状 菌嗜热互营亚种（Desulfotomaculum thermobenzoicum subsp.thermosyntrophicum）、粘液真杆菌、噬乙酸甲烷八叠球菌 （Methanosarcina acetivorans）C2A、巴氏甲烷八叠球菌 （Methanosarcina barkeri）、热自养甲烷嗜热杆菌 （Methanothermobacter thermoautotrophicus）、穆尔氏菌属 （Moorella）AMP、热醋穆尔氏菌（Moorella thermoacetica）、热 自养穆尔氏菌（Moorellathermoautotrophica）、普氏醋菌（Oxobacter pfennigii）、产生消化链球菌、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)P4、深红红螺菌、胶状红长命菌（Rubrivivax gelatinosus）、Thermincola carboxydiphila、Thermincola ferriacetica、热球菌属（Thermococcus）AM4、食羰基化物热石杆 菌（Thermolithobacter carboxydivorans）和凯伍热厌氧菌。在这 种情况下，特别合适的细胞为食羰基化物梭菌，特别是诸如“P7”和 “P11”这样的菌株。这样的细胞例如在US2007/0275447和US 2008/0057554中进行了描述。进一步的、在这种情况下特别合适的细 胞为扬氏梭菌，特别是选自扬氏梭菌PETC、扬氏梭菌ERI2、扬氏梭菌 C0l和扬氏梭菌O-52的菌株，并且它们在WO98/00558和WO00/68407 中进行了描述。
根据本发明的方法是优选的，其中从碳源合成3-羟基丁酸和从3- 羟基丁酸合成2-羟基异丁酸在单一步骤中完成。
也可以将在根据本发明的方法中使用的、具有融合蛋白的单元以 微生物的提取物，因此以从微生物纯化的、浓缩的和/或分离的形式， 引入反应中。
因此，对于本发明的目的，可以将具有融合蛋白的单元既以完整 的微生物的形式，也以经渗透化的微生物的形式用于根据本发明的方 法中，作为催化剂。其它可能的用途是以来自微生物细胞提取物的成 分（一种或多种）的形式，也以部分纯化的或纯化的形式。任选地， 根据本发明，使用合成CoA-酯的酶，例如CoA-转移酶或CoA-合成酶。 酶催化剂可以经固定化或者附着至溶解或未溶解的支持物质。
在一个优选的变体实施方式中，使特定的细胞区室或其部分相互 分开或联合，即可以组合或分开能够正向或负向地影响具有融合蛋白 的单元的活性的碳水化合物结构、脂质或蛋白质和/或肽以及核酸。为 了有意地利用这样的影响，从微生物例如专业地制备粗提取物，其任 选地，进行离心以便能够用沉淀或上清液进行根据本发明的反应。
通过根据本发明的方法获得的2-羟基异丁酸可以根据条件，以其 盐或者以聚羟基链烷酸的形式存在，其中2-羟基异丁酸作为功能单体 而储备。
根据本发明制备的2-羟基异丁酸可以在去除未溶解的组成成分 例如微生物细胞之后通过水性介质的处理，用已经知晓的方法进行分 离。这样的方法特别是例如浓缩、离子交换、蒸馏、电渗析、抽提和 结晶。可以以盐或（在酸化后）以质子化的2-羟基异丁酸分离产物。
用于分离的方法是技术人员本身已知的，他可以在 DE102008002715找到详细的和特别的指导。
有利地，可以使用根据本发明的方法获得的2-羟基异丁酸以制备 甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯或其聚合物，通过脱水以及任选的酯化和 任选的多聚化。
用于脱水、酯化和多聚化的方法是技术人员本身已知的，他可以 在DE102008002715中找到详细的和特别的指导。
在下文的实施例中示例性地描述了本发明，而不应当把本发明限 制在实施例中所提及的实施方案中，本发明的应用范围产生于全部说 明书和权利要求书。
下面的附图是实施例的组成部分：
图1:杂合质粒pBBR1MCS-2::Mutase-Operon。
图2:杂合质粒pBBR1MCS-2::Mut_At_delhcl。
图3:杂合质粒pBBR1MCS-2::meaBhcmA-hcmB。
图4:重组富养罗尔斯通氏菌H16PHB-4菌株的2D-聚丙烯酰胺凝 胶(pH4-pH7)。
图5:在培养各种不同的重组富养罗尔斯通氏菌H16PHB-4菌株 中培养上清液中的绝对2-HIB-浓度。在生产培养基中在6h、21h、24h、 28h、48h、52h和120h后，获取样品并用离子交换色谱法（IC）进行 分析。
图6:在培养各种不同的重组富养罗尔斯通氏菌H16PHB-4菌株 中培养上清液中的2-HIB浓度/OD600。在生产培养基中在6h、21h、24h、 28h、48h、52h和120h后，获取样品并用IC进行分析。
实施例:
1.基因组DNA的分离和包含基因hcmB、hcl、meaB和hcmA的 Mutase-Operon的扩增
根据制造商的说明用DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen GmbH, Hilden)从Aquincola tertiaricarbonis DSM 18512菌株分离基因 组DNA并且作为PCR的模板用于Mutase-Operon的扩增。引物衍生自 生物Methylibium petroleiphilum PM1质粒RPME01(NCBI登录号: CP000556.1)的序列，这是因为在操纵子中包含的基因hcmA(icmA)和 hcmB(icmB)的核苷酸序列与Aquincola tertiaricarbonis DSM 18512 的那些核苷酸序列的相似性>97%。为此，使用寡核苷酸UPicmB_fw 5’-CAGCGACTTGCAACCTTCTTCACCGG-3’(正向引物,SEQ ID No.8)和 ICM5,4-PMI_rev 5’-GTATCAGTCGCTCCGACTTGCCGATCC-3’(反向引物, SEQ ID No.9)以扩增位于之间的基因。
用Pfu聚合酶(Promega,Madison,USA)来进行聚合酶链式反应 (PCR,根据SAIKI等人,1985,Enzymatic amplification of β-globin genomic SEQs and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.Science 230:1350-1354.)。为 此，进行35个循环，每个循环在95℃下60秒，在65℃下30秒和在 72℃下8分钟。PCR的进行在热循环仪(Primus 96advanced;PEQLAB Biotechnologie GMBH,Erlangen，德国)中实现。
用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen GmbH,Hilden)根 据制造商的说明来纯化片段。
2.富养罗尔斯通氏菌表达载体的制备
根据制造商的说明，将经纯化的PCR片段“Mutase-Operon”(大 约5.4kbp)连接到pET101/D-TOPO载体(Invitrogen GmbH, Karlsruhe，德国)中。将所获得的杂合质粒 pET101/D-TOPO::Mutase-Operon转移到感受态大肠杆菌DH5α细胞 (New England Biolabs,Frankfurt，德国)中，并通过限制酶切和测 序进行检查。
此外，根据制造商(Invitrogen GmbH,Karl sruhe)的说明，将PCR 产物克隆到pCR-BluntIITOPO质粒中，将所获得的杂合质粒 pCR-BluntIITOPO::Mutase-Operon转移到感受态大肠杆菌DH5α细胞 (New England Biolabs,Frankfurt)中，并通过限制酶切和测序进行 检查。
为了达到在富养罗尔斯通氏菌菌株中进行表达，必须将构建体克 隆到合适的泛宿主性（broad-host-range）载体中。所使用的载体为 pBBR1MCS-2，其描述于KOVACH等人，(1995).Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS carrying different antibiotic-resistance cassettes.Gene,166:175-176。
