技术领域：
本发明涉及迷迭香酸在大肠杆菌L-天冬酰胺酶激活剂方面的应用，属于生 物医药领域。
背景技术：
L-天冬酰胺酶(L-Asparaginase；EC3.5.1.1)又名L-门冬酰胺酶或L-天门 冬酰胺酶，商品名为左旋门冬酰胺酶，是一种有抗癌活性的酶蛋白，广泛见于 动物的组织、细菌、植物和部分啮齿类动物的血清中，在大肠杆菌中为胞内酶， 但在人体的各种组织器官中的分布未见报道，最初是从豚鼠血清中提取的。L-天 门冬酰胺酶活性形式为一同源四聚体，每一亚基由330个氨基酸组成，能专一 催化L-天冬酰胺水解成天冬氨酸和氨。
1953年，Kidd发现豚鼠血清有抗癌作用，1961年Broom证实豚鼠血清中的抗 肿瘤因子是L-天冬酰胺酶。自20世纪70年代以来，人们利用大肠杆菌和欧文菌 等制备L-天冬酰胺酶，不仅应用于儿童急性淋巴细胞白血病的治疗，也应用于 祖金森病、淋巴肉瘤、黑素肉瘤和胰腺癌等疾病的治疗，取得了较好的疗效。 近年来的研究表明，此酶是一种重要的抗肿瘤药物，因而越来越受到人们的重 视。
临床上L-天冬酰胺酶广泛应用于儿童急性淋巴细胞白血病的治疗 (childhood acute lymphoblastic leukemia，ALL)。L-天冬酰胺酶单独使用 时，对ALL的有效率为60％，与长春碱(vincristine)及皮质甾类药物 (corticosteroids)联合使用时，对ALL的有效率高达95％。另外，L-天冬酰胺 酶对单细胞白血病、淋巴肉瘤、白血病性网状内皮组织增多症以及慢性髓细胞 白血病也有一定的疗效，对胰腺癌细胞的增多还有一定的抑制作用，是临床治疗 某些肿瘤的重要药物(韦玉军等，2005)。与普通化疗抗癌药相比，L-天冬酰胺 酶既可抑制癌细胞增殖，又不伤害正常细胞，有效地实现了酶的特异抗癌作用。
L-天冬酰胺酶在机体内可催化天冬酰胺的水解，其抗肿瘤的作用机制在于 它能够降低病变部位L-天冬酰胺和L-谷氨酰胺的浓度，这两种氨基酸是合成嘌 呤环和嘧啶环的重要组成部分。肿瘤细胞缺乏天冬酰胺合成酶，不能合成L-天 冬酰胺，需要摄取外源L-天冬酰胺才能存活。而正常细胞自身能合成L-天冬酰 胺，当外源L-天冬酰胺被分解掉时，癌细胞合成核苷酸和蛋白质的能力就会显 著降低，因此L-天冬酰胺酶能有效抑制肿瘤细胞的增殖。
L-天冬酰胺酶常来源于大肠杆菌，作为人体的异源蛋白，临床使用常常引 起一些副作用，从轻度的过敏反应如发热、恶心、呕吐、腹泻等到危险的过敏 性休克和血栓栓塞、胰腺炎等，这与细菌蛋白引起的免疫反应有关，这种不良 反应限制了L-天冬酰胺酶在治疗方面的应用。减弱免疫反应则有利于L-天冬酰 胺酶作为治疗癌症药物的应用，而降低其用量是一种有效的手段。微量迷迭香 酸能显著激活L-天冬酰胺酶，可以降低临床上L-天冬酰胺酶的用量，从而减弱 人体对该药物免疫反应。
迷迭香酸(Rosmarinic acid，简称RosA)是一种天然的酚酸化合物，最早 于1958年由Ellis在迷迭香中分离提取，因而得名。RosA广泛存在于唇形花科 和紫草科植物中。RosA的药理功能丰富，有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗 凋亡、抗凝集、抗过敏、抗抑郁、抗辐射的作用。目前已有多种从植物中提取 迷迭香酸的技术报道，杜桂彩等在其专利(ZL 200410075747.X)中介绍了一种 从紫苏中生产迷迭香酸的生产工艺；吕晓玲等也在申请的专利说明书(申请号： 200610015599.1)中公开了一种从含迷迭香酸的植物中提取迷迭香酸的方法； 热娜·卡斯木等在其申请的专利(申请号：200510056151.X)中介绍了一种从 新疆鼠尾草中提取迷迭香酸的方法及其在防治糖尿病并发症方面的应用。1990 年德国Nattermann公司已将迷迭香酸作为解热、镇痛、抗炎药投放市场，说明 该化合物人体使用的安全性。
基于迷迭香酸对大肠杆菌L-天冬酰胺酶的激活作用，临床上有望通过二者 的联合应用，降低L-天冬酰胺酶的用量，减轻其副作用；同时由于L-天冬酰胺 酶是细菌氮素代谢的关键酶，利用迷迭香酸或其衍生物激活胞内L-天冬酰胺酶， 导致氮素代谢紊乱，达到抗菌的目的。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种大肠杆菌L-天冬酰胺酶的激活剂；通过迷迭香 酸与L-天冬酰胺酶的联合用药可降低临床上肿瘤治疗过程中的L-天冬酰胺酶的 用量，降低因其免疫原性带来的副作用，或者据此设计针对细菌L-天冬酰胺酶 的靶位点的迷迭香酸衍生物作为新的抗菌药物。
为了实现上述发明目的，首先从大肠杆菌制备L-天冬酰胺酶提取液。将活 化好的大肠杆菌接种入LB培养液中37℃过夜培养；将培养物在4℃条件下离心， 收集菌体细胞；TE缓冲液(50mmol/LTris·Cl，1mmol/L EDTA，pH7.4)洗涤沉 淀，离心去上清；TE缓冲液悬浮细胞，超声破碎；在4℃条件下离心，得上清 液L-天冬酰胺酶提取液。
然后，在L-天冬酰胺酶活性测定体系中分别加入TE缓冲液以及不同浓度的 迷迭香酸和L-天冬酰胺，45℃水浴加热，用20％三氯乙酸终止反应。反应体系 离心后加AB-8大孔树脂悬浮液，充分振荡后离心以去除溶液中的迷迭香酸，避 免随后对检测的影响，分别取上清于蒸馏水中，加Nessler试剂，振荡使之充 分混匀后于395nm处测定吸光度，酶促反应速度(V)以每分钟产生的游离氨的 微摩尔数(μmol/min)表示。以L-天冬酰胺浓度的倒数(横坐标)对反应速度 的倒数(纵坐标)作图，1-5：迷迭香酸浓度分别为0、0.375×10-4、0.75×10-4、 1.5×10-4、3×10-4g/ml。[S]单位为mol/L；[V]单位为μmol/min。计算每个 迷迭香酸浓度下的米氏常数(Km)，判断迷迭香酸浓度对L-天冬酰胺酶的激活 作用。结果表明，迷迭香酸浓度为0.375×10-4～3.0×10-4g/ml时可显著提高体 系中L-天冬酰胺酶活性，降低大肠杆菌L-天冬酰胺酶催化L-天冬酰胺分解反应 的Km值，提高反应速度。
附图说明：
图1为迷迭香酸激活L-天冬酰胺酶的底物-反应速度双倒数 (Lineweaver-Burk)图。
具体实施方式：
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1：
(1)大肠杆菌制备L-天冬酰胺酶的提取
将活化好的大肠杆菌接种入400μl LB培养液中37℃过夜培养；将培养物 在4℃条件下10000r/min离心10分钟，收集菌体细胞；400μl TE缓冲液 (50mmol/LTris·Cl，1mmol/L EDTA，pH7.4)洗涤沉淀，离心去上清；20μl TE 缓冲液悬浮细胞，400瓦超声破碎，10秒破碎，90秒间隔，30次；在4℃条件 下10000r/min离心15分钟，得上清液L-天冬酰胺酶提取液。
(2)迷迭香酸对大肠杆菌制备L-天冬酰胺酶激活作用的测定
样品组反应体系中含TE缓冲液0.7ml、一定浓度的天冬酰胺溶液0.1ml(浓 度分别为4×10-3、2×10-3、1×10-3、0.5×10-3、0.25×10-3mol/L)、粗酶0.1ml、 一定浓度迷迭香酸溶液0.1ml(终浓度分别为0.375×10-4、0.75×10-4、1.5× 10-4、3×10-4g/ml)，45℃水浴加热10min，用0.1ml 20％三氯乙酸终止反应。 相应的对照组依次加入TE缓冲液0.7ml、天冬酰胺溶液0.1ml、迷迭香酸溶液 0.1ml、20％三氯乙酸0.1ml，混匀后加入L-天冬酰胺酶提取液0.1ml。反应体系 10000转/分钟离心5min后加0.3ml AB-8大孔树脂悬浮液，充分振荡20min后 10000转/分钟离心5min以去除溶液中的迷迭香酸，避免随后对检测的影响， 分别取样品组、对照组上清110μL于4.89ml蒸馏水中，加0.1ml Nessler试 剂(奈氏试剂)，振荡使之充分混匀后于395nm处测定吸光度，酶促反应速度(V) 以每分钟产生的游离氨的微摩尔数(μmol/min)表示。
结果表明，反应体系没有迷迭香酸时，L-天冬酰胺酶的米氏常数(Km)为 0.44642×10-4，当体系中迷迭香酸浓度为0.375×10-4、0.75×10-4、1.5×10-4、 3.0×10-4g/mL时，L-天冬酰胺酶的Km分别为0.38297×10-4、0.32515×10-4、 0.28539×10-4和0.21888×10-4，随着迷迭香酸浓度的提高，L-天冬酰胺酶的表 观米氏常数逐渐降低，迷迭香酸在其较低浓度时就有显著的促进作用。