技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及一种基因及其合成方法，具体涉及一种猪α干扰素基因及其合成方法。
背景技术
干扰素主要是由动物细胞在病毒等诱生剂的作用下诱导产生的。许多动物，包括人、哺乳动物、鸟类、鱼类等都能产生干扰素。根据干扰素的抗原特性和分子结构分成不同的类型。干扰素（IFN）分为I型和II型，I型干扰素基因缺少内含子，包括α、β、δ、ω、τ 5种类型，II型仅有γ型1种，含有内含子。它们具有相关的结构并共用同一受体（第一受体），第一受体分布相当广泛，包括单核/巨噬细胞、多形核白细胞、B细胞、T细胞、血小板、上皮细胞、内皮细胞与肿瘤细胞等。I型干扰素的表达常因细胞类型和诱导物的不同而异。IFN-α主要由单核吞噬细胞产生，B细胞和成纤维细胞也能合成IFN-α。IFN-β则主要由成纤维细胞产生。而造血细胞则产生IFN-ω。在牛、绵羊胚胎着床的早期，其子宫内膜上皮细胞中能产生大量IFN-τ，它与维持正常妊娠有关。IFN-α、β、δ主要是对病毒感染的应答产生的， 能诱导机体抗病毒蛋门的产生。Ⅱ型干扰素又称免疫干扰素，即IFN-γ，主要由活化的T淋巴细胞（包括TH0、TH1细胞和几乎所有的CD8+T细胞）和NK细胞产生。由于干扰素具广谱、高效抗病毒功能，及其对免疫系统起关键调节作用，因此成为当今免疫学、遗传学和分子生物学研究最为活跃的领域之一。
目前，已经完成了猪α干扰素基因的测序，基于基因工程技术的一系列异源表达猪α干扰素蛋白的工作已经展开。干扰素作为新一代的兽药以其抗病毒作用广泛、残留小、廉价、无污染、无耐药性、无药物残留等优点很快引起了人们的重视。由诱生剂诱导产生的天然猪IFN-α，因来源少、成本高、纯化工艺复杂等诸多原因而价格昂贵，极大的限制了临床和科研的应用，而利用基因工程技术选择一个合适的系统，使其得到高效表达，生产具有廉价、广谱抗病毒活性、无毒害、无残留等优点的干扰素已经无疑是促使干扰素在兽医临床上推广应用的有效途径。
发明内容
本发明要解决的技术问题，是提供一种猪α干扰素基因及其合成方法，所提供的基因能够实现干扰素在毕赤酵母的高表达， 获得具有抗病毒活性的猪α干扰素蛋白；其合成方法不需甲醇诱导，只需采用含葡萄糖的培养基即可表达干扰素，所制备出的猪α干扰素基因抗 VSV活性为 3.82×107U/mg。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
一种猪α干扰素基因，其DNA序列如下所示：
tgtgacctacctcaaacgcattctctagctcatacaagagcactaagactgctggcacaaatgagaagaatctcccctttctcttgtctggatcatagaagagacttcggaagtccacacgaagcttttggaggtaaccaagttcaaaaggctcaagctatggcattggtacatgaaatgctgcagcaaactttccaacttttctccaccgaaggttcagctgctgcatgggatgaatctcttttgcaccaattttgtaccggtttggatcagcagttgagagacttggaagcttgcgttatgcaggaagctggcttagaagggactccattgttagaagaggattctatattggccgttcgaaaatactttcacaggttaactttgtatcttcaggagaagagttatagtccctgcgcctgggagattgtccgtgccgaggtgatgaggtccttttcttcatcacgtaatcttcaggatcgtttacgaaagaaagagtaa。
本发明还提供了上述猪α干扰素基因的合成方法，它按照以下步骤顺序进行：
(1) 登录 GeneBank，查找编码猪 α 干扰素成熟蛋白的基因序列 ；
(2) 将猪α干扰素的编码密码子与毕赤酵母X-33偏好密码子进行比对， 根据密码子的兼并性，将猪α干扰素密码子替换为毕赤酵母X-33偏好的密码子 ；
(3) 将替换后的序5′、3′端分别加上 EcoRI、XbaI 酶切位点，进行全基因合成，并连入真核表达质粒 pGAPZαA中，得到重组真核表达质粒pGAPZαA-IFN-α。
由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：