为此，用酶EcoRV和SpeI对质粒 pCR-Blunt IITOPO::Mutase-Operon和pBBR1MCS-2进行限制酶切，并 将片段Mutase-Operon连接到目标载体pBBR1MCS-2中，并且用所产生 的杂合质粒pBBR1MCS-2::Mutase-Operon（图1，SEQ ID No.6）转 化感受态大肠杆菌DH5细胞（New England Biolabs,Frankfurt）。
通过限制酶切和测序对该质粒进行检查，并借助于电穿孔 (2.43kV,25μF,200Ω)将其引入感受态富养罗尔斯通氏菌H16 PHB-4[重归类为钩虫贪铜菌（Cupriavidus necator），DSM 541]中。 获得包含质粒pBBR1MCS-2::Mutase-Operon的转化体。
为了删除hcl基因（其编码假定的2-HIB-CoA-连接酶），进行突 变PCR和随后的融合PCR。
对于突变PCR，使用下列引物：
片段A(1228_pCOLAD_fp1×1251_hcl_del-)用引物 1228_pCOLAD_fp1:5’-GGA ATT GTG AGC GGA TAA-3’SEQ ID No.10和 1251_hcl_del-:5’-CAG CGC CCC GGG ATA CTC GAC CGG AAA GTT CC-3’ SEQ ID No.11进行扩增,
片段B(1251_hcl_del+×1251_nach_StuI)用引物 1251_hcl_del+5’-GAG TAT CCC GGG GCG CTG AAC CAG CAA CTG-3’SEQ ID No.12和1251_nach_S tuI 5’-ATG GCC TGG ATC TCG TCT C-3’SEQ ID No.13进行扩增。
融合PCR(见上:35个循环，每个循环95℃60秒,65℃30秒 和72℃7分钟)用引物1228_pCOLAD_fp1和1251_nach_StuI来进行， 并将PCR产物经由HindIII/StuI克隆回起始载体pBBR1MCS-2中。将 所获得的杂合质粒pBBR1MCS-2::Mut_At_delhcl(图2)通过限制酶 切和测序进行检查。
3.片段hcmA、meaB和hcmB的扩增；MeaB(N-末端)和HcmA(C- 末端)的编码区的融合
使用在实施例2中所描述的质粒pBBR1MCS-2::Mut_At_delhcl作 为用于扩增片段hcmA(1.7kbp;DQ436456)、hcmB(0.4kbp;DQ436457) 以及称为meaB的片段(1kbp)的PCR的模板。
为了融合MeaB(N-末端)和HcmA(C-末端)的编码区，必须修饰 hcmA的起始密码子和meaB的终止密码子。寡核苷酸MeaB_NsiI_fw 5’-ATAGCAATGCATGACCGGAACTTACGTTCCC-3’(正向引物；NsiI切割 位点标有下划线；起始密码子被加粗，SEQ ID No.14)和 MeaBFus_HindIII_rev 5’-ACTTTAAGCTTGGCAGCCAGGTCATTCG-3’(反 向引物；HindIII-切割位点标有下划线；经修饰的终止密码子被加粗， SEQ ID No.15)用于扩增meaB(1kbp)。
使用引物hcmAFus_HindIII_fw 5’-AAAAAGCTTACCACCTGGCTTGAGCCG-3’(HindIII切割位点标有下划 线；经修饰的终止密码子被加粗，SEQ ID No.16)和引物hcmA_SpeI_rev 5’-ATACCGACTAGTGCGAAGACCGGCGTCTC-3’(SpeI切割位点标有下划 线，经修饰的终止密码子被加粗,SEQ ID No.17)进行hcmA(1.7kbp) 的扩增。
使用寡核苷酸hcmB_SpeI_fw 5’-AAATCTACTAGTTGGAGATCCCACCGACCAAATCCCG-3’(正向引物；SpeI 切割位点标有下划线，起始密码子被加粗，SEQ ID No.18)和 hcmB_SacI_rev5’-TAGGCTGAGCTCCAAGCTTCGAATTGAGCTCGCCCTTG-3’ (反向引物；SacI切割位点标有下划线，终止密码子被加粗，SEQ ID No. 19)来扩增片段hcmB(0.5kbp)。
