本发明涉及肌醇六磷酸酶，其核苷酸序列，生产肌醇六磷酸酶的方法及 其用途。
发明领域
本发明涉及用于饲料添加剂的酶的领域。更具体地，本发明涉及肌醇六 磷酸酶，其可以用来增进食品和动物饲料中的磷酸酯消化。
技术背景和现有技术
肌醇六磷酸是谷类和豆类中磷的主要储存形式。不过，单胃动物如猪、 家禽和鱼并不能够代谢或吸收肌醇六磷酸(phytate)(或植酸(phytic acid)) 并且因此将其排泄出去，这引起家畜高产区的磷污染。另外植酸还在单胃 动物中通过螯合诸如钙、铜和锌的金属制剂而充当抗营养剂。
为了为这些动物的生长和健康提供足够的磷酸酯，向它们的膳食中添加 无机磷酸酯。这种添加成本高并且进一步增加了污染问题。
肌醇六磷酸被肌醇六磷酸酶(phytase)所转化，所述酶一般催化肌醇 六磷酸水解成低级的肌醇磷酸酯和无机磷酸酯。肌醇六磷酸酶可以用作动 物饲料的添加剂，在饲料中它们提高有机磷对于动物的可用性并且减少环 境的磷酸酯污染(Wodzinski RJ，Ullah AH.Adv Appl Microbiol.42，263-302 (1996))。
真菌(Wyss M.等Appl.Environ.Microbiol.65(2)，367-373(1999)； Berka R.M.等Appl.Environ.Microbiol.64(11)，4423-4427(1998)；Lassen S. 等Appl.Environ.Microbiol.67(10)，4701-4707(2001))和细菌(Greiner R. 等Arch.Biochem.Biophys.303(1)，107-113(1993)；Kerovuo等Appl. Environ.Microbiol.64(6)，2079-2085(1998)；Kim H.W.等Biotechnol.Lett.25， 1231-1234(2003)；Greiner R.等Arch.Biochem.Biophys.341(2)，201-206 (1997)；Yoon SJ.等Enzyme and microbial technol.18，449-454(1996)；Zinin N.V.等FEMS Microbiol.Lett.236，283-290(2004)))来源的许多肌醇六磷酸 酶已经在文献中得以描述。
不过，到目前为止，这些肌醇六磷酸酶中没有一种呈现有效用作动物饲 料添加物所需的特性。特别地，真菌肌醇六磷酸酶趋于对蛋白水解不稳定 (Igbasan F.A.等Arch.Anim.Nutr.53，353-373(2000))并且因此易于降解，而 大多数细菌肌醇六磷酸酶只对于肌醇六磷酸具有狭窄的底物特异性并且难 以降解中等程度磷酸化的肌醇磷酸酯(Greiner R.等，Arch.Biochem.Biophys. 303(1)，107-113(1993)；Kerovuo J等Biochem.J.352，623-628(2000))。
因此，需要改进的肌醇六磷酸酶。
发明概述
在宽泛的方面，本发明涉及源自细菌的肌醇六磷酸酶及其修饰形式。特 别地本发明涉及源自细菌弗氏柠檬酸杆菌的野生型肌醇六磷酸酶，及其与 野生型酶相比显示改进特性的变体/修饰形式。
本发明是有益的，因为它提供新的肌醇六磷酸酶，其具有使它们作为饲 料酶特别有用和有效的特性。特别地本发明涉及本文所述的分离的和/或纯 化的新肌醇六磷酸酶多肽或其功能片段或变体或修饰形式。本发明还提供 编码所述所述肌醇六磷酸酶的核酸和氨基酸序列。
为了有效地作为食品或动物饲料的酶添加剂，肌醇六磷酸酶必须组合许 多不同的特性。为了能够在动物胃的酸性环境中降解肌醇六磷酸，它必须 在低pH，优选在广泛的pH值范围上有活性。此外，它必须具有高度的比活 并且优选高度热稳定性以便使得蛋白质能够承受高温，而所述高温通常用 于饲料如饲料团粒的制备中。
所述酶具有宽泛的底物特异性也是重要的，以便使得它不仅能水解肌醇 六磷酸而且能水解肌醇六磷酸降解的中间产物，如肌醇五磷酸、肌醇四磷 酸和肌醇三磷酸。对于猪的肌醇六磷酸降解的研究显示这些肌醇寡磷酸酯 另外还在小肠和大肠中在很大程度上保持不可溶，并且因而难以被动物和 消化道微生物群产生的碱性磷酸酶所接近(Schlemmer U.等Arch.Anim. Nutr.55，255-280(2001))。已经鉴定了不同酶的底物特异性谱的变化。例如， 由枯草芽孢杆菌的肌醇六磷酸酶产生的肌醇三磷酸基本上耐受这种酶的进 一步水解(Kerovuo J.等Biochem J.(200)352，623-628)。
在本发明的另一方面提供包含本文所述的新的肌醇六磷酸酶或其修饰 形式的质粒或载体系统或经转化的或转基因的生物体。
在本发明的另一个方面涉及转基因生物，其已修饰来表达本文所述的新 的肌醇六磷酸酶或其修饰形式并且因此能够生产肌醇六磷酸酶。本发明进 一步提供生物技术生产肌醇六磷酸酶的手段和方法，及其作为饲料添加剂 的用途。
本发明的各方面在权利要求书和下面的注解中进行介绍。
为了便于参考，现在将本发明的这些和其它方面在合适的节段标题之下 进行讨论。不过，在每个节段之下的教导并不一定限于每个特定节段。
本发明所用的术语″生产″、″产生″、″生产的″、″可生产的″、″产品″与 各自相应的术语“制备”、“正在制备”、“经制备的”、“制品”、“经生成的”、“生 成”和“可制备的”同义。
本发明所用的术语″表达(expression)″，″表达(expresses)″，″经表达的″和 ″可表达的″与各自相应的术语″转录(transcription)″，″转录(transcribes)″， ″经转录的″和″可转录的″同义。
本发明所用的术语″转化″和″转染″指将核酸序列导入宿主、宿主细 胞、组织或器官中的方法。
涉及可以用于本发明中的核苷酸序列的其它方面包括：包含本发明序 列的构建体；包含用于本发明的序列的载体；包含用于本发明的序列的质 粒；包含用于本发明的序列的转化细胞；包含用于本发明的序列的转化组织； 包含用于本发明的序列的转化器官；包含用于本发明的序列的转化宿主；包 含用于本发明的序列的转化生物。本发明还包括利用其来表达用于本发明 的核苷酸序列的方法，如在宿主细胞中表达；包括其转移方法。本发明进一 步涉及分离所述核苷酸序列的方法，如由宿主细胞中分离。
涉及用于本发明中的氨基酸序列的其它方面包括：编码用于本发明的 氨基酸序列的构建体；编码用于本发明的氨基酸序列的载体；编码用于本 发明的氨基酸序列的质粒；表达用于本发明的氨基酸序列的转化细胞；表 达用于本发明的氨基酸序列的转化组织；表达用于本发明的氨基酸序列的 转化器官；表达用于本发明的氨基酸序列的转化宿主；表达用于本发明的 氨基酸序列的转化生物体。本发明还包括利用其纯化用于本发明的氨基酸 序列的方法，如在宿主细胞中表达；包括其转移方法，随后纯化所述序列。
附图简述
图1显示来自弗氏柠檬酸杆菌P3-42的重组肌醇六磷酸酶的SDS PAGE分析，所述重组肌醇六磷酸酶通过DEAE-琼脂糖层析法进行纯化。该 图给出了包含弗氏柠檬酸杆菌肌醇六磷酸酶样品的泳道的数码照相图像的 扫描图形。
图2显示来自弗氏柠檬酸杆菌P3-42的肌醇六磷酸酶的pH谱。
图3显示来自弗氏柠檬酸杆菌P3-42的纯化重组肌醇六磷酸酶的底物 特异性，以具有不同程度磷酸化作用的肌醇磷酸酯级分和模式底物作为底 物。缩写：IP6-肌醇六磷酸，1P5，IP4和IP3-分别指同分异构肌醇五-，四- 和三磷酸的混合物。Fru P2-果糖1，6-二磷酸，Fru P1-果糖6-磷酸。
SEQ ID NO：1列出了为了鉴定细菌菌株而获得的序列。
SEQ ID NO：2列出了包含来自弗氏柠檬酸杆菌P3-42的肌醇六磷酸酶 的序列。
SEQ ID NO：3列出了弗氏柠檬酸杆菌P3-42肌醇六磷酸酶基因的氨基 酸序列。
发明详细内容
本发明表征了一种酶，其包含对应于弗氏柠檬酸杆菌肌醇六磷酸酶或其 修饰形式、变体、功能等同物或有效片段的氨基酸序列。
术语″肌醇六磷酸酶″意指能够催化磷酸酯包括肌醇六磷酸的水解并 释放无机磷酸酯的蛋白质或多肽。除了肌醇六磷酸之外，肌醇六磷酸酶至 少能够水解某些中间程度磷酸化的肌醇磷酸酯。
术语″对应于弗氏柠檬酸杆菌肌醇六磷酸酶″意指不需获自弗氏柠檬 酸杆菌的酶。相反，该酶必须具有与弗氏柠檬酸杆菌肌醇六磷酸酶基本上 相同的功能特性或序列。
术语″其功能等同物”意指该酶必须具有与野生型弗氏柠檬酸杆菌肌醇 六磷酸酶基本上相同的功能特性。术语″修饰形式″或″变体″意指该酶由其 原始形式修饰而来，但基本上保留了与野生型弗氏柠檬酸杆菌肌醇六磷酸 酶基本上相同的酶学功能特性。特别地，术语″变体″或″修饰形式″包含这样 的肌醇六磷酸酶，其具有源自亲本/野生型肌醇六磷酸酶氨基酸序列的氨基 酸序列，并且具有一个或多个氨基酸取代、插入、和/或缺失，总称为突变。
修饰形式或变体与亲本酶相比可以改变酶特性。优选地，修饰形式或变体具 有提高的热稳定性、提高的胃蛋白酶稳定性、提高的比活、更宽泛的底物 特异性、或其它对于酶的应用有利的修饰。术语″功能性″或″有效″片段意 指基本上保留相同酶学功能或作用的弗氏柠檬酸杆菌肌醇六磷酸酶的片段 或部分。
优选地，本发明的这方面的酶具有与弗氏柠檬酸杆菌肌醇六磷酸酶的序 列相同的序列或至少75％同一(同源)的序列。
适当地，该酶包含如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或与其具有至少 75％同一性(同源性)的序列或其功能片段。在优选的实施方案中，本发明 提供一种分离和/或纯化的多肽，其具有如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列 或与其具有至少75％同一性(同源性)的序列或其有效片段。
在另一个实施方案中，所述肌醇六磷酸酶的特性在于它源自以编号 NCIMB 41247保藏的弗氏柠檬酸杆菌菌株P3-42。
在优选的实施方案中，本发明涉及根据本发明第一方面的任何实施方 案的肌醇六磷酸酶，其包含下列位置(根据SEQ ID No.3中的编号方法进 行编号)上的一个或多个突变： 22，23，24，28，46，53，57，67，74，75，77，78，79，82，88，95，96，97，98，101，102， 103，105，109，112，122，126，136，140，142，143，148，151，152，154，156，160， 161，164，168，170，176，177，195，199，203，204，205，206，207，215，224，225， 229，233，235，274，279，288，301，307，308，322，343，358，360，362，365，366， 367，370，383，384，385，386，391，393，395，397，408和414。
这些位置的特性在于该酶在这些位置上的诱变带来所需酶特性的改进。
优选的突变包括：A22T，E23K，E23Q，E24D，M28L，K46E，K46R，D53K， D53N，D57Y，G67R，G74R，E75K，E75V，V77I，S78T，E79V，Q82H，Q82K， Q82R，F88Y，N95D，N95P，N96P，N96S，N96Y，Q97T，T98G，T98P，S101F， P102L，G103E，V105I，A109T，D112V，D112Y，F122Y，L126I，Y136N，E140V， K142R，T143I，T143P，N148D，K151G，M152K，M152V，T154I，S156T，L160F， K161N，N164D，E168D，A170T，L176Q，L176V，Y177F，S195T，T199I，T203I， T203L，T203S，T203W，E204A，E204G，E204H，E204I，E204N，E204R，E204V， K205P，K205R，S206R，S206T，T207A，T207S，L215F，D224H，N225D，N225E， P229S，S233C，S235A，Q274H，Q274L，Q279E，R288M，L301S，E307Y，N308D， N308T，A322V，G343A，K358R，K360N，T362A，T362I，N365D，T366S，D367N， Q370H，D383V，I384F，I384L，I384M，Q385R，P386Q，K391N，A393P，K395T， D397N，S408I和L414I或在每个位置上的保守性突变。
″保守性突变″意指对于与所示氨基酸残基相比在氨基酸特性上保守的 氨基酸残基进行的突变。氨基酸特性包括残基大小、疏水性、极性、电荷、 pK-值以及本领域已知的和在下面更加详细描述的其它氨基酸特性。
在特别优选的实施方案中，在一个或多个下列位置上突变：
23，46，53，75，82，88，95，96，98，112，143，152，176，177，199，203，204， 205，225，229，233，274，288，307，308，362，370，384和385。
在这些具体位置上的优选突变包括： E23K，E23Q，K46E，K46R，D53K，D53N，E75K，E75V，Q82H，Q82K，Q82R， F88Y，N95D，N95P，N96P，N96S，N96Y，T98G，D112V，D112Y，T143I，T143P， M152K，M152V，L176Q，L176V，Y177F，T199I，T203I，T203L，T203S，T203W， E204A，E204G，E204H，E204I，E204N，E204R，E204V，K205P，K205R，N225D， N225E，P229S，S233C，Q274H，Q274L，R288M，E307Y，N308D，N308T， T362A，T362I，Q370H，I384F，I384L，I384M和Q385R或每个位置上的保守性 突变。
在一个实施方案中，提供了包含选自下组的一个突变的肌醇六磷酸酶：
P229S；D112V；Q82R；Q274H；D112Y；F88Y；K46E；S233C；R288M； I384L；Q385R；Q274L；E307Y；T199I；Q82K和T203I。
在其它优选的实施方案中，提供了包含选自下组的突变组合的肌醇六磷 酸酶：
K46E/Q82H；Q82K/V105I；N148D/T362I；K46E/L414I；F88Y/Y136N；
T154I/P386Q；N95P/N96S；N95P/N96P；Q97T/T98G；D224H/N225E；
Y177F/T199I；Q274L/Q370H；K46E/N96Y；N148D/L301S；E24D/R288M；
E140V/A322V；K46E/S195T；E75K/N365D；T98P/S235A；L160F/L215F；
Q274L/K395T；G67R/Q279E/N308T；K161N/P229S/R288M；
D53N/D57Y/M152V；F122Y/S156T/P229S；T199I/S206R/T207S；
E23K/K46E/Q82H；K46E/Q82H/Q385R；T203W/E204N/K205R；
T203W/E204H/K205R；T203W/E204R/K205R；T203W/E204A/K205R；
A22T/K151G/N308D；E23K/E75K/F88Y；M152K/N225D/L301S；
S78T/Q274L/S408I；L176Q/T199I/T366S；K46E/V77I/T203S；
K46R/T199I/D367N；G74R/E204G/R288M；A22T/T199I/S206T/T207A；
Q82R/F88Y/L126I/I384L；K46E/Q82H/E168D/Q274L；
Q82K/T154I/Q279E/N308T；Q82R/D112V/Q274H/T362A；
E24D/E79V/N95D/K360N；E23K/M28L/A109T/T143P/I384L；
D53N/D57Y/T199I/P229S/R288M；K46E/Q82H/N148D/T154I/T362I；
D53N/D57Y/P229S/R288M/K358R；D53N/D57Y/T154I/P229S/R288M；
Y136N/T199I/T203L/E204I/K205P；E23Q/S101F/Q274L/I384M/K391N；
K46E/Q82H/N95D/D112V/K142R/D383V；
D53N/D57Y/M152V/P229S/R288M/A393P；
D53K/D57Y/M152V/P229S/R288M/A393P；
D53N/D57Y/F88Y/M152V/P229S/Q279E/N308T；
D53N/D57Y/M152V/E204V/P229S/R288M/A393P；
D53N/D57Y/M152V/T154I/P229S/R288M/A393P；
D53N/D57Y/Q82H/G103E/M152V/P229S/R288M/A393P；
K46E/D53N/D57Y/T143I/M152V/L176V/P229S/R288M/A393P；
Q82K/F88Y/N96P/Q97T/T98G/V105I/Q274H/Q279E/A393P；
Q82R/F88Y/N95P/N96P/Q97T/Q279E/I384L/P386Q/A393P；
H18Q/D53N/D57Y/E75V/M152V/A170T/P229S/R288M/Q385R/A393P；
Q82K/F88Y/N96P/T98G/Y136N/M152V/Y177F/T362I/I384F/A393P/D397N；
D53N/D57Y/F88Y/N95P/N96P/V105I/D112V/Y136N/N148D/N164D/Q274H/ T362I/I384L/A393P；
D53N/D57Y/Q82K/F88Y/N95P/P102L/V105I/Y136N/N148D/Y177F/Q274H /Q279E/T362I/A393P，和；
D53N/D57Y/Q82K/F88Y/N96P/T98G/V105I/D112V/Y177F/Q274L/G343A /T362I/I384L/A393P。
在又一个优选的实施方案中，提供了包含选自下列突变组合的肌醇六磷 酸酶：
D57Y/F88Y/N95P/Q97T/N148D/M152V/T154I/Y177F/Q274H/I384L；
D53N/D57Y/F88Y/N95P/N96P/Q97T/M152V/Y177F/Q274H/Q279E/T362I /I384L；
D53N/Q82K/F88Y/N96P/T98G/V105I/N148D/T154I/Q274H/T362I/I384L /P386Q；
Q82R/F88Y/N96P/T98G/V105I/D112V/Y136N/N148D/T154I/Y177F/P386Q /A393P；
D53N/Q82K/F88Y/N95P/N96P/T98G/Y136N/N148D/T154I/I384L/P386Q /A393P；
D57Y/Q82K/F88Y/N96P/Q97T/T98G/V105I/N148D/T154I/Y177F/Q274H /I384L/P386Q/A393P；
D53N/Q82K/F88Y/N95P/Q97T/T98G/D112V/Y136N/N148D/T154I/Q274H /Q279E/I384L/P386Q/A393P和
D53N/D57Y/Q82R/F88Y/N95P/N96P/Q97T/T98G/V105I/Y136N/N148D /M152V/Y177F/I384L/P386Q。
因此，根据本发明的优选肌醇六磷酸酶是由SEQ ID NO：3所列氨基酸 序列组成的变体，并且具有一种或多种上面列出的氨基酸突变，或上面列 出的突变组合中的一种。
在这些实施方案中，命名法指示一种肌醇六磷酸酶，其包含SEQ ID NO： 3中所示氨基酸序列，具有参照SEQ ID NO：3中氨基酸位置所指示的突变。 下面对该命名法作更加详细描述。
关于下列任一种特性，这些变体适当地显示改善的特性：温度稳定性， pH范围，胃蛋白酶稳定性，比活，底物特异性。本文公开了测定这些特性 的合适方法。
特别地，肌醇六磷酸酶特性的改进针对：食品和饲料加工条件下的酶稳 定性，胃部通行过程中的酶稳定性，和人或动物胃和/或肠道中的酶活性和 稳定性，使得改进的变体特别适于用作饲料添加剂。因而，这些改进除其 他参数外还包括在升高温度下提高稳定性，优选在65℃以上的温度下，提 高针对蛋白水解消化的稳定性，优选消化道的蛋白酶，提高低pH下的催化 活性，优选pH5.5以下的催化活性，和从肌醇六磷酸上释放磷酸酯基团的 一般效率等参数。
适当地，在一个实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶或功能等同物的特 征在于所述肌醇六磷酸酶具有1000U/mg或更高的比活，其中所述比活通 过将所述肌醇六磷酸酶在包含2mM肌醇六磷酸，0.8mM CaCl2的200mM 醋酸钠缓冲液的溶液pH 3.5中温育而进行测定。在另一个实施方案中，本 发明的肌醇六磷酸酶或其功能等同物的特征还可以适当地为所述肌醇六磷 酸酶在pH 3和pH 4-4.5附近具有两个活性最大值，其中所述活性通过将 所述肌醇六磷酸酶在包含2mM肌醇六磷酸，0.8mM CaCl2的200mM醋酸 钠缓冲液的溶液中温育而进行测定。
在本发明的另一个实施方案中提供了制备肌醇六磷酸酶变体的方法，所 述方法包括：
a)选择亲本肌醇六磷酸酶，其中亲本肌醇六磷酸酶选自
i.与SEQ ID No 3具有至少75％同源性的亲本肌醇六磷酸酶
ii.源自柠檬酸杆菌属(Citrobacter spp.)的亲本肌醇六磷酸酶
b)在亲本肌醇六磷酸酶中制造至少一种变化，所述变化为氨基酸残基插入、 缺失或取代，以获得肌醇六磷酸酶变体
c)筛选肌醇六磷酸酶变体，它与亲本肌醇六磷酸酶相比具有：
i.较高的热稳定性和/或
ii.比活和/或
iii.蛋白水解稳定性和/或
d)制备肌醇六磷酸酶变体。
在本发明的另一个实施方案中提供一种制备肌醇六磷酸酶变体的方法， 所述方法包括：
a)将编码亲本肌醇六磷酸酶的DNA序列进行诱变，其中所述亲本肌醇 六磷酸酶选自
i.与SEQ ID No 3具有至少75％同源性的亲本肌醇六磷酸酶
ii.源自柠檬酸杆菌属的亲本肌醇六磷酸酶
b)将步骤(A)中获得的突变DNA序列在宿主细胞中表达，和
c)筛选表达肌醇六磷酸酶变体的宿主细胞，所述肌醇六磷酸酶变体与 亲本肌醇六磷酸酶相比具有：
iv.更高的热稳定性和/或
v.更高的比活*和/或
vi.更高的蛋白水解稳定性和/或
制备由宿主细胞表达的肌醇六磷酸酶变体。
在以上本发明的涉及制备肌醇六磷酸酶变体的实施方案中，优选筛选肌 醇六磷酸酶变体的更高的热稳定性。
在以上本发明的涉及制备肌醇六磷酸酶变体的实施方案中，优选筛选肌 醇六磷酸酶变体的更高的热稳定性和更高的蛋白水解稳定性。
在以上本发明的涉及制备肌醇六磷酸酶变体的实施方案中，优选筛选肌 醇六磷酸酶变体的更高的热稳定性和更高的蛋白水解稳定性和更高的比 活。
所述亲本肌醇六磷酸酶优选源自弗氏柠檬酸杆菌，更加优选弗氏柠檬 酸杆菌P3-42。
在制备肌醇六磷酸酶变体的方法中，所述方法包括将编码亲本肌醇六磷 酸酶的DNA序列进行诱变，优选将编码亲本肌醇六磷酸酶的DNA序列进 行随机诱变，更加优选易错PCR(error prone PCR)，还要更加优选错误阈 值PCR(error threshold PCR)。
优选的编码亲本肌醇六磷酸酶的DNA序列的诱变方法是易错PCR，更 加优选错误阈值PCR，其它突变方法可以取代易错PCR/错误阈值PCR使用， 或结合易错PCR/错误阈值PCR使用。参见实施例12，其提供了合适的易 错PCR和错误阈值PCR方法的参照。其他方法披露于
当用在涉及肌醇六磷酸酶变体制备方法的实施方案的语境中时，术语 ‘在宿主细胞中表达′优选定义为在本文定义的活体生物、器官或细胞中生 产肌醇六磷酸酶变体。不过，考虑到为了选择的目的，肌醇六磷酸酶变体 也可以通过体外方法进行生产，所述方法利用分离自一个或多个活体生物 的一个或多个细胞的转录和翻译机制。本发明的变体肌醇六磷酸酶的这种 体外生产也可以用于选择优选的变体肌醇六磷酸酶。体外表达可以适当地 利用标准技术进行。关于参考文件请参见Promega公司的‘In vitro Expression Guide′(部分号BR053)。
变体表型的定义
优选利用实施例12中所公开的方法来测定具有更高热稳定性(热稳定 性差异)的变体。
通过制备肌醇六磷酸酶变体的方法制备的变体肌醇六磷酸酶优选具有 至少1.5的热稳定性差异，更加优选2，2.5，3，3.5，4，5，6，7，8，9，最优选地至 少10。
优选通过实施例12中所公开的方法来测定具有更高蛋白水解稳定性的 变体。
本发明的肌醇六磷酸酶变体优选具有至少至少45％，优选50％，55％， 更加优选至少60％的蛋白水解稳定性。
其它变体实施方案
在其它实施方案中本发明提供制备包含肌醇六磷酸酶变体的动物饲料 的方法。
a)选择亲本肌醇六磷酸酶，其中所述亲本肌醇六磷酸酶选自
i.与SEQ ID No 3具有至少75％同源性的亲本肌醇六磷酸酶
ii.源自柠檬酸杆菌属的亲本肌醇六磷酸酶
b)在亲本肌醇六磷酸酶中制造至少一种变化，所述变化为氨基酸残基 插入、缺失或取代，以获得肌醇六磷酸酶变体
c)筛选肌醇六磷酸酶变体，它与亲本肌醇六磷酸酶相比具有：
i.较高的热稳定性和/或
ii.比活和/或
iii.蛋白水解稳定性和/或
d)制备肌醇六磷酸酶变体
e)向动物饲料中添加制备的肌醇六磷酸酶变体。
在其它实施方案中本发明提供制备包含肌醇六磷酸酶变体的动物饲料 的方法。
a)将编码亲本肌醇六磷酸酶的DNA序列进行诱变，其中所述亲本肌醇 六磷酸酶选自
iii.与SEQ ID No 3具有至少75％同源性的亲本肌醇六磷酸酶
iv.源自柠檬酸杆菌属的亲本肌醇六磷酸酶
b)将步骤(A)中获得的突变DNA序列在宿主细胞中表达，和
c)筛选表达肌醇六磷酸酶变体的宿主细胞，所述变体与亲本肌醇六磷 酸酶相比具有：
vii.更高的热稳定性和/或
viii.更高的比活*和/或
ix.更高的蛋白水解稳定性和/或
d)制备由所述宿主细胞表达的肌醇六磷酸酶变体
f)向动物饲料中添加制备的肌醇六磷酸酶变体。
制备肌醇六磷酸酶变体的方法的优选方面还应用到制备包含肌醇六磷 酸酶变体的动物饲料的以上方法中。
在另一方面，本发明提供分离和/或纯化的编码包含对应于弗氏柠檬酸 杆菌肌醇六磷酸酶氨基酸序列的酶或其同源物的核酸分子或核苷酸序列。 适当地所述分离和/或纯化的核酸分子编码包含如SEQ ID NO：3所示氨基酸 或与其具有至少75％同一性(同源性)的序列或其有效片段的多肽。在一个 实施方案中，所述核酸分子编码包含SEQ ID NO：3并在本文所列出的优选 位置上包括突变或包括本文所列出的任意特定突变或突变组合的多肽。在 另一个实施方案中，本发明提供分离和/或纯化的核酸分子，其包含与SEQ ID NO：2相同，或互补，或含有对SEQ ID NO：2的任意密码子的合适的密 码子取代，或包含与SEQ ID NO：2具有至少75％，80％，85％，90％，95％，96％， 97％，98％或99％序列同源性的序列的核苷酸序列。
在又一方面，本发明涉及如下所示的核苷酸序列和核苷酸序列的用途：
(a)如SEQ ID NO：2所给出的核苷酸序列，
(b)如SEQ ID NO：2所给出的核苷酸序列的变体、同源物、衍生物或片 段的核苷酸序列；
(c)如SEQ ID NO：2所给出的核苷酸序列的补体(complement)的核苷 酸序列；
(d)如SEQ ID NO：2所给出的核苷酸序列的变体、同源物、衍生物或片 段的补体的核苷酸序列；
(e)能够与SEQ ID NO：2所给出的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；
(f)能够与SEQ ID NO：2所给出的核苷酸序列的变体、同源物、衍生物 或片段杂交的核苷酸序列；
(g)能够与SEQ ID NO：2所给出的核苷酸序列杂交的核苷酸序列的补体 的核苷酸序列；
(h)能够与SEQ ID NO：2所给出的核苷酸序列的变体、同源物、衍生物 或片段杂交的核苷酸序列的补体的核苷酸序列；
(i)能够与SEQ ID NO：2所给出的核苷酸序列的补体杂交的核苷酸序 列；
(j)能够与SEQ ID NO：2所给出的核苷酸序列的变体、同源物、衍生物 或片段的补体杂交的核苷酸序列。
本发明的核苷酸序列可以包含编码SEQ ID No.3或其变体，修饰形式， 同源物或衍生物的序列。
特别地，本发明提供包含如本文所述的肌醇六磷酸酶或其同源物或衍 生物的质粒或载体系统。优选地，所述质粒或载体系统包含如SEQ ID NO：2 所给出的核苷酸序列或与其至少75％同源的序列或其有效片段。适当地所 述质粒或载体系统是一种表达载体，用于在微生物中表达任一种由SEQ ID NO：2或与其至少75％同源(同一)的序列所给出的核酸序列编码的酶。此 外，本发明提供质粒或载体系统，来表达本文所述的任一种改进的酶或变 体。本文介绍了合适的表达载体。
在本发明的另一方面提供了用编码本文所述的肌醇六磷酸酶的核酸转 化或转染的宿主细胞。
适当地，根据本发明这方面的宿主细胞包含肌醇六磷酸酶，所述肌醇六 磷酸酶含有SEQ ID No：3的氨基酸序列，或其功能片段，或与其至少75％ 同源的序列。
在优选的实施方案中，所述宿主细胞产生肌醇六磷酸酶。
在本发明的另一方面提供了用编码根据本发明的肌醇六磷酸酶的核酸 转化或转染的宿主细胞。肌醇六磷酸酶是如本文所述的弗氏柠檬酸杆菌肌 醇六磷酸酶或其同源物或衍生物。适当地，所述肌醇六磷酸酶包含SEQ ID No：3给出的氨基酸序列，或其功能片段，或与其至少75％同源(同一) 的序列。优选地，所述宿主细胞产生肌醇六磷酸酶。
在一个实施方案中，可用于本发明中的核苷酸序列可获自(尽管它实际 上不一定要获自)弗氏柠檬酸杆菌，尽管将认识到分离和/或纯化自等同菌 株的酶可以等同地使用。
适当地所述宿主细胞源自微生物包括细菌和真菌，包括酵母。在特别优 选的实施方案中所述宿主细胞是原核细菌细胞。合适的细菌宿主细胞包括 来自不同原核分类组的细菌，所述分类组包括变形菌门(proteobacteria)，包 括α，β，γ，Δ和ε细部的成员，革兰氏阳性细菌如放线菌纲 (Actinomycetes)，硬壁菌门(Firmicutes)，梭菌属(Clostridium)和近缘生物， 黄杆菌属(flavobacteria)，蓝细菌(cyanobacteria)，绿色硫细菌(green sulfurbacteria)，绿色无硫细菌(green non-sulfurbacteria)，和archaea。特 别优选的是肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，如大肠杆菌，属于γ细部和低 GC革兰氏阳性细菌如杆菌属(Bacillus)的变形菌门。
合适的真菌宿主细胞包括酵母，所述酵母选自下组：子囊菌门 (Ascomycota)，包括酵母纲(Saccharomycetes)，如毕赤酵母属(Pichia)， 汉森酵母属(Hansenula)，和酵母属(saccharmyces)，裂殖酵母纲 (Schizosaccharmycetes)，如粟酒裂殖酵母(Schizosacchromyces pombe)，和 变形子囊菌门(anamorphic Ascomycota)，包括曲霉属(Aspergillus)。
其它合适的真核宿主细胞包括昆虫细胞，如SF9，SF21，Trychplusiani和 M121细胞。例如，根据本发明的多肽可以有益地在昆虫细胞系统中表达。 除了在培养的昆虫细胞中表达之外，肌醇六磷酸酶基因还可以在完整的昆 虫生物体中表达。病毒载体如杆状病毒可以感染完整的昆虫。大型昆虫， 如蚕蛾，提供高产量的异源蛋白。可以根据常规提取技术将蛋白质从昆虫中 提取出来。适用于本发明的表达载体包括所有能够在昆虫细胞系中表达外 源蛋白的载体。
其它宿主细胞包括选自下组的植物细胞：原生质体、细胞、愈伤组织、 组织、器官、种子、胚、胚珠、合子等。本发明还提供已经转化并包含本 发明的重组DNA的完整植物。
术语″植物″一般包括真核藻类、有胚植物，所述有胚植物包括苔藓植 物门(Bryophyta)、蕨类植物门(Pteridophyta)和种子植物门(Spermatophyta)， 所述种子植物门诸如裸子植物亚门(Gymnospermae)和被子植物亚门 (Angiospermae)。
优选地，所述宿主细胞是微生物。优选的微生物包括原核细菌细胞，优 选地大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.Subtilis)和杆菌属的其它物种， 酵母，优选多形汉森氏酵母(Hansenula Polymorpha)和粟酒裂殖酵母。
在本发明的另一方面提供了细菌细胞菌株弗氏柠檬酸杆菌P3-42，由 Danisco Global Innovation，Sokeritehtaantie 20，FIN-02460Kantvik，Finland保 藏，保藏号NCIMB 41247。可以将这种细胞直接掺入饲料中。
在另一方面，提供了一种生产肌醇六磷酸酶的方法，包括用根据本发明 1999，Short Protocols in Molecular Biology，第7-58到7-60页)。
不过，对于一些应用，优选使用GCG Bestfit程序。一种称作BLAST2 序列的新工具也可以用于比较蛋白和核苷酸序列(见FEMS Microbiol Lett 1999 174(2)：247-50；FEMS Microbiol Lett 1999 177(1)：187-8 和tatianancbi.nlm.nih.gov)。
尽管最终同源性百分比可以根据同一性而测量，对比过程自身一般不以 全或无成对比较为基础。相反，通常使用按比例绘制的(scaled)相似性评 分矩阵将得分分配到每个以化学相似性或进化距离为基础而进行的成对比 较。这种常用矩阵的一个例子是BLOSUM62矩阵，即BLAST程序系列的 缺省矩阵。GCG Wisconsin程序一般用公共默认值或如果已提供，则使用自 定义符号比较表(更详细内容见用户手册)。对于一些应用，优选将公共默认 值用于GCG软件包，或在使用其它软件的情况下，使用缺省矩阵，如 BLOSUM62。
或者，可以利用DNASISTM(Hitachi软件)中的多重比对特征，基 于类似于CLUSTAL(Higgins DG&Sharp PM(1988)，Gene 73(1)，237-244)的算 法来计算百分比同源性。
一旦软件产生最优对比，就有可能计算％同源性，优选％序列同一性。 软件一般作为序列比较的一部分进行此计算并产生以数字表示的结果。
序列也可以有产生沉默改变并导致产生功能等同物的氨基酸残基缺失、 插入或取代。可以根据氨基酸特性(如残基的极性、电荷、溶解性、疏水 性、亲水性、和/或双亲性)的相似而进行有意的氨基酸取代，所以将氨基 酸以官能团分类在一起是有用的。氨基酸可以仅仅以它们的侧链特性而分 类在一起。不过，包括突变数据等更加有用。由此衍生的氨基酸组有可能 由于结构的原因而是保守的。这些组能够以Venn图表的形式描述 (Livingstone C.D.和Barton GJ.(1993)″Protein sequence alignments：a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation″Compiit.Appl Biosci.9：745-756)(Taylor W.R.(1986)″The classification of amino acid conservation″J.Theor.Biol.119；205-218)。例如根据下表可以制备保守性取 代，所述表描述了普遍接受的氨基酸分类的Venn图表。
的表达载体或质粒转染宿主细胞，在肌醇六磷酸酶的表达条件下培养所述 宿主细胞，和从宿主细胞培养基中提取所述肌醇六磷酸酶。
适当地所述方法是生产肌醇六磷酸酶的方法，包括在宿主细胞中表达如 SEQ ID NO：3所给出的氨基酸序列或与其具有至少75％同源性的序列或其 有效片段，以及从宿主细胞培养基中提取分泌的蛋白。
本发明的另一方面提供一种包含根据本发明的肌醇六磷酸酶的饲料组 合物。优选地，所述饲料组合物包含浓度为10-10000U/kg饲料的肌醇六磷 酸酶，优选200-2000U/kg饲料，更加优选500-1000U/kg饲料。
在一个实施方案中，饲料组合物包含根据本发明的宿主细胞。
在另一方面提供根据本发明的肌醇六磷酸酶在食品或动物饲料中的应 用。
优选的方面
在随附的权利要求书和后面的介绍以及实施例部分中给出优选的方面。
其它优点
本发明是有益的，因为它提供了具有许多特性的肌醇六磷酸酶，这些特 性使得它们作为动物饲料的添加剂特别有用。
特别地，本发明的肌醇六磷酸酶在低pH下具有活性，优选pH 2-5.5的 范围，活性最大值在pH 3和4.5左右。适当地本发明的肌醇六磷酸酶在胃 环境的低pH下具有活性。
另外，本发明的肌醇六磷酸酶在天然宿主和在异源表达期间都可以有效 地分泌，由此带来更加有效的生产和分离用于添加到饲料中。
而且，本发明的肌醇六磷酸酶具有宽泛的底物特异性，包括五-，四-， 三-和二磷酸酯底物，由此增加了可用于动物的总的磷酸酯。本发明的肌醇 六磷酸酶还具有1000U/mg+/-大约10％的高度比活。
本发明的产品可以用作食品和饲料的添加剂/补充物。该产品还可以用 于各种肌醇磷酸酯的商业生产。
肌醇六磷酸/植酸/肌醇六磷酸酶
植酸(肌肌醇六磷酸(myo-inositol hexakisphosphate))是谷类、豆类、 油籽作物中的重要组分。盐的形式，肌醇六磷酸，是磷在这些植物中的主 要储存形式。
肌醇六磷酸酶催化植酸的磷酸单酯水解，这导致逐步形成肌肌醇五-， 四-，三-，二-和单磷酸酯，以及无机磷酸酯的释放。
本文所用的术语″野生型肌醇六磷酸酶″或″野生型″指具有天然发现的 氨基酸序列的肌醇六磷酸酶。
术语″肌醇六磷酸酶变体″或″变体″或″修饰形式″指具有源自亲本肌醇 六磷酸酶氨基酸序列的氨基酸序列的肌醇六磷酸酶，其具有一个或多个氨 基酸取代、插入，和/或缺失，它们总称为″突变″。
术语″亲本肌醇六磷酸酶″或″亲本酶″指由其衍生出肌醇六磷酸酶变 体的肌醇六磷酸酶。亲本肌醇六磷酸酶可以是野生型肌醇六磷酸酶或另一 种肌醇六磷酸酶变体。特别地，在本发明中，″亲本肌醇六磷酸酶″可以源自 弗氏柠檬酸杆菌。适当地，″亲本肌醇六磷酸酶″源自如本文所述的弗氏柠 檬酸杆菌菌株P3-42，其优选具有SEQ ID NO：3中给出的氨基酸序列。
分离的
一方面，优选核苷酸或氨基酸序列为分离的形式。术语″分离的″意指 该序列至少基本上不含至少一种其它组分，而这种组分是与该序列天然相 关联的，如天然所发现的那样。
纯化的
一方面，优选核苷酸或氨基酸序列为纯化的形式。术语″纯化的″意指 该序列处于相对纯的状态—例如至少大约90％纯，或至少大约95％纯或至 少大约98％纯。
核苷酸序列
本发明的范围包括编码如本文所定义的特定特性的酶的核苷酸序列。
本文所用的术语″核苷酸序列″指寡核苷酸序列，核酸或多核苷酸序 列，及其变体，同源物，片段和衍生物(如其部分)。核苷酸序列可以是基因组 或合成或重组起源的，其可以是双链或单链的，不管代表有义链还是反义 链。
涉及本发明的术语″核苷酸序列″或″核酸分子″包括基因组DNA，cDNA， 合成DNA，和RNA。优选地它意指DNA，更加优选编码本发明的cDNA 序列。
在优选的实施方案中，当涉及和当被本发明的自身范围所包括时，核苷 酸序列并不包括处于天然环境之中、并与其天然相关联的一个或多个序列 相连的根据本发明的天然核苷酸序列，而所述天然相关联的序列也处于其 天然环境之中。为了方便参考，我们将把这种优选的实施方案称为“非天然 核苷酸序列”。在这点上，术语″天然核苷酸序列″意指处于其天然环境之 中的完整核苷酸序列，以及当它与天然相关联的完整启动子可操作性连接 之时，所述启动子也处于天然环境之中。不过，本发明的范围所包括的氨 基酸序列可以是其天然生物中表达后分离和/或纯化的核苷酸序列产物。不 过，本发明的范围所包括的氨基酸序列优选可以在其天然生物中由核苷酸 序列所表达，但是其中所述核苷酸序列并不在该生物中与所述核苷酸序列 天然相关联的启动子的控制之下。
核苷酸序列的制备
一般，本发明的范围所包括的氨基酸序列或用于本发明的核苷酸序列是 利用重组DNA技术制备的(即，重组DNA)。不过，在本发明的备选实施 方案中，可以利用本领域公知的化学方法全部或部分地合成核苷酸序列(参 见Caruthers MH(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 215-23和Horn T等， (1980)Nuc Acids Res Symp Ser 225-232)。
由产生所述酶的任何细胞或生物可以鉴定和/或分离和/或纯化出编码 具有如本文所定义的特定特性的酶或适于修饰的酶的核苷酸序列。本领域 已知多种方法来鉴定和/或分离和/或纯化核苷酸序列。例如，一旦已经鉴定 和/或分离和/或纯化了合适的序列，就可以使用制备更多序列的PCR扩增技 术。
例如，利用来自产生所述酶的生物的染色体DNA或信使RNA可以构 建基因组DNA和/或cDNA文库。如果已知该酶的氨基酸序列或该酶的部 分氨基酸序列，可以合成标记的寡核苷酸探针并用来由基因组文库鉴定编 码酶的克隆，所述文库由所述生物制备。或者，可以利用包含与另一种已 知酶基因同源的序列的经标记的寡核苷酸探针来鉴定编码酶的克隆。在后 一种情况中，利用低严格度的杂交和洗涤条件。
或者，可以通过将基因组DNA片段插入表达载体，如质粒中，用得到 的基因组DNA文库转化酶阴性细菌，随后将转化的细菌铺平板到包含该酶 底物(例如对于产葡萄糖苷酶(麦芽糖酶)的酶，底物为麦芽糖)的琼脂 板上，由此得以鉴定表达该酶的克隆，来鉴定编码酶的克隆。
在又一个备选方案中，可以通过已确立的标准方法合成性制备编码酶的 核苷酸序列，例如由Beucage S.L.等，(1981)Tetrahedron Letters 22，p 1859- 1869所述的氨基磷酸酯(phosphoroamidite)方法，或由Matthes等，(1984) EMBO J.3，p 801-805所述的方法。在氨基磷酸酯方法中，在自动DNA合成 仪中合成寡核苷酸，纯化，退火并克隆在合适的载体中。
核苷酸序列可以是混合的基因组和合成起源的，混合的合成和cDNA 起源的，或混合的基因组和cDNA起源的，通过根据标准技术连接合成的、 基因组的或cDNA起源(根据需要)的片段而制备。每一个连接的片段都 对应于完整核苷酸序列的各部分。还可以通过聚合酶链式反应(PCR)利用 特定引物来制备DNA序列，例如在US 4,683,202或在Saiki R K等，(Science (1988)239，pp 487-491)中所述的。
由于遗传密码的简并性，可以轻易地生产核苷酸序列，其中对于一些或 所有由原始核苷酸序列编码的氨基酸改变了三联体密码子用法，由此产生 与原始核苷酸具有低同源性的核苷酸序列，但是它编码与原始核苷酸序列 所编码的相同、或变体氨基酸序列。例如，对于大多数氨基酸来说，遗传 密码的简并性是在三联体密码子中的第三个位置上(摆动位置)(参考文献 见Stryer，Lubert，Biochemistry，Third Edition，Freeman Press，ISBN 0-7167-1920-7)，因此，所有三联体密码子都在第三位置上发生“摆动”的核 苷酸序列与原始核苷酸序列将具有大约66％的同一性，然而，改变的核苷 酸序列将与原始核苷酸序列编码相同或变异的一级氨基酸序列。
所以，本发明进一步涉及任何核苷酸序列，所述核苷酸序列对于编码氨 基酸的至少一个三联体密码子改变了三联体密码子用法，但是它与原始核 苷酸序列编码的多肽序列具有相同、或变体多肽序列。
另外，具体的生物一般对于用来编码氨基酸的三联体密码子有所偏好。 优选的密码子用法表是随处可得的，并且可以用来制备密码子优化基因。 常规使用这些密码子优化技术来优化异源宿主中的转基因表达。
分子进化
一旦分离和/或纯化了编码酶的核苷酸序列，或鉴定了推定的编码酶的 核苷酸序列，可以希望修饰选定的核苷酸序列，例如希望对序列进行突变 从而制备根据本发明的具有改进稳定性特征的酶。
可以利用合成性寡核苷酸来导入突变。这些寡核苷酸包含位于所需突变 位点侧翼的核苷酸序列。
在Morinaga等(Biotechnology(1984)2，p646-649)中描述了合适的方 法。在Nelson和Long(Analytical Biochemistry(1989)，180，p 147-151)中描 述了将突变导入编码酶的核苷酸序列的另一种方法。
除了诸如上面所述的定点诱变之外，还可以例如利用商业试剂盒如来自 Stratagene的GeneMorph PCR诱变试剂盒，或来自Clontech的Diversify PCR随机诱变试剂盒随机导入突变。
获得新序列的第三种方法是对非同一性的核苷酸序列进行片段化，通过 利用任一种限制性酶或酶如DNA酶I，并重新组配编码功能性蛋白质的完 整核苷酸序列。或者可以使用一个或多个非同一性核苷酸序列并在完整核 苷酸序列的组配过程中导入突变。
因而，有可能在体内或体外在核苷酸序列中产生多个定点或随机突变， 随后通过各种方法筛选编码多肽的提高的功能性。
作为非限制性实例，可以将多核苷酸序列的突变或天然变体与野生型 或其它突变或天然变体重组以产生新的变体。也可以针对所编码多肽的提 高的功能性筛选这些新的变体。通过本领域公知的各种方法，例如错误阈 值诱变(Error Threshold Mutagenesis)(WO 92/18645)，寡核苷酸介导的随 机诱变(US 5,723,323)，DNA改组(US 5,605,793)，外介导的(exo-mediated) 基因组配(WO 0058517)，或RCR重组链反应(EP 1230390和US 6,821,758) 产生新的优选变体。例如在WO 0134835，WO 02/097130，WO 03/012100， WO03/057247，WO 2004/018674，US 6,303,344和US 6,132,970中描述了其 它合适的方法。
上述和类似的分子进化方法的应用可以鉴定和选择本发明的酶的变体 而无任何蛋白质结构或功能的现有知识，所述变体具有优选的特性，并且 可以生产不可预测但有益的突变或变体。本领域有许多应用分子进化以优 化或改变酶活性的实例，这些实例包括，但不限于下列的一种或多种：在 宿主细胞中或体外优化的表达和/或活性，增强的酶学活性，改变的底物和/ 或产物特异性，增强或降低的酶学或结构稳定性，在优选的环境条件，例 如，温度、pH、底物中改变的酶学活性/特异性。
氨基酸序列
本发明的范围还包括具有如本文所定义的特异性质的酶的氨基酸序列。
本文所用的术语″氨基酸序列″与术语″多肽″和/或术语″蛋白质″同义。在 一些情况下，术语″氨基酸序列″与术语″肽″同义。在一些情况下，术语″氨 基酸序列″与术语″酶″同义。
氨基酸序列可以由合适的来源制备/分离，或者它可以合成制备或者它 可以通过利用重组DNA技术来制备。
本发明所包括的酶可以结合其它酶使用。因而本发明还包括酶的组合， 其中所述组合包含本发明的酶和另一种酶，其可以是根据本发明的另一种 酶。在后面的部分中对这方面进行讨论。
当涉及或者当被本发明的自身范围所包括时，氨基酸序列优选不是天然 酶。在这一点上，术语″天然酶″意指在其天然环境下的完整酶，并且由其天 然核苷酸序列表达。
变体/同源物/衍生物
本发明还包括酶的任何氨基酸序列或编码这种酶的任何核苷酸序列的 变体、同源物和衍生物的用途。
在这里，术语“同源物”意指与氨基酸序列和核苷酸序列具有一定同源 性的实体。在这里，术语″同源性″可以等同于“同一性”。适当地，在本文 中″同源的″指在利用下面更加详细介绍的比对算法来比对其序列之后两种 酶之间的序列同一性。
在本文中，同源的氨基酸序列用来包括可以与序列至少75，80，81，85 或90％同一，优选地至少95，96，97，98或99％同一的氨基酸序列。一般， 同源物将例如与目标氨基酸序列包含相同的活性位点。尽管同源性也可以 用相似性(即具有类似化学特性/功能的氨基酸残基)来考虑，在本发明的 上下文中，优选用序列同一性表示同源性。
“功能片段”意指保留该多肽的特征性特性的多肽片段。在本发明的上下 文中，肌醇六磷酸酶的功能片段是保留完整蛋白质的肌醇六磷酸切割能力 的片段。
在本文中，同源的核苷酸序列用来包括可以与编码本发明的酶的核苷酸 序列(目标序列)至少75，80，81，85或90％同一性，优选地至少95，96，97， 98或99％同一的核苷酸序列。一般，同源物将包含与目标核苷酸序列编码 相同活性位点的序列。尽管同源性也可以用相似性(即具有类似化学特性/ 功能的氨基酸残基)来考虑，在本发明的上下文中，优选用序列同一性表 示同源性。
对于氨基酸序列和核苷酸序列来说，可以通过肉眼，或者更常借助于易 于得到的序列比较程序来进行同源性比较。这些商业上现有的计算机程序 可以计算两个或多个序列之间的％同源性。
可以在连续的序列上计算％同源性，即将一个序列与另一个序列进行比 对，并且一个序列中的每个氨基酸都直接与另一个序列中的相应氨基酸直 接比较，一次一个残基。这称作“无缺口”比对。一般，这种无缺口比对只在 相对短的残基数上进行。
尽管这是非常简单和一致的方法，但它没有考虑到，例如，在除此之外 相同的序列对中，一个插入或缺失将引起后面的氨基酸残基被排除在比对 之外，因而当进行整体比对时可能导致％同源性大大降低。因此，大多数序 列比较方法被设计来产生优化的比对，其考虑了可能的插入和缺失，而不 会对整体同源性分值不当罚分。这通过在序列比对中插入“缺口”以试图最大 化局部同源性来实现。
不过，这些更加复杂的方法对每个出现在比对中的缺口赋予“缺口罚 分”，从而对于相同数目的同一氨基酸，具有尽可能少的缺口的序列比对(其 反映了两条对比序列之间的较高相关性)将获得比具有很多缺口的序列更 高的得分。通常使用“远交缺口成本(affine gap costs)”，它对缺口的存在罚 相对高的分，并且对所述缺口中每一个后续的残基罚较少的分。这是最常 用的缺口评分系统。高的缺口罚分，理所当然地会产生具有较少缺口的最 优比对。大多数比对程序允许对缺口罚分进行修改。不过，在将所述软件 用于序列比较时，优选使用缺省值。例如当使用GCG Wisconsin Bestfit软件 包时，对于缺口的氨基酸序列的缺省缺口罚分为-12，而对于每一个延伸来 说为-4。
因此，最大％同源性的计算，首先需要产生最优比对，这种比对考虑到 了缺口罚分。用于进行这种比对的合适的计算机程序是GCG Wisconsin Bestfit软件包(Devereux等，1984，Nucleic Acids Research 12：387)。可以进 行序列比较的其他软件的例子包括，但不局限于BLAST软件包(参见 Ausubel等，1999，Short Protocols in Molecular Biology，第四版，第18章)， FASTA(Atschul等，1990，J.Mol.Biol.，403-410)和GENEWORKS比较工具 系列。BLAST和FASTA都可得到，用于脱机和联机检索(参见Ausubel等，
本发明也包含可以发生的保守性或同源性取代或突变(这里用到的取代 和替代都表示现有氨基酸残基与备选残基的交换)，即相似物取代相似物。 因而，术语“保守性突变”指本领域技术人员认为对于第一个突变是保守性的 氨基酸突变。在本文中“保守性的”意指对于氨基酸特性而言为保守性或不变 的。例如，如果突变在特定位置上导致脂肪族氨基酸残基(例如Leu)取代 芳香族残基(例如Tyr)，那么在相同位置上用不同的脂肪族氨基酸(例如 Ile或Val)取代称作保守性突变。其它氨基酸特性包括残基大小、疏水性、 极性、电荷、pK值，和本领域已知的其它氨基酸特性。因此，保守性突变 可以包括诸如碱性取代碱性，酸性取代酸性，极性取代极性等的取代。
也可以发生非保守性取代，即从一类残基取代为另一类，或涉及引入非 天然氨基酸如鸟氨酸(下文称作Z)，二氨基丁酸鸟氨酸(下文称作B)、正亮 氨酸鸟氨酸(下文称作O)、pyriylalanine、噻吩丙氨酸、萘基丙氨酸和苯基甘 氨酸。
也可用非天然氨基酸进行替代。
变体氨基酸序列可以包括可以插入序列的任意两个氨基酸残基之间的 适当间隔子基团，包括烷基，例如甲基、乙基或丙基，以及氨基酸间隔子， 如甘氨酸或β丙氨酸残基。本领域的技术人员将容易理解，变异的其它形 式，包括以类肽形式存在的一种或更多氨基酸残基。为了避免疑问，“类肽 形式”用来指变体氨基酸残基，其中α碳取代基是在残基的氮原子上，而不 是在α碳上。制备类肽形式的肽的方法是本领域中公知的，如Simon RJ等， PNAS(1992)89(20)，9367-9371和Horwell DC，Trends Biotechnol.(1995)13(4)，132-134。
命名法
在本发明中，使用氨基酸残基的常规的一字母和三字母密码子。为便于 参照，通过使用下列命名法来描述酶变体中的突变：亲本酶中的氨基酸残 基；位置；取代的一个或多个氨基酸残基。根据这种命名法，例如在位置20 上丙氨酸残基被甘氨酸残基取代表示为Ala20Gly或A20G。在相同位置上 丙氨酸的删除显示为Ala20*或A20*。插入额外的氨基酸残基(例如甘氨酸) 表示为Ala20AlaGly或A20AG。连续的氨基酸残基串的缺失(例如在位置20 的丙氨酸和位置21的甘氨酸之间)表示为Δ(Ala20-Gly21)或Δ(A20-G21)。当 亲本酶序列与用于编号的酶序列相比包含缺失时，该位置的插入(例如在 缺失的位置20上的丙氨酸)表示为*20Ala或*20A。通过加号或斜线分隔多 个突变。例如，在位置20和21上丙氨酸和谷氨酸分别被甘氨酸和丝氨酸 取代，表示为A20G+E21S或A20G/E21S。当氨基酸残基在给定的位置上被 两个或更多代替氨基酸残基取代时，这些残基通过逗号或斜线隔开。例如， 丙氨酸在位置30上被甘氨酸或谷氨酸取代表示为A20G，E或A20G/E，或 A20G，A20E。当本文鉴定出适于修饰的位置而没有建议任何具体的修饰时， 要理解为任何氨基酸残基都可以取代该位置上的氨基酸残基。因而，例如， 当提及但并未指定位置20上丙氨酸的修饰时，要理解丙氨酸可以被缺失， 或取代以任何其它氨基酸残基(即R，N，D，C，Q，E，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V 中的任何一种)。
用于本发明的核苷酸序列可以包括合成或修饰的核苷酸。寡核苷酸的许 多不同类型的修饰是本领域已知的。这些包括甲基磷酸酯和硫代磷酸酯主 链和/或在分子的3’和5’端添加吖啶或多聚赖氨酸链。为了本发明的目的， 要理解在此所描述的核苷酸序列可以通过本领域已有的任何方法进行修 饰。可以进行这种修饰以便提高体内活性或本发明的核苷酸序列的寿命。
本发明还包括与本文给出的序列互补的核苷酸序列，或其任何衍生物、 片段或其衍生物的用途。如果序列与其片段互补那么该序列可以用作探针 来在其它生物等中鉴定类似的编码序列。
可以以多种方式获得与本发明的序列不具有100％同源性但是落在本发 明范围内的多核苷酸。可以例如通过探测从许多个体，例如来自不同种群 的个体制备的DNA文库，来获得本文所述的序列的其它变体。此外，可以 获得其它的同源物并且这样的同源物及其片段通常能够选择性地与在本文 的序列表中显示的序列杂交。这样的序列可以通过探测制备自其它物种的 cDNA文库或来自其它物种的基因组DNA文库，并在中度至高严格条件下， 用包含在后附的序列表中的任何一个序列的全部或部分的探针探测这些文 库来获得。应用类似的考虑来获得本发明的多肽或核苷酸序列的物种同源 物和等位基因变体。
还可以使用简并PCR来获得变体和菌株/物种同源物，所述简并PCR 使用这样的引物，所述引物被设计以靶向变体和同源物中的序列，所述序 列编码本发明的序列中的保守氨基酸序列。保守序列可以例如通过比对来 自数种变体/同源物的氨基酸序列进行预期。序列比对可以使用本领域已知 的计算机软件来进行。例如，广泛使用GCG Wisconsin PileUp程序。
在简并PCR中使用的引物包含一个或多个简并位点并且将在这样的 严格条件下使用，所述严格条件低于用针对已知序列的单序列引物克隆序 列所使用的那些条件。
或者，这些多核苷酸可以通过被表征的序列的定点诱变来获得。这在 例如需要沉默密码子序列变化以优化特定宿主细胞的密码子偏好的情况中 可以是有用的，在所述特定宿主细胞中多核苷酸序列被表达。可能需要其 它的序列变化以引入限制性酶识别位点，或改变由所述多核苷酸编码的多 肽的性质或功能。
可以使用本发明的多核苷酸(核苷酸序列)来产生引物，例如PCR引物， 用于选择性扩增反应的引物，探针例如，通过常规方式，使用放射性或非 放射性标记标记以具有显示性的标记，或者可以将所述多核苷酸克隆入载 体中。这些引物、探针和其它片段的长度将至少为15，优选至少20，例如 至少25，30或40个核苷酸，并且也被本文所用的术语本发明的多核苷酸 所包括。
可以重组性地，合成性地，或通过本领域技术人员已知的任何方法来 生产根据本发明的多核苷酸如DNA多核苷酸和探针。它们还可以通过标准 技术进行克隆。
通常，将通过合成方法来生产引物，包括一次一个核苷酸来逐步生产 所需的核酸序列。利用自动技术实现此的技术可以轻易在现有技术中获得。
一般将利用重组方法来生产较长的多核苷酸，例如利用PCR(聚合酶 链式反应)克隆技术。可以将引物设计成包含合适的限制性酶识别位点从 而可以将扩增的DNA克隆入合适的克隆载体中。
生物学活性
优选地，所述变体序列等与本文所给出的序列至少同样具有生物学活 性。
本文所用的“生物学活性”指一种序列，其具有与天然发生的序列相似的 结构功能(但不必同等程度)，和/或相似的调控功能(但不必同等程度)， 和/或相似的生化功能(但不必同等程度)。
特别地，变体序列或其修饰形式具有与本文鉴定的肌醇六磷酸酶酶学谱 相似的酶学谱。这种谱包括诸如作为分泌蛋白的特征，具有pH2-5.5范围的 最佳pH，优选3.0-3.5，在pH2-5.5范围下保留至少50％的最大活性，和/ 或具有超过1000U/mg的比活。
杂交
本发明还包括与本发明的序列互补的序列或可以与本发明的序列或其 互补序列杂交的序列。
这里用到的术语“杂交”应包括“使核酸链通过碱基配对与互补链结合的 过程”，以及在聚合酶链式反应(PCR)技术中进行的扩增过程。
本发明还包含可以与这里所述序列，或其任意衍生物、片段或其衍生物 互补的序列杂交的核苷酸序列的用途。
术语“变体”还包括可以与这里所述核苷酸序列杂交的序列互补的序列。
优选地，术语“变体”包括可以在严格条件下(如50℃和0.2×SSC{1×SSC ＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠pH7.0})与这里所给出的核苷酸序列杂交的 序列互补的序列。
更优选地，术语“变体”包括可以在高度严格条件下(如65℃和 0.1×SSC{1×SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠pH7.0})与这里所述核 苷酸序列杂交的序列互补的序列。
本发明还涉及可以与本发明的核苷酸序列杂交的核苷酸序列(包括本文 给出序列的互补序列)。
本发明还涉及与可以与本发明的核苷酸序列杂交的核苷酸序列(包括本 文给出序列的互补序列)互补的核苷酸序列。
可以在中度到最大严格条件下与本文给出的核苷酸序列杂交的多核苷 酸序列也包括在本发明的范围中。
在一个优选方面，本发明包含可以在严格条件下(如50℃和0.2×SSC) 与本发明的核苷酸序列或其互补序列杂交的核苷酸序列。
在一个更优选的方面，本发明包含可以在高严格条件下(如65℃和 0.1×SSC)与本发明的核苷酸序列或其互补序列杂交的核苷酸序列。
定点诱变
一旦分离和/或纯化出编码酶的核苷酸序列，或鉴定出推定的编码酶的 核苷酸序列，可以预期使序列突变，从而制备本发明的酶。
可以用合成寡核苷酸引入突变。这些寡核苷酸含有所需突变位点的侧翼 核苷酸序列。
适合的方法公开于Morinaga等(Biotechnology(1984)2，p646-649)中。另 一种将突变引入编码酶的核苷酸序列中的方法描述于Nelson和 Long(Analytical Biochemistry(1989)，180，p147-151)。另一种方法描述于 Sarkar和Sommer(Biotechniques(1990)，8，p404-407-“The megaprimer method of site directed mutagenesis”)中。
重组的
在一方面，用于本发明的序列是重组序列—即已经利用重组DNA技术 制备的序列。
这些重组DNA技术是本领域普通技术人员能力范围内的技术。这些技 术在文献，例如，J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatis，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Books 1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press中进行了解释。
合成的
在一方面，用于本发明的序列是合成的序列—即已经通过体外化学或酶 学合成制备的序列。它包括，但不限于，用宿主生物偏好的密码子用法制 备的序列—所述宿主生物如甲基营养型酵母毕赤酵母属和汉森酵母属。
酶的表达
用于本发明的核苷酸序列可以被并入重组可复制载体。该载体可以用于 在相容性宿主中和/或由相容性宿主以酶的形式表达该核苷酸序列。
可以用控制序列例如调控序列控制表达。
通过核苷酸序列表达而由宿主重组细胞产生的酶可以被分泌或包含在 细胞内，这取决于使用的序列和/或载体。可以将编码序列设计为具有信号 序列，该信号序列增强编码序列通过特定原核或真核细胞膜的直接分泌。
有利地，本发明的酶是分泌的。
表达载体
术语“质粒”、“载体系统”或“表达载体”意指能够体内或体外表达的构建 体。在本发明的上下文中，这些构建体可以用来将编码酶的基因导入宿主 细胞中。适当地，导入其表达的基因可以称作“可表达的转基因”。
优选地，将表达载体掺入合适的宿主生物体的基因组。术语“掺入”优选 包括稳定掺入基因组。
本文所述的核苷酸序列，包括本发明的核苷酸序列，可以存在于载体中， 其中核苷酸序列被可操作性连接到调控序列上，所述调控序列能够通过适 当宿主生物体提供核苷酸序列的表达。
用于本发明的载体可以被转化到下面所述的适当宿主细胞中，从而提供 本发明多肽的表达。
载体例如质粒、粘粒或噬菌体的选择通常将取决于其将要导入的宿主细 胞。
用于本发明的载体可以包含一种或多个可选择的标记基因—如赋予抗 生素抗性例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性的基因。或者， 可以通过共转化来实现选择(如WO91/17243中所述)。
可以体外使用载体，例如来生产RNA或用来转染、转化、转导或感染 宿主细胞。
因而，在另一个实施方案中，本发明提供一种制备本发明的核苷酸序列 的方法，该方法是通过将本发明的核苷酸序列导入可复制的载体，将该载 体导入相容的宿主细胞中，和在能够带来载体复制的条件下生长所述宿主 细胞而进行的。
所述载体可以进一步包含能够使载体在所研究的宿主细胞中复制的核 苷酸序列。这些序列的实例为质粒pUC19，pACYC177，pUB110，pE194， pAMB1，pU702和pET11的复制起点。
调控序列
在一些应用中，用于本发明的核苷酸序列可操作性地连接到调控序列 上，所述调控序列能够提供核苷酸序列的表达，如通过选定的宿主细胞的 表达。例如，本发明包括这样一种载体，其包含可操作性地连接到这种调 控序列上的本发明的核苷酸序列，即所述载体是表达载体。
术语“可操作性地连接”指一种毗连，其中所述组分的关系使得它们以其 所希望的方式发挥作用。以特定的方式连接“可操作性地连接”到编码序列上 的调控序列，从而在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。
术语“调控序列”包括启动子和增强子和其它表达调控信号。
以本领域正常意义使用术语“启动子”，例如RNA聚合酶结合位点。
还可以通过选择异源调控区例如启动子、分泌前导区和终止子区域来 增加编码本发明的酶的核苷酸序列的表达。
优选地，根据本发明的核苷酸序列可操纵地与至少一个启动子连接。
指导细菌、真菌或酵母宿主中的核苷酸序列的转录的合适的启动子的 实例是本领域众所周知的。
构建体
术语“构建体”—其与术语如“缀合物”、“盒”和“杂交体”同义—包括按照 本发明使用直接或简介连接于启动子的核苷酸序列。
间接连接的实例是在启动子和本发明的核苷酸序列之间提供适合的间 隔子基团，如内含子序列，如Sh1-内含子或ADH内含子。涉及本发明的 术语“融合的”也是如此，其包括直接或间接连接。在一些情况中，该术语不 包括核苷酸序列的天然组合，所述核苷酸序列编码与野生型基因启动子相 关联的蛋白质，并且当它们均处在天然环境中时。
所述构建体可以甚至包含或表达容许选择遗传构建体的标记。
对于一些应用而言，优选地，本发明的构建体至少包含与启动子可操 纵连接的本发明的核苷酸序列。
宿主细胞
涉及本发明的术语″宿主细胞″包括任何细胞，所述细胞包含如上所述 的核苷酸序列或表达载体，并且用于重组生产具有如本文定义的具体的性 质的酶，或用于本发明的方法。
因此，本发明的另一个实施方案提供用表达本发明所述的酶的核苷酸 序列转化或转染的宿主细胞。选择细胞来与所述载体相容并且所述细胞可 以例如是原核生物(例如细菌)、真菌、酵母或植物细胞。优选地，所述宿主 细胞不是人细胞。
合适的细菌宿主生物的实例是革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌物种。
根据编码本发明的酶的核苷酸序列的性质和/或对于进一步加工表达的 蛋白质的需要，通常可以优选真核宿主如酵母或其它真菌。通常，酵母细 胞优于真菌细胞，因为它们易于操纵。然而，一些蛋白质不易从酵母细胞 中分泌或在一些情况中不能正确加工(例如，在酵母中过度糖基化)。在这些 情况中，应该选择不同的真菌宿主生物。
使用合适的宿主细胞—如酵母，真菌和植物宿主细胞—可以提供翻译 后修饰(例如，十四烷酰化，糖基化，平截，lapidation和酪氨酸、丝氨酸或 苏氨酸磷酸化)，因为可能被需要给本发明的重组表达产物赋予优化的生物 活性。
宿主细胞可以是蛋白酶缺陷或蛋白酶负型菌株。
可以修饰宿主细胞的基因型来提高表达。
宿主细胞修饰的实例包括蛋白酶缺陷，稀有tRNA′s的补充，和改变在 细胞质中的还原电势以增加二硫键形成。
例如，宿主细胞大肠杆菌可以过量表达稀有的tRNA′s以提高异源蛋白 质的表达，如在Kane(Curr Opin Biotechnol(1995)，6，494-500″Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologus proteins in E.coli″中例 示/描述。所述宿主细胞可以缺乏许多还原酶，因此有利于形成稳定的二硫 键，如在Bessette(Proc Natl Acad Sci USA(1999)，96，13703-13708″Efficient folding of proteins with multiple disulphide bonds in the Escherichia coli cytoplasm″)中例示/描述。
在一个实施方案中，本发明上下文中的宿主细胞包括可以直接添加 到动物饲料中的那些细胞。
生物体
涉及本发明的术语″生物体″包括这样的任何生物，所述生物可以包括编 码如在本发明中所述的酶的核苷酸序列和/或获自其中产物，和/或其中当启 动子存在于所述生物中时，可以容许根据本发明的核苷酸序列的表达。
合适的生物体可以包括原核生物、真菌、酵母或植物。
涉及本发明的术语″转基因生物″可以包括这样的任何生物，所述生物包 括编码如在本发明中所述的酶的核苷酸序列和/或获自其中的产物，和/或其 中启动子可以容许根据本发明的核苷酸序列在所述生物中的表达的任何生 物。优选地，将所述核苷酸序列掺入所述生物的基因组中。
术语″转基因生物″不包括当它们在其天然启动子控制下时，在它们天 然环境中的天然核苷酸编码序列，所述天然启动子也在其天然环境中。
因此，本发明的转基因生物包括这样的生物，所述生物包含编码如本 发明所述的酶的核苷酸序列，根据本发明的构建体，根据本发明的载体， 根据本发明的质粒，根据本发明的细胞，根据本发明的组织，或其产物的 中任何一种，或其组合。
例如，所述转基因生物还可以包括在异源启动子控制下编码本发明的 酶的核苷酸序列。
宿主细胞/生物体的转化
如前面指出，宿主生物可以是原核生物体或真核生物体。合适的原核 生物宿主的实例包括大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。
关于原核宿主的转化的教导在本领域的文献中有充分记载，例如见 Sambrook等(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press)。其它合适的方法在本文实施例中提出。如 果使用原核宿主，那么核苷酸序列可能需要在转化前进行适当地修饰—— 如通过去除内含子进行修饰。
丝状真菌细胞可以使用本领域已知的各种方法进行转化——诸如包括 形成原生质体和转化原生质体，随后以已知方式再生细胞壁的方法。在 EP 0 238 023中描述了将曲霉属(Aspergillus)用作宿主微生物。
另一种宿主生物体可以是植物。用于转化植物的一般技术的综述可以 见于Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol[1991]42：205-225)和 Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)的文章。关于 植物转化的另外的教导可以见于EP-A-0449375。
关于真菌、酵母和植物的转化的一般教导见于下面的部分。
转化的真菌
宿主生物可以是真菌——如丝状真菌。合适的这样的宿主的实例包括 属于高湿霉属(Thermomyces)，支顶孢属(Acremonium)，曲霉属，青霉属 (Penicillium)，毛霉属(Mucor)，脉孢菌(Neurospora)，木霉属(Trichoderma) 等属的任何成员。
关于转化丝状真菌的教导综述于US-A-5741665，其陈述了转化丝状真 菌的的标准技术，培养所述真菌是本领域众所周知的。用于粗糙链孢霉 (N.crassa)的技术的广泛综述见于例如Davis和de Serres，Methods Enzymol (1971)17A：79-143。
关于转化丝状真菌的另外的教导综述于US-A-5674707。
在一方面，宿主生物可以是曲霉菌属生物，如黑曲霉(Aspergillus niger)。
还可以按照，例如Turner G.1994(Vectors for genetic manipulation.In： Martinelli S.D.，Kinghorn J.R.(Editors)Aspergillus：50 years on.Progress in industrial microbiology vol 29.Elsevier Amsterdam 1994.pp.641-666)的教导 制备根据本发明的转基因曲霉属。
基因在丝状真菌中的表达已经综述于Punt等.(2002)Trends Biotechnol 2002May；20(5)：200-6，Archer & Peