技术领域
本发明涉及重组丙酮丁醇梭菌及其构建方法与应用。
背景技术
随着石油资源的不断减少以及不可再生资源价格的节节攀升，开发利用环境友好的生物基产品已成为转变经济增长方式、保障生态链良性循环、实现经济社会可持续发展的战略需求。丁醇(Butanol)是一种重要的化工原料，主要用于制造增塑剂、溶剂和萃取剂等。丁醇又是一种极具潜力的新型生物燃料，其热值、辛烷值与汽油相当；含氧量与汽油中常用的甲基叔丁基醚相近；不会腐蚀管道，便于管道输送；蒸汽压低，安全性高，且能与汽油以任意比混合。
丁醇可由发酵法和石油化工生产两种方法来生产。丁醇的发酵方法又称ABE(Acetone，Butanol，Ethanol)发酵，盛行于20世纪上半叶，曾经是仅次于乙醇的全球第二大发酵工业。20世纪50年代以后，由于石化合成技术的成熟导致发酵法生产丁醇不再具有经济竞争优势，丁醇发酵逐渐淡出市场。70年代后，随着石油危机的出现及国际原油价格的不断上涨，世界各国对能源安全和资源安全的忧虑日增，人们又重新开始关注丁醇的发酵生产。随着生物学的迅猛发展，微生物生产丁醇的分子机理得到了比较充分的认识。如2001年发表的丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)ATCC824基因组序列，为人们认识丁醇的生物合成提供了一张完整的框架图，继而基于基因组技术发展起来的蛋白质组学技术、转录学技术、代谢网络建模等手段应用到丁醇生物合成的机制研究中，使得人们对于丁醇的生物合成机制的认识进入了一个新的时代。
认识丁醇的生物合成机制，除了增加人类对自然界的认识之外，更重要的是利用这些认识，去改造生物体，使之能够表现出对人类有益的性能。1992年Papoutsakis领导的研究组第一次在丙酮丁醇梭菌中表达丙酮合成途径中的关键酶基因，开启了通过基因水平操作丙酮梭菌的先河。但是在过去十几年的发展过程中，通过遗传方法改造丙酮丁醇梭菌的实例并不像其它工业生产菌株那样有着长足的进步。主要原因可以归结为两个方面，一是由于丙酮丁醇梭菌是一种严格厌氧的细菌，需要特殊的培养设备和条件，这就决定了它不能像其它好养或兼性厌氧菌株那样得到广泛的研究；二是由于丙酮丁醇梭菌的遗传操作的效率很低，对于这种菌的操作不仅需要特殊的设备，还需要经验和技术，并且工作量较大。幸运的是2007年有科学家发展出了适用于梭菌的内含子插入型基因敲除系统，这将会加速丁醇生产代谢工程的发展。
丁醇的生物合成过程比乙醇发酵、乳酸发酵有着更为复杂的代谢途径和调控机制。有研究表明过量表达丁醇合成途径中的关键酶基因(如醇脱氢酶基因adhE，丁醇脱氢酶bdh)并不能提高丁醇的产量。梭菌中产丁醇途径的主要过程是通过糖酵解途径分解葡萄糖生成丙酮酸，丙酮酸再经过一系列反应产生丁醇。因此提高丁醇生产能力可通过增强糖酵解途径的代谢流量，从而增加葡萄糖的利用效率，这样就会提供更多的丙酮酸前体。糖酵解途径除了能利用碳源进行碳骨架的重组外，还可提供细胞生理活动必需的能量。在某些细菌中增加细胞内的能量消耗可以增强糖酵解途径的代谢流量。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组丙酮丁醇梭菌及其构建方法与应用。
本发明所提供的构建重组丙酮丁醇梭菌的方法，是将含有FoF1型ATP合酶的亲水部分的编码基因的DNA片段导入丙酮丁醇梭菌中构建重组菌。
其中，所述含有FoF1型ATP合酶的亲水部分的编码基因的DNA片段自上游至下游依此包括硫解酶启动子和FoF1型ATP合酶的亲水部分的编码基因；所述硫解酶启动子的核苷酸序列如序列表中的序列2所示。
所述FoF1型ATP合酶的亲水部分包含三种蛋白，所述三种蛋白为如下的a)或b)：
a)其氨基酸序列分别为序列表中的序列3、序列4和序列5；
b)在序列表中序列3、序列4或序列5限定的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸由a)衍生的蛋白质。
为了使a)中的蛋白便于纯化，可在由序列表中序列3、序列4和/或序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1.标签的序列
标签 残基 序列 Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH FLAG 8 DYKDDDDK Strep-tag II 8 WSHPQFEK c-myc 10 EQKLISEEDL
上述b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述b)中的蛋白的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
所述FoF1型ATP合酶的亲水部分的编码基因可为如下1)或2)或3)的基因：
1)其核苷酸序列是序列表中序列1；
2)在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交且编码FoF1型ATP合酶的亲水部分的DNA分子；
3)与1)的基因具有90％以上的同源性，且编码FoF1型ATP合酶的亲水部分的DNA分子。
所述步骤3)中的基因，与1)的基因最好有95％以上的同源性。