用PhusionTMHigh-Fidelity PCR Master Mix(Finnzymes,Espoo, Finland)来进行聚合酶链式反应(PCR,根据SAIKI等人,1985, Enzymatic amplification of β-globin genomic SEQs and restriction sitean alysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230:1350-1354.)。在起始变性(30秒;98℃)后，进行35个 循环，每个循环为在98℃下10秒,在65℃下30秒和在72℃下1分 钟。对于最后的延伸，将混合物在72℃下温育10分钟。PCR在热循环 仪(Primus 96 advanced;PEQLAB Biotechnologie GmbH,Erlangen) 上进行。
借助于凝胶电泳分开PCR混合物，用QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen GmbH,Hilden)根据制造商的说明从凝胶纯化1kbp的 meaB片段，并且随后用NsiI和HindIII进行限制酶切。借助于 QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen GmbH,Hilden)根据制造 商的说明直接从PCR混合物纯化1.7kbp的hcmA片段，并且用 HindIII和SpeI进行限制酶切。将两个混合物经由HindIII-切割位 点进行连接。
将连接产物meaBhcmA(2.7kbp)作为SOE-PCR的模板使用，用寡 核苷酸MeaB_NsiI_fw 5’-ATAGCAATGCATGACCGGAACTTACGTTCCC-3’ (NsiI切割位点标有下划线；起始密码子被加粗，SEQ ID No.14)和 hcmA_Spe I_rev 5’-ATACCGACTAGTGCGAAGACCGGCGTCTC-3’(SpeI切割 位点标有下划线；终止密码子被加粗，SEQ ID No.17)(30秒,98℃ 起始变性;35个循环，每个循环在98℃下10秒,在65℃下30秒和 在72℃下1分钟;最终的延伸在72℃下10分钟)。将所获得的相应大 小的PCR产物借助于凝胶电泳分开、分离并用QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen GmbH,Hilden)进行纯化。
完成PCR后，用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen GmbH, Hilden)纯化hcmB片段并用SpeI和SacI进行限制酶切。
4.富养罗尔斯通氏菌表达载体的制备
将经纯化的meaBhcmA融合片段（2.7kbp）连接入任选地用两种限 制性核酸内切酶进行限制酶切的泛宿主性载体（broad-host-range Vector）pBBR1MCS-2中。将所获得的杂合质粒pBBR1MCS-2::meaBhcmA 转移到感受态大肠杆菌DH5α细胞(New England Biolabs,Frankfurt) 中，并通过限制酶切和测序进行检查。此外，将hcmB克隆到载体中。 为此将载体pBBR1MCS-2::meaBhcmA用SpeI和SacI进行限制酶切。 将所纯化的hcmB片段连接到该载体中并随后将一等份连接混合物转 移到DH5α细胞(New England Biolabs,Frankfurt)中。将所获得的 杂合质粒pBBR1MCS-2::meaBhcmA-hcmB-P通过限制酶切和测序进行 检查。
由于在pBBR1MCS-2的插入物中所包含的众多切割位点，而另一方 面在pBBR1MCS-2的多克隆位点(MCS)中少数的剩余独特切割位点，作 为产生杂合质粒的切割位点必须使用NsiI。NsiI切割位点位于启动子 区的上游，以至于在克隆过程中，启动子被从载体移除。为了进行转 录，用寡核苷酸MeaB_RBS_fw 5’-AAATTTAGATCTGGAGACCGGAACTTACGTTCCC-3’(起始密码子被加 粗，SEQ ID No.20)和hcmB_SacI_rev 5’-TAGGCTGAGCTCCAAGCTTCGAATTGAGCTCGCCCTTG-3’(SacI-切割位 点加下划线；终止密码子被加粗，SEQ ID No.19)在借助于PhusionTMHigh-Fidelity PCR Master Mix(Finnzymes,Espoo,Finland)提供 的PCR(30秒,98℃起始变性;35个循环，每个循环在98℃下10 秒,在65℃下30秒和在72℃下1分钟；最终的延伸，在72℃10分钟) 中扩增整个载体meaBhcmA-hcmB-P(3.1kbp)。纯化PCR产物并如空载 体pBBR1MCS-2那样，用EcoRV和SacI进行限制酶切。在将线性化的 载体与meaBhcmA-hcmB连接后，进行大肠杆菌DH5α(New England Biolabs,Frankfurt)的转化。将质粒通过限制酶切和测序进行检查。