本发明所提供的猪 α 干扰素基因能够实现干扰素在毕赤酵母的高表达，获得具有抗病毒活性的猪α干扰素蛋白；其合成方法不需甲醇诱导，只需采用含葡萄糖的培养基即可表达干扰素，所制备出的猪α干扰素基因抗 VSV活性为 3.82×107U/mg。本发明的合成方法采用在不改变猪 α 干扰素氨基酸序列的基础上设计其编码核酸序列，使阅读框内的每个密码子都采用毕赤酵母偏爱的密码子；在人工合成步骤中设计的编码核酸。后将合成的核酸插入适当的表达载体，构建重组表达载体；最后将构建的重组表达载体转化适当的毕赤酵母进行诱导表达，结果显示猪 α 干扰素在毕赤酵母的高表达，获得具有抗病毒活性的猪α干扰素蛋白。
本发明适用于猪 α 干扰素的合成。
本发明下面将结合说明书附图与具体实施例作进一步详细说明。
附图说明
图1为本发明实施例1的猪干扰素工程菌的PCR电泳图；
图2为本发明实施例1的猪干扰素工程菌发酵不同时间的SDS-PAGE图；
图3为本发明实施例１的猪干扰素纯化效果 SDS-PAGE 电泳图。
具体实施方式
实施例１ 一种猪α干扰素基因及其合成方法
一种猪α干扰素基因，其DNA序列如下所示：
tgtgacctacctcaaacgcattctctagctcatacaagagcactaagactgctggcacaaatgagaagaatctcccctttctcttgtctggatcatagaagagacttcggaagtccacacgaagcttttggaggtaaccaagttcaaaaggctcaagctatggcattggtacatgaaatgctgcagcaaactttccaacttttctccaccgaaggttcagctgctgcatgggatgaatctcttttgcaccaattttgtaccggtttggatcagcagttgagagacttggaagcttgcgttatgcaggaagctggcttagaagggactccattgttagaagaggattctatattggccgttcgaaaatactttcacaggttaactttgtatcttcaggagaagagttatagtccctgcgcctgggagattgtccgtgccgaggtgatgaggtccttttcttcatcacgtaatcttcaggatcgtttacgaaagaaagagtaa。
具体合成方法按照以下步骤顺序进行：
( 一 ) 猪α干扰素基因的合成
登录 GeneBank，查找编码猪 α 干扰素成熟蛋白的基因序列 ( 序列号为 ACV42395.1)，利用 SignalP 3.0Server 软件预测此基因可能含有一段信号肽序列， 为其氨基酸序列的前23 个氨基酸，利用 TargetP 1.1Server 软件检测此序列功能， 发现其为帮助蛋白分泌的信号肽而非蛋白结构所必需，后续研究是在毕赤酵母中进行表达，采用的载体中有更适合外源基因在酵母中分泌的信号肽，所以我们去掉信号肽序列，剩下编码成熟猪 α 干扰素的基因序列，其核苷酸长度为501bp；将猪 α 干扰素的编码密码子与毕赤酵母偏好密码子进行比对，根据密码子的兼并性，在不改变氨基酸组成和排列顺序的基础上，对已知的编码猪 α 干扰素的基因序列进行改造，替换为毕赤酵母喜好的密码子，旨在提高基因在毕赤酵母的表达水平；
然后将替换后的序列 5′、3′端分别加上 EcoRI、XbaI 酶切位点，送上海生工生物公司进行全基因合成，并连入真核表达质粒 pGAPZαA中，得到重组真核表达质粒pGAPZαA-IFN-α。
( 二 ) 猪α干扰素的真核表达
(1) 重组质粒 pGAPZαA-IFN-α采用BspHI酶切酶线性化；
(2) 将测序正确的重组质粒pGAPZαA-IFN-α线性化后转入毕赤酵母X-33， 挑取单菌落进行PCR鉴定，PCR采用引物F1/F2，
以5’-GTCCCTATTTCAATCAATTGAA-3’为上游引物；
以5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’为下游引物；
PCR总体积为 25μL，其中2.5μL buffer，1μL dNTP，上游引物0.5μL，下游引物 0.5μL，毕赤酵母X-33 1μL，Taq 0.1μL，ddH2O 19.4μL；其中，上下游引物的浓度均为10μmol/L；dNTP的浓度为10 mmol/L。
反应条件为以95℃ 5min， 95℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 80s为一个循环，经过30个循环，最后72℃延伸 10min，得到大小约900bp的目标条带；
(3) 挑取 YPD 平板上 X33 菌株分别接种进入 20ml液体YPD 培养基，30℃，250r/m 培养至 OD=1.3、1.4或1.5；再按 1％的比例将菌液接种于液体YPD 培养基中，30℃，250r/m培养36h后取样1ml，之后每隔12h取样，把上述样品进行 SDS-PAGE电泳，以确定最佳表达时间；其中，YPD 培养基包括1% 酵母膏、2% 蛋白胨和2%葡萄糖。