上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在68℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
所述含有FoF1型ATP合酶的亲水部分的编码基因的DNA片段还经过甲基化修饰。所述出发菌株丙酮丁醇梭菌为丙酮丁醇梭菌SMB-1 CGMCC №.2287(中国专利：200810102673.2)。
由所述构建重组丙酮丁醇梭菌的方法构建的重组菌也属于本发明的保护范围。
其中，所述重组丙酮丁醇梭菌可为丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB-1(pITF1) CGMCC No.2796。
本发明的另一个目的是提供一种生产丁醇的方法。
本发明所提供的生产丁醇的方法，是发酵培养所述的重组丙酮丁醇梭菌生产丁醇。
其中，每升发酵培养的培养基由如下物质组成：KH2PO4 0.5-1.0g；K2HPO4·3H2O0.5-1.0g；MgSO4·7H2O 0.2-1.0g；MnSO4·H2O 0.01-0.05g；FeSO4·7H2O 0.01-0.05g；NaCl 0.1-2.0g；酵母粉2.0-10.0g；(NH4)2SO4 0.5-4.0g；葡萄糖40-80g。
所述发酵培养基中还含有25-100mg/L的红霉素，所述发酵培养条件为发酵pH为4.5-5.5，培养温度35-40℃，180-250rpm。
本发明将丙酮丁醇梭菌中的FoF1型ATP合酶(FoF1-type ATP synthase，ATPase)的亲水部分(F1部分)的编码基因(atpAGD)转化到梭菌细胞内，过量表达atpAGD产生的游离的ATPase F1部分，水解胞内的ATP，从而使细胞内ATP浓度的下降，这样细胞就会调整自身的代谢以供应更多的ATP，调整自身的代谢一个主要的方式就是增强糖酵解的代谢流量，从而提高了丁醇的发酵生产速率。本发明构建的重组丙酮丁醇梭菌发酵生产丁醇的产率最高可达到13.7g/L。
附图说明
图1为重组质粒pITF1结构示意图。
图2为PCR鉴定丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)SMB-1(pITF1)。
具体实施方式
下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。
酵母粉购自英国OXOID公司(目录号1023098)，蛋白胨购自英国OXOID公司(目录号594566)，牛肉膏购自北京双旋微生物培养基制品厂。
每升强化梭菌培养基(RCM)含酵母粉3.0g，蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，葡萄糖5.0g，淀粉10.0g，乙酸钠3.0g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，pH 6.8。
每升发酵培养基含KH2PO4 0.75g；K2HPO4·3H2O 0.75g；MgSO4·7H2O 0.4g；MnSO4·H2O0.01g；FeSO4·7H2O 0.01g；NaCl 1.0g；酵母提取物5.0g；(NH4)2SO4 2.0g；葡萄糖65g。
下述实施例中的实验结果均为三次重复实验的平均值。
实施例1、构建表达FoF1型ATP合酶的亲水部分的丙酮丁醇梭菌
采用溶菌酶、SDS等试剂破坏细胞壁的常规细菌基因组提取方法，提取丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)ATCC 824(美国典型培养物保藏中心，美国专利US7432090)的基因组DNA，按照常规PCR方法，使用高保真DNA聚合酶Pfu扩增硫解酶启动子区域(Pthl)和atpAGD基因编码区(atpA、atpG、atpD三个基因在一个操纵子内)，引物见表1。
表2.引物的核苷酸序列
引物名称 序列 酶切位点 Pthl-F agtgtcgactatattgataaaaataataatagtggg Sal I Pthl-R cgtggatccttctttcattctaactaacctcc BamH I atpAGD-F gtccggatccatgaacataaaacctgaagagataacttcaataataaaaag BamH I atpAGD-R gtccgaattcccttagctttccatcatttttttagctttttcttttacatc EcoR I
将PCR扩增硫解酶启动子区域的产物克隆到pMD18-T载体中，获得pMD18-T-Pthl载体，测序，测序结果表明Pthl的核苷酸序列如序列表中序列2所示。
将PCR扩增atpAGD基因编码区的产物克隆到pMD18-T载体中，获得pMD18-T-atpAGD载体，测序，测序结果表明atpAGD的核苷酸序列如序列表中序列1所示，编码FoF1型ATP合酶的亲水部分，FoF1型ATP合酶的亲水部分含有3中蛋白，这3中蛋白的氨基酸序列分别为序列表中的序列3(由序列表中序列1自5′末端第1-1515位编码)、序列4(由序列表中序列1自5′末端第1550-2395位编码)和序列5(由序列表中序列1自5′末端第2411-3809位编码)。
