技术领域
本发明涉及一种铁皮石斛提取物的制备方法及应用，属于植物活性物质提取分离领域。
背景技术
铁皮石斛（学名：Dendrobium officinale Kimura et Migo）为兰科石斛属植物，其为多年生附生草本植物。
铁皮石斛在《神农本草经》中列为上品，被誉为“中华九大仙草”之首；铁皮石解住产于我国秦岭和长江流域以南，主要分布于云南、广西、浙江等地的生长于高温高湿地区。野生铁皮石斛化学成分主要为石斛多糖、石斛碱、联苄类、菲类、黄酮类、氨基酸微量元素等。人工组织培养铁皮石斛主要富含多糖等有效成分，石斛碱、联苄类、菲类成分含量极低；多糖是石斛中最主要的有效成分；分子量40万左右，构型以α-1，4 -D-Gic直链多糖为主。
药理学研究表明铁皮石斛具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳、补肾益力，延年益寿等功效，体内试验发现对咽喉疾病、肠胃疾病、白内障、糖尿病、抗肿瘤，抗衰老，增强人体免疫力具有显著疗效。
石斛多糖提取的方法报道较多主要有采用干药材粉碎、脱脂、水提、乙醇沉淀法、脱蛋白、干燥得到总多糖。所得铁皮石斛总多糖成分主要为高生理活性多糖、淀粉多糖、果胶多糖、蛋白质等，其中具有药效作用的高活性多糖含量并不是很高。这些报道方法较多但仍有欠缺，在提取率和纯度方面仍需改进。本发明提取采用新鲜石斛为原料提取，提高收率。烤干石斛中石斛多糖受热发生分子间缩合，部分多糖成分破坏水溶解性降低，提取率降低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种铁皮石斛提取物的制备方法，该方法以铁皮石斛鲜条为原料，汁液采用中性蛋白酶发酵，发酵液先经过速冻自然解冻后去除淀粉等杂质后，使用强酸性阳离子交换树脂和弱碱性阴离子交换树脂处理去除淀粉的溶液，最后采用钛棒过滤器浓缩、醇沉、离心、收集上清液冷冻干燥制得铁皮石斛提取物。
上述方法的具体操作如下：
（1）在净选后的铁皮石斛鲜条中加入纯净水捣碎压榨，加水量为鲜条质量的10～12倍，榨汁后过滤得石斛鲜汁液；
（2）在步骤（1）过滤渣中加入过滤渣质量3～5倍的水并于90～95℃下提取1～2次，提取时间40～60分钟后过滤合并滤液，丢弃过滤渣；
（3）合并步骤（1）石斛鲜汁液和步骤（2）滤液，在合并液中加入合并液质量0.03～0.05%的中性蛋白酶于45～60℃保温1～2小时，然后常温静置发酵12～16小时；
（4）将步骤（3）发酵液迅速冷冻后再自然解冻，使提取物中淀粉老化沉淀；收集上清液，剩余部分离心，收集离心液体并合并于上清液中；
（5）将步骤（4）液体过强酸性阳离子交换树脂柱，收集流出液体；
（6）将步骤（5）流出液过弱碱性阴离子交换树脂柱，收集无色流出液；
（7）步骤（6）流出液采用钛棒过滤器浓缩，浓缩到浓缩前液体体积1/3～1/4为止；
（8）向步骤（7）浓缩液中加入浓缩液体积4～5倍的质量百分比浓度为95%的乙醇液进行醇沉过夜、离心，收集上清液，上清液冷冻干燥制得铁皮石斛提取物。
所述钛棒过滤器滤芯孔径0.2～3微米。
本发明另一目的是将上述方法制得的铁皮石斛提取物应用于制备治疗伤口愈合药物中。
本发明所述的应用是以上述提取物为活性成分在制备治疗伤口愈合药物中。
本发明所述应用中还可以加入一种或多种药物上可接受的辅料，所述辅料包括药学领域常规的填充剂、稀释剂、粘合剂、赋形剂、吸收促进剂、填充剂、表面活性剂和稳定剂等，必要时还可加入香味剂、色素和甜味剂等。
本发明所述应用除制成胶囊外，还可以制成丸剂、粉剂、片剂、粒剂、口服液和注射液等多种形式。
本申请粗提取液采用酶发酵过夜、冻融把大分子蛋白质、果胶、粘液质、淀粉多糖等杂质类成分降解成小分子类杂质离心去除；使用阳离子柱脱去离心液中氨基酸、部分脂溶性色素、灰分；使用阴离子交换树脂去除石斛中水溶性色素和残留的小分子蛋白质杂质，替代传统的有机溶剂SAVAGE法脱蛋白工艺具有更好的工业化操作性；采用钛棒式过滤器替代传统的热浓缩和昂贵的膜分离设备，降低了生产成本同时保留活性多糖不会出现热浓缩被破坏的现象；醇沉冷冻干燥所得提取物经检测蛋白质、淀粉残留极低，本工艺操作简单，成本低，产业化程度高。