试验结果表明：挑取的6株菌PCR检测显示为阳性，大小（约900bp）和理论值一致，如图1所示（其中M表示DNA 标准Mark；A表示阳性对照，为pGAPZαA-IFN-α质粒；1-6表示编号1-6的菌株PCR结果），该工程菌采用pGAPZαA质粒，不需甲醇诱导，只需采用含葡萄糖的培养基即可表达干扰素， 其不同发酵时间的表达量如图2所示（其中M为蛋白质标准Mark；1为发酵24h的上清液；2为发酵36h的上清液；3为发酵48h的上清液；4为发酵60h的上清液；5为发酵72h的上清液。），在60h表达量最高，所以最佳的发酵时间为60h。
将所合成出的重组猪 α 干扰素进行提取，提取过程如下所示：
（1）在4℃，8000rpm离心15min收集上清用于猪干扰素的纯化。
（2）通过微滤超滤获得浓缩样品，将样品分别上DEAE Sepharose弱阴离子交换柱和Phenyl疏水柱（XK 16/20），纯化的干扰素样品进行 SDS-PAGE 电泳检验纯化结果，用 Broadford 法测定蛋白浓度 。
实验结果：纯化得到的猪干扰素SDS-PAGE如图3所示（其中，M表示蛋白质标准Mark；1表示纯化后的猪干扰素），纯度合格。
将上述重组猪 α 干扰素抗病毒进行活性测定，采用微量细胞病变抑制法进行测定，将PK-15接种96孔板，待长成单层后弃去生长液，加入10倍倍比稀释的重组猪α干扰素， 每个稀释度做8个重复，培养24小时后弃上清，用10TCID50的水疱性口炎病毒(VSV)进行攻毒，同时设立阴性对照(只加10倍稀释的干扰素，不加病毒)， 阳性对照(只加病毒，不加干扰素)， 空白对照 ( 不加干扰素，不加病毒)， 倒置显微镜下逐日观察细胞病变，待阳性对照孔出现 75％病变时判定结果。
实验结果表明 ：(1) 阴性对照孔中的细胞未产生任何病变，说明本实施例得到的干扰素本身对细胞没有毒害作用 ；(2) 经104倍稀释的猪α干扰素能100％抑制细胞病变，而107倍稀释的干扰素有 6个孔出现细胞病变，由上述结果得出猪α干扰素抗 VSV比活性为 3.82×107U/mg。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述技术内容作为启示加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作出的简单修改，等同变化与改型，仍属于本发明权利要求的保护范围。
Organization Applicant
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Street : 三厂街道北京东路2666号
City : 江苏省
State : 海门市
Country : 中国
PostalCode : 201600
PhoneNumber : 021-37668111
<110> OrganizationName : 江苏恒丰强生物技术有限公司
Application Project
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<120> Title : 猪α干扰素基因及其合成方法
<170> PatentIn version 3.3
Sequence
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<213> OrganismName : 猪α干扰素基因
<400> PreSequenceString :
tgtgacctac ctcaaacgca ttctctagct catacaagag cactaagact gctggcacaa 60
atgagaagaa tctccccttt ctcttgtctg gatcatagaa gagacttcgg aagtccacac 120
gaagcttttg gaggtaacca agttcaaaag gctcaagcta tggcattggt acatgaaatg 180
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cgaaaatact ttcacaggtt aactttgtat cttcaggaga agagttatag tccctgcgcc 420
tgggagattg tccgtgccga ggtgatgagg tccttttctt catcacgtaa tcttcaggat 480
cgtttacgaa agaaagagta a 501
<212> Type : DNA
<211> Length : 501