Sal I和BamH I酶切扩增得到的硫解酶启动子区域(Pthl)与经过同样酶切的pIMP1载体(Mermelstein，L.D.，N.E.Welker，G.N.Bennett，and E.T.Papoutsakis.(1992).Expression of cloned homologous fermentative genes inClostridium acetobutylicum ATCC 824.Bio/Technology.10：190-195)(中国科学院微生物研究所)连接构建重组载体pIMP1-Pthl，然后用BamH I和EcoR I酶切PCR扩增获得的atpAGD片段与同样双酶切的pIMP1-Pthl连接构建重组表达载体pITF1(图1)。
由于已经证明丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutlicum)ATCC 824中含有限制性内切酶Cac824I，可以切割未甲基化的外源DNA，因此在对丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)SMB-1 CGMCC №.2287(中国专利：200810102673.2)进行转化前对重组表达载体pITF1进行甲基化修饰。具体操作步骤为从E.coliJM109中提取的pITF1转入E.coli ER2275(pAN1)(Mermelstein，L.D.and E.T.Papoutsakis(1993).″In vivo methylation in Escherichia coli by theBacillus subtilis phage phi 3T I methyltransferase to protect plasmids fromrestriction upon transformation of Clostridium acetobutylicum ATCC 824.″Appl.Environ.Microbiol.59(4)：1077-1081.)(中国科学院微生物研究所)中进行甲基化，获得甲基化的重组表达载体pITF1。
制备梭菌感受态的培养基为强化梭菌培养基(RCM)。丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)SMB-1 CGMCC №.2287菌体生长至OD600＝0.8时，收集菌体，用ETB溶液(270mM蔗糖，5mM磷酸二氢钠，pH 7.4)洗涤菌体两次，最后用适量ETB溶液悬浮菌体，分装成600μl/管待转化。所有操作保持菌体在厌氧状态及冰上(4℃离心)。
将甲基化的重组表达载体pITF1与菌体混合，置于冰上10min，然后将混合物转移至4mm电击杯内进行转化，使用的电转化参数为：电压2.0kV，电容25μF，电阻∞，典型电击持续时间为12ms-19ms。电转化完毕后，立即将菌液转至10ml RCM培养基中，复壮6-8h，涂布于含25μg/ml红霉素的RCM平板上，37℃培养36h。
随机挑取红霉素抗性菌落接种于含50μg/ml红霉素液体培养基中，培养24h后提取基因组DNA，用如下引物进行PCR鉴定。
pIMP1-F：gaggcaaatgaaatagattgacctccc；
pIMP1-R：gtgctgcaaggcgattaagttgggtaac。
PCR产物电泳结果如图2所示，pITF1已经被转化到了梭菌细胞内，该菌株命名为丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)SMB-1(pITF1)。
已转入甲基化的pIMP1载体的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)SMB-1，命名为丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)SMB-1(pIMP1)，作为对照。
丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)SMB-1(pIMP1)于2008年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCCNo.2800。
图2中“1”代表DNA分子量标准，“2”代表丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB-1(pITF1)，“3”代表丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB-1(pIMP1)。
将丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)SMB-1(pITF1)在含50mg/L红霉素的RCM培养基中37℃静置培养至对数期，作为发酵种子液。