将载体pBBR1MCS-2::meaBhcmA-hcmB(图3,SEQ ID No.7)借助 于电穿孔(2.43kV,25μF,200Ω)引入富养罗尔斯通氏菌H16 PHB-4(重归类为钩虫贪铜菌,DSM 541)中。通过该方法可以获得携带 质粒的转化体。
5.在重组的富养罗尔斯通氏菌细胞中产生2-羟基异丁酸
为了生产生物质，将在实施例2至4中描述的携带质粒的富养罗 尔斯通氏菌在具有100ml生物质生产培养基(经修饰的 MSM-Schlegel-培养基:0.36％(w/v)NH2HPO4;0.15％(w/v)KH2PO4; 0.1％(w/v)NH4Cl;1%(w/v)酵母提取物,0.8mM MgSO4×7H2O;0.1mM CaCl2×2H2O;37μMFeCl3;痕量元素溶液(10×;Pfennig和Lippert, 1966),0.1％(v/v))的锥形瓶中进行培养。此外，给培养基另外补充 1.5％(w/v)果糖和300μg/ml卡那霉素。该培养在30℃和180rpm下 在恒温摇床中进行大约18小时。
为了诱导氮限制，离心分离(20℃;最大4000×g,15分钟)生 物质并随后在生产培养基[经修饰的MSM-Schlegel-培养基:0.36％ (w/v)NH2HPO4;0.15％(w/v)KH2PO4;0.8mM MgSO4×7H2O;0.1mM CaCl2×2H2O;37μMFeCl3;微量元素溶液(10×;Pfennig和Lippert,1966), 0.1％(v/v)]中进行洗涤，并在重新形成沉淀后，重悬浮于50ml生产 培养基中。为了生产2-羟基异丁酸，除了1.5％(w/v)果糖和300μg/ml 卡那霉素外，给培养基还补充76nM CoB12。该培养在30℃,180rpm 下进行六小时，其后再补充1.5％(w/v)果糖和76nM辅酶B12(CoB12)。 120小时后，通过在5000rpm(4℃)下离心收获细胞并将培养上清液 存放在-20℃下直至分析。
在生产培养基（见上）中进行培养期间，取出培养发酵液并离心 沉淀(13,000rpm,4℃)。然后借助于IC、高效液相色谱法（HPLC） 和定量1H-NMR-光谱学（1H-NMR）进行研究。此外，在生产培养基（见 上）中24小时后，收获(13,000rpm,4℃)2ml的培养物。将细胞沉 淀在干冰上送至Toplab(Martinsried，德国)并借助于2D-聚丙烯酰 胺电泳进行研究。借助于MS，可以明确地检测到融合蛋白MeaBhcmA(98 kDa)和HcmB(14.5kDa)两者（图3）。
2-羟基异丁酸的检测和定量借助于IC、HPLC和1H-NMR来进行。 任选地，借助于IC或HPLC分析用ddH2O稀释的培养上清液。在ICS-2000 RFIC(Dionex,Corporation，Synnyvale，USA)中进行色谱分级，使 用RFICTM TonPac柱(2×250mm，柱温度：30℃+预柱AG154×50mm, 流速0.38ml/分钟)。在HPLC(Agilent Technologies 1200 Series， Ratingen，德国)中，使用Biorad(Hercules，USA；0.6ml/分钟流速, 最大400巴，注射体积20μl)的加温至40℃的Aminex柱(HPX-87H， 300×7.8mm)。通过用纯物质校准停留时间进行2-羟基异丁酸峰的鉴 定。为了估计2-羟基异丁酸的含量，使样品掺杂有确定量的纯物质2- 羟基异丁酸。
在所分析的样品中，检测到1.1g/l(在生产培养基中120小时)的 2-羟基异丁酸的最大浓度。这相应于64mg/l/OD600的浓度(图5)。与 此相反，在含有空质粒(pBBR1MCS-2)的相应的对照混合物中，未检测 到2-羟基异丁酸。通过添加纯物质2-羟基异丁酸定性和定量地验证 IC-测量。