本发明所得提取物用于治疗创口愈合效果较好，且提取物中蛋白质、淀粉脱除较为彻底外用敷于创面不会滋生细菌成为炎症介质；实验结果显示本发明提取物与基质对照组比较，家兔术后10d创面大小、愈合速递和平均愈合时间均有显著性差异，石斛提取物能加速创面模型家兔伤口的愈合。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围不局限于所述内容。
实施例1：本铁皮石斛提取物的提取分离方法步骤如下：
（1）在净选后的铁皮石斛鲜条中加入纯净水捣碎压榨，加水量为鲜条质量的10倍，榨汁后过滤得石斛鲜汁液；
（2）在步骤（1）过滤渣中加入过滤渣质量3倍的水并于93℃下提取1次，提取时间40分钟后过滤合并滤液，丢弃过滤渣；
（3）合并步骤（1）石斛鲜汁液和步骤（2）滤液，在合并液中加入合并液质量0.03%的中性蛋白酶45℃保温2小时，然后常温静置发酵12小时；
（4）将步骤（3）发酵液体迅速冷冻后再自然解冻，使提取物中淀粉老化沉淀；收集上清液，剩余部分离心，收集离心液体并合并于上清液中；
（5）将步骤（4）液体过强酸性阳离子交换树脂柱（型号D001），收集流出液体；
（6）将步骤（5）流出液过弱碱性阴离子交换树脂柱（型号D941），收集无色流出液；
（7）步骤（6）流出液采用钛棒过滤器浓缩，浓缩到浓缩前液体体积1/3为止（钛棒过滤器滤芯孔径2微米）；
（8）向步骤（7）浓缩液中加入浓缩液体积4倍的质量百分比浓度为95%的乙醇液进行醇沉过夜、离心，收集上清液，上清液冷冻干燥制得铁皮石斛提取物。
采用下述实验对本实施例提取物进行伤口愈合治疗：
1、实验动物：日本大耳白兔，1.8±0.2kg，雌雄各半，试验动物由北京科宇动物养殖中心提供，合格证号:SCXK（京）2012-0004；
2、药品的制备：取铁皮石斛提取物冻干粉末5g，以注射用水将石斛提取物冻干粉搅拌混匀成膏状物备用；
3、实验方法：家兔背部去毛，在背部头侧1/3处，脊柱旁1.5cm处，左右对称设计3cm×4cm大小，长轴与脊柱平行的矩形创面；1%普鲁卡因局麻后，按设计完整切除皮肤、浅筋膜组织，直至深筋膜浅面。将上述制成创面模型的家兔30只，随机分为5组，即空白组，基质（注射用水）对照组、阳性药组、药物低剂量组、药物高剂量组；每组6只，自手术日起按设计剂量创面外涂步骤2药物，表面用无菌纱布包扎，每日更换药物；换药时测量创面大小，计算术后创面面积及愈合速度，以创面愈合95%为愈合标准，记录每个创面的愈合天数；
4、分析方法：以mean±S.D表示，统计方法为单因素方差分析，以P<0.05为显著性差异；
5、实验结果件表1；
表1：各组家兔创面模型伤口愈合情况（mean±S.D）
注：与基质对照组比较，*P<0.05, **P<0.01。
6、结论
与基质对照组比较，石斛提取物各剂量组及阳性药物组家兔术后10d创面大小、愈合速递和平均愈合时间均有显著性差异，石斛提取物能加速创面模型家兔伤口的愈合。
实施例2：本铁皮石斛提取物的提取分离方法步骤如下：
（1）在净选后的铁皮石斛鲜条中加入纯净水捣碎压榨，加水量为鲜条质量的11倍，榨汁后过滤得石斛鲜汁液；
（2）在步骤（1）过滤渣中加入过滤渣质量4倍的水并于90℃下提取2次，提取时间50分钟后过滤合并滤液，丢弃过滤渣；
（3）合并步骤（1）石斛鲜汁液和步骤（2）滤液，在合并液中加入合并液质量0.04%的中性蛋白酶50℃保温1.5小时，然后常温静置发酵14小时；
（4）将步骤（3）发酵液体迅速冷冻后再自然解冻，使提取物中淀粉老化沉淀；收集上清液，剩余部分离心，收集离心液体并合并于上清液中；
（5）将步骤（4）液体过强酸性阳离子交换树脂柱（型号001×7），收集流出液体；
（6）将步骤（5）流出液过弱碱性阴离子交换树脂柱（型号D900），收集无色流出液；
（7）步骤（6）流出液采用钛棒过滤器浓缩，浓缩到浓缩前液体体积1/3为止；
（8）向步骤（7）浓缩液中加入浓缩液体积5倍的质量百分比浓度为95%的乙醇液进行醇沉过夜、离心，收集上清液，上清液冷冻干燥制得铁皮石斛提取物。
采用下述实验对本实施例提取物进行伤口愈合治疗：
1、实验动物：日本大耳白兔，1.8±0.2kg，雌雄各半，试验动物由北京科宇动物养殖中心提供，合格证号:SCXK（京）2012-0004；
2、药品的制备：取铁皮石斛提取物冻干粉末5g，以注射用水将石斛提取物冻干粉搅拌混匀成膏状物备用；
3、实验方法：家兔背部去毛，在背部头侧1/3处，脊柱旁1.5cm处，左右对称设计3cm×4cm大小，长轴与脊柱平行的矩形创面；1%普鲁卡因局麻后，按设计完整切除皮肤、浅筋膜组织，直至深筋膜浅面。将上述制成创面模型的家兔30只，随机分为5组，即空白组，基质（注射用水）对照组、阳性药组、药物低剂量组、药物高剂量组；每组6只，自手术日起按设计剂量创面外涂步骤2药物，表面用无菌纱布包扎，每日更换药物；换药时测量创面大小，计算术后创面面积及愈合速度，以创面愈合95%为愈合标准，记录每个创面的愈合天数；
4、分析方法：以mean±S.D表示，统计方法为单因素方差分析，以P<0.05为显著性差异；
5、实验结果件表2；
表2：各组家兔创面模型伤口愈合情况（mean±S.D）
注：与基质对照组比较，*P<0.05, **P<0.01。
6、结论
与基质对照组比较，石斛提取物各剂量组及阳性药物组家兔术后10d创面大小、愈合速递和平均愈合时间均有显著性差异，石斛提取物能加速创面模型家兔伤口的愈合。
实施例3：本铁皮石斛提取物的提取分离方法步骤如下：
（1）在净选后的铁皮石斛鲜条中加入纯净水捣碎压榨，加水量为鲜条质量的12倍，榨汁后过滤得石斛鲜汁液；
（2）在步骤（1）过滤渣中加入过滤渣质量5倍的水并于95℃下提取1次，提取时间60分钟后过滤合并滤液，丢弃过滤渣；
（3）合并步骤（1）石斛鲜汁液和步骤（2）滤液，在合并液中加入合并液质量0.05%的中性蛋白酶60℃保温1小时，然后常温静置发酵16小时；
（4）将步骤（3）发酵液体迅速冷冻后再自然解冻，使提取物中淀粉老化沉淀；收集上清液，剩余部分离心，收集离心液体并合并于上清液中；
（5）将步骤（4）液体过强酸性阳离子交换树脂柱（型号CD350），收集流出液体；
（6）将步骤（5）流出液过弱碱性阴离子交换树脂柱（型号700B），收集无色流出液；
（7）步骤（6）流出液采用钛棒过滤器浓缩，浓缩到浓缩前液体体积1/4为止；
（8）向步骤（7）浓缩液中加入浓缩液体积4倍的质量百分比浓度为95%的乙醇液进行醇沉过夜、离心，收集上清液，上清液冷冻干燥制得铁皮石斛提取物。
采用下述实验对本实施例提取物进行伤口愈合治疗：
1、实验动物：日本大耳白兔，1.8±0.2kg，雌雄各半，试验动物由北京科宇动物养殖中心提供，合格证号:SCXK（京）2012-0004；
2、药品的制备：取铁皮石斛提取物冻干粉末5g，以注射用水将石斛提取物冻干粉搅拌混匀成膏状物备用；
3、实验方法：家兔背部去毛，在背部头侧1/3处，脊柱旁1.5cm处，左右对称设计3cm×4cm大小，长轴与脊柱平行的矩形创面；1%普鲁卡因局麻后，按设计完整切除皮肤、浅筋膜组织，直至深筋膜浅面。将上述制成创面模型的家兔30只，随机分为5组，即空白组，基质（注射用水）对照组、阳性药组、药物低剂量组、药物高剂量组；每组6只，自手术日起按设计剂量创面外涂步骤2药物，表面用无菌纱布包扎，每日更换药物；换药时测量创面大小，计算术后创面面积及愈合速度，以创面愈合95%为愈合标准，记录每个创面的愈合天数；
4、分析方法：以mean±S.D表示，统计方法为单因素方差分析，以P<0.05为显著性差异；
5、实验结果件表3；
表3：各组家兔创面模型伤口愈合情况（mean±S.D）
注：与基质对照组比较，*P<0.05, **P<0.01。
6、结论
与基质对照组比较，石斛提取物各剂量组及阳性药物组家兔术后10d创面大小、愈合速递和平均愈合时间均有显著性差异，石斛提取物能加速创面模型家兔伤口的愈合。