发酵种子液按照体积百分比为5％的量接种到装有3L发酵培养基的7L发酵罐中，同时加50mg/L的红霉素，自动流加4M NaOH控制发酵罐pH为5.0(发酵初始不控制pH，当发酵液pH降到5.0之后，通过自动流加4mol/L的NaOH自动控制pH在5.0)，37℃，220rpm进行发酵。用液相色谱检测发酵52和60小时后的发酵液。以丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)SMB-1(pIMP1)和丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)SMB-1 CGMCC №.2287作为对照。液相色谱检测条件为：样品前处理：12000rpm离心1min，取上清液，用0.22μm滤膜过滤；色谱条件：Agilent 1200液相色谱仪，示差检测器；BioRad Aminex HPX-87H有机酸柱(300*7.8mm)，柱温15℃；上样量10μl；流动相为0.05mM H2SO4，流速0.5ml/min。丁醇标准品购自Sigma公司(目录号：4C006217)；在如上色谱条件下标准品的保留时间为40.9分钟。
表1.液相色谱检测52和60小时的发酵液的结果
菌株 发酵 周期 (h) 丁醇 (g/L) 丙酮 (g/L) 乙醇 (g/L) 丁醇生 产率 (g/L/h) 丙酮丁醇梭菌 (Clostridium acetobutylicum) SMB-1 CGMCC №.2287 60 12.3 3.9 1.3 0.21 丙酮丁醇梭菌 (Clostridium acetobutylicum) SMB-1(pIMP1) 60 12.5 3.9 1.1 0.21 丙酮丁醇梭菌 (Clostridium acetobutylicum) SMB-1(pITF1) 52 13.7 2.7 2.0 0.26
丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)SMB-1(pITF1)中的一株菌在发酵52小时后，其发酵液中的丁醇产量为13.7(g/L)，将菌株已于2008年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCCNo.2796。
序列表
<110>中国科学院微生物研究所
<120>重组丙酮丁醇梭菌及其构建方法与应用
<130>CGGNARW82067
<160>5
<210>1
<211>3767
<212>DNA
<213>丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)
<400>1
atgaacataa aacctgaaga gataacttca ataataaaaa gtcagattga gggatatgaa 60
agtaaattag aaacagtaga ttcaggtacg ataatagaaa taggtgatgg tatcgctaga 120
atatacggct tacaaaattg tatggctggc gaacttcttg agtttccaaa cgatgtgtat 180
ggaatggctc taaatcttga acaagacaat gttggatgtg ttttacttgg ttcagaagaa 240
ggaatcaaag aaggagacat tgttaaaagt acaggaaaag ttgttgaagt gcctgttggt 300
gaagaaatgc ttggaagagt agtaaatgct cttggtcaac caatagatgg taaaggacca 360
attaaagcag aagattcaaa accagtagat ataaaagcta caggagttat tgatagacaa 420
tcagttaatc aaccacttca aacaggtata aaagccatag actcaatgat acctattgga 480
aaaggacaaa gagaacttat tataggagat agacagacag gtaaaactgc tatagctatc 540
gatactatat tgaatcaaaa aggaaaagat gtaatttgta tatatgttgc tataggtcaa 600
aaacaatcta cagtagcaca tatagttaat acatttgaag aaatgggagc tatggattac 660
agcatagttg tagcagcaac tgcttcagat tcagcaccac ttcaatattt agcaccatat 720
tcaggtgtaa caattgcaga aaactttatg tttaaaggaa aagatgtact tattgtatat 780
gatgatcttt caaagcacgc tgttgcatac agaacgatgt cattactttt acgtagacca 840
ccaggcagag aggcataccc tggagatgta ttctacttac attcaagact tcttgaaaga 900
gctgctaaac tttcacagaa acttggagga ggttctataa cagcacttcc tataatagaa 960
actcttgctg gtgatgttgc gggttacata ccaacaaatg ttatttctat aacagatggt 1020
caaatattcc ttgaatcaga attattctat gcaggacaaa gaccagctgt taactcaggt 1080
atatcagtat ccagagttgg tggtagtgct caaattaaag caatgaaaaa actttcagga 1140
actttaagac ttgagcttgc acaatatagg gaacttgctg catttgctca gtttggttct 1200
gaccttgata aagaatctaa aaagagactt gaaaaaggta aaagacttac tgaaatgatg 1260
aaacagcctc aatataagcc aatgccagtt gagaaacaaa taatgatttt atatgctgtt 1320
gtaaatgagt atgtaatgga tattgatgtt tcaaaactta gtgcatttga aagtggatta 1380
tttgagtatg tagatgctca ttatagagac ttaggtaagc aaatacttga gaaaaaagag 1440
ctaactgatg atataagcag tcagcttacc aaagctatta acgaatataa aaagatattt 1500
ttagcagagg aacagtagtt aatgactttc ctatgcagga ggtgaagtaa tggcaggagc 1560
aggacttatt attataaaaa gaagaattaa gtctattacg aatactaaaa aaataacaaa 1620
cgccatggga cttatagcca cctctaattt aagaaaatct agacagaatc tcgaagcgaa 1680
taaagcatat tatgaagctt ttaatgatgt tataaataag attgtaagtt cttctagtaa 1740
gagcaactta tatgtagctg gaaataaaag tgacaaaaaa ctttatatag ctttgacttc 1800
tgattctggt ctttgtggag gttttaacgg agctgttgta actgctgctg acaatgttat 1860
gagaggggat aaagataaat ccttacttat aactgttggt caaaagggaa tatcttattt 1920
taaaaggctt aaatatgaga ctttatccga atacgttgat attccaaacg agccaggatt 1980
aaaagaagct aaggaaatag cagaccgtgc tttaagtctt tatgaaaaag gcgaaatagg 2040
agaagttcat gttatttata ctcaatttct ttctacggta aatcaaaaag ttgaggtaaa 2100
gaaggtactc cctattgaac ctaaaaagat ggaaaaagtg agtgtagctg aatttgaacc 2160
agatgcagaa attatacttg aaaaagctat aaggcttcat attgaacagc agttatttaa 2220
cttgttatta aattctaagg caagtgagca ggcatctaga atgtcctcaa tggatagtgc 2280
tactaaaaat gccaatgact tacttgatgc tttaaatatt aagtataata gaattagaca 2340
aagtgctatt actcaagaaa taacagaaat agttggagga gcggaagctc tcaaataagg 2400
agggaaactg atgccagaac atgtaggtaa aattgttcag gtaataggac ctgttgtgga 2460
tattaaattt gatgcagaga accttcctga catctataat tccatagaaa tagatatggg 2520
agataataaa aaactcattg ctgaagttga acaacatgta ggagatgaca tagtaagaac 2580
aatagcaatg gaaggtactg acggattaaa aagaggaatg gaagcagtta acactggtaa 2640
accaatatct gtaccagttg gagaaaatgt tttaggacgt ctttttaatg ttttaggtca 2700
gacaatagat gaagcaggag acatgaatgc tgataagtat tatccaattc atagaccagc 2760
tccaaccttt gaagaacaat cagttcaacc agaaatgttt gaaacaggta ttaaggttat 2820
agatttactt gctccatatc aaaagggtgg aaaaatcggt ttgttcggtg gtgccggtgt 2880
tggtaaaaca gttcttattc aggaacttat aaataatata gcaaaagaac acggtggatt 2940
atcagtattc acaggtgttg gagaaagaac aagagaaggt aatgaccttt attatgaaat 3000
gaaagattca ggagttataa ataaaacagc tctagtattt ggtcagatga atgaaccacc 3060
tggcgctaga atgagagttg ctttaacagg acttacaatg gctgaatatt ttagagacaa 3120
aggtcaagat gtgcttctat ttatagataa tatattcaga tttacacaag ctggttcaga 3180
ggtttcagct ttacttggta gaatacctag tgccgttggt tatcagccaa cacttgcaaa 3240
tgaaatgggt gctcttcaag agagaataac atcaacaaaa cagggttcaa tcacatccgt 3300
tcaggctgta tatgttcctg ctgatgacct tacagaccca gctccagcaa caacatttac 3360
gcatcttgat gcaacaacag ttctttcaag agaaatatca aacttaggaa tatatcctgc 3420
agttagtcct cttgaatcaa cttcaagaat acttgatcca agaattgttg gagaagagca 3480
ttatgaagtt gctaacaagg ttaaacatat acttgaaaga tatcaagaac ttcaagatat 3540
catagctata cttggtgttg atgaactttc agatgaggat agattgttag ttggaagagc 3600
aagaagagta cagagattct tatctcaagc ttttagtgtt gctgaacaat ttacaggaat 3660
gaaaggtcag tttgtacctg taaaagatac tataagaagt tttaaagaaa tattagatgg 3720
taagtgtgat gatcttccag aagctgcatt tttatttgca ggaacaatag aagatgtaaa 3780
agaaaaagct aaaaaaatga tggaaagcta agg 3813
<210>2
<211>150
<212>DNA
<213>丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)
<400>2
tatattgata aaaataataa tagtgggtat aattaagttg ttagagaaaa cgtataaatt 60
agggataaac tatggaactt atgaaataga ttgaaatggt ttatctgtta ccccgtatca 120
aaatttagga ggttagttag aatgaaagaa 150
<210>3
<211>505
<212>PRT
<213>丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)
<400>3
Met Asn Ile Lys Pro Glu Glu Ile Thr Ser Ile Ile Lys Ser Gln Ile
1 5 10 15
Glu Gly Tyr Glu Ser Lys Leu Glu Thr Val Asp Ser Gly Thr Ile Ile
20 25 30
Glu Ile Gly Asp Gly Ile Ala Arg Ile Tyr Gly Leu Gln Asn Cys Met
35 40 45
Ala Gly Glu Leu Leu Glu Phe Pro Asn Asp Val Tyr Gly Met Ala Leu
50 55 60
Asn Leu Glu Gln Asp Asn Val Gly Cys Val Leu Leu Gly Ser Glu Glu
65 70 75 80
Gly Ile Lys Glu Gly Asp Ile Val Lys Ser Thr Gly Lys Val Val Glu
85 90 95
Val Pro Val Gly Glu Glu Met Leu Gly Arg Val Val Asn Ala Leu Gly
100 105 110
Gln Pro Ile Asp Gly Lys Gly Pro Ile Lys Ala Glu Asp Ser Lys Pro
115 120 125
Val Asp Ile Lys Ala Thr Gly Val Ile Asp Arg Gln Ser Val Asn Gln
130 135 140
Pro Leu Gln Thr Gly Ile Lys Ala Ile Asp Ser Met Ile Pro Ile Gly
145 150 155 160
Lys Gly Gln Arg Glu Leu Ile Ile Gly Asp Arg Gln Thr Gly Lys Thr
165 170 175
Ala Ile Ala Ile Asp Thr Ile Leu Asn Gln Lys Gly Lys Asp Val Ile
180 185 190
Cys Ile Tyr Val Ala Ile Gly Gln Lys Gln Ser Thr Val Ala His Ile
195 200 205
Val Asn Thr Phe Glu Glu Met Gly Ala Met Asp Tyr Ser Ile Val Val
210 215 220
Ala Ala Thr Ala Ser Asp Ser Ala Pro Leu Gln Tyr Leu Ala Pro Tyr
225 230 235 240
Ser Gly Val Thr Ile Ala Glu Asn Phe Met Phe Lys Gly Lys Asp Val
245 250 255
Leu Ile Val Tyr Asp Asp Leu Ser Lys His Ala Val Ala Tyr Arg Thr
260 265 270
Met Ser Leu Leu Leu Arg Arg Pro Pro Gly Arg Glu Ala Tyr Pro Gly
275 280 285
Asp Val Phe Tyr Leu His Ser Arg Leu Leu Glu Arg Ala Ala Lys Leu
290 295 300
Ser Gln Lys Leu Gly Gly Gly Ser Ile Thr Ala Leu Pro Ile Ile Glu
305 310 315 320
Thr Leu Ala Gly Asp Val Ala Gly Tyr Ile Pro Thr Asn Val Ile Ser
325 330 335
Ile Thr Asp Gly Gln Ile Phe Leu Glu Ser Glu Leu Phe Tyr Ala Gly
340 345 350
Gln Arg Pro Ala Val Asn Ser Gly Ile Ser Val Ser Arg Val Gly Gly
355 360 365
Ser Ala Gln Ile Lys Ala Met Lys Lys Leu Ser Gly Thr Leu Arg Leu
370 375 380
Glu Leu Ala Gln Tyr Arg Glu Leu Ala Ala Phe Ala Gln Phe Gly Ser
385 390 395 400
Asp Leu Asp Lys Glu Ser Lys Lys Arg Leu Glu Lys Gly Lys Arg Leu
405 410 415
Thr Glu Met Met Lys Gln Pro Gln Tyr Lys Pro Met Pro Val Glu Lys
420 425 430
GlnIle Met Ile Leu Tyr Ala Val Val Asn Glu Tyr Val Met Asp Ile
435 440 445
Asp Val Ser Lys Leu Ser Ala Phe Glu Ser Gly Leu Phe Glu Tyr Val
450 455 460
Asp Ala His Tyr Arg Asp Leu Gly Lys Gln Ile Leu Glu Lys Lys Glu
465 470 475 480
Leu Thr Asp Asp Ile Ser Ser Gln Leu Thr Lys Ala Ile Asn Glu Tyr
485 490 495
Lys Lys Ile Phe Leu Ala Glu Glu Gln
500 505
<210>4
<211>282
<212>PRT
<213>丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)
<400>4
Met Ala Gly Ala Gly Leu Ile Ile Ile Lys Arg Arg Ile Lys Ser Ile
1 5 10 15
Thr Asn Thr Lys Lys Ile Thr Asn Ala Met Gly Leu Ile Ala Thr Ser
20 25 30
Asn Leu Arg Lys Ser Arg Gln Asn Leu Glu Ala Asn Lys Ala Tyr Tyr
35 40 45
Glu Ala Phe Asn Asp Val Ile Asn Lys Ile Val Ser Ser Ser Ser Lys
50 55 60
Ser Asn Leu Tyr Val Ala Gly Asn Lys Ser Asp Lys Lys Leu Tyr Ile
65 70 75 80
Ala Leu Thr Ser Asp Ser Gly Leu Cys Gly Gly Phe Asn Gly Ala Val
85 90 95
Val Thr Ala Ala Asp Asn Val Met Arg Gly Asp Lys Asp Lys Ser Leu
100 105 110
Leu Ile Thr Val Gly Gln Lys Gly Ile Ser Tyr Phe Lys Arg Leu Lys
115 120 125
Tyr Glu Thr Leu Ser Glu Tyr Val Asp Ile Pro Asn Glu Pro Gly Leu
130 135 140
Lys Glu Ala Lys Glu Ile Ala Asp Arg Ala Leu Ser Leu Tyr Glu Lys
145 150 155 160
Gly Glu Ile Gly Glu Val His Val Ile Tyr Thr Gln Phe Leu Ser Thr
165 170 175
Val Asn Gln Lys Val Glu Val Lys Lys Val Leu Pro Ile Glu Pro Lys
180 185 190
Lys Met Glu Lys Val Ser Val Ala Glu Phe Glu Pro Asp Ala Glu Ile
195 200 205
Ile Leu Glu Lys Ala Ile Arg Leu His Ile Glu Gln Gln Leu Phe Asn
210 215 220
Leu Leu Leu Asn Ser Lys Ala Ser Glu Gln Ala Ser Arg Met Ser Ser
225 230 235 240
Met Asp Ser Ala Thr Lys Asn Ala Asn Asp Leu Leu Asp Ala Leu Asn
245 250 255
Ile Lys Tyr Asn Arg Ile Arg Gln Ser Ala Ile Thr Gln Glu Ile Thr
260 265 270
Glu Ile Val Gly Gly Ala Glu Ala Leu Lys
275 280
<210>5
<211>331
<212>PRT
<213>丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)
<400>5
Met Pro Glu His Val Gly Lys Ile Val Gln Val Ile Gly Pro Val Val
1 5 10 15
AspIle Lys Phe Asp Ala Glu Asn Leu Pro Asp Ile Tyr Asn Ser Ile
20 25 30
Glu Ile Asp Met Gly Asp Asn Lys Lys Leu Ile Ala Glu Val Glu Gln
35 40 45
His Val Gly Asp Asp Ile Val Arg Thr Ile Ala Met Glu Gly Thr Asp
50 55 60
Gly Leu Lys Arg Gly Met Glu Ala Val Asn Thr Gly Lys Pro Ile Ser
65 70 75 80
Val Pro Val Gly Glu Asn Val Leu Gly Arg Leu Phe Asn Val Leu Gly
85 90 95
Gln Thr Ile Asp Glu Ala Gly Asp Met Asn Ala Asp Lys Tyr Tyr Pro
100 105 110
Ile His Arg Pro Ala Pro Thr Phe Glu Glu Gln Ser Val Gln Pro Glu
115 120 125
Met Phe Glu Thr Gly Ile Lys Val Ile Asp Leu Leu Ala Pro Tyr Gln
130 135 140
Lys Gly Gly Lys Ile Gly Leu Phe Gly Gly Ala Gly Val Gly Lys Thr
145 150 155 160
Val Leu Ile Gln Glu Leu Ile Asn Asn Ile Ala Lys Glu His Gly Gly
165 170 175
Leu Ser Val Phe Thr Gly Val Gly Glu Arg Thr Arg Glu Gly Asn Asp
180 185 190
Leu Tyr Tyr Glu Met Lys Asp Ser Gly Val Ile Asn Lys Thr Ala Leu
195 200 205
Val Phe Gly Gln Met Asn Glu Pro Pro Gly Ala Arg Met Arg Val Ala
210 215 220
Leu Thr Gly Leu Thr Met Ala Glu Tyr Phe Arg Asp Lys Gly Gln Asp
225 230 235 240
Val Leu Leu Phe Ile Asp Asn Ile Phe Arg Phe Thr Gln Ala Gly Ser
245 250 255
Glu Val Ser Ala Leu Leu Gly Arg Ile Pro Ser Ala Val Gly Tyr Gln
260 265 270
Pro Thr Leu Ala Asn Glu Met Gly Ala Leu Gln Glu Arg Ile Thr Ser
275 280 285
Thr Lys Gln Gly Ser Ile Thr Ser Val Gln Ala Val Met Phe Leu Leu
290 295 300
Met Thr Leu Gln Thr Gln Leu Gln Gln Gln His Leu Arg Ile Leu Met
305 310 315 320
Gln Gln Gln Phe Phe Gln Glu Lys Tyr Gln Thr
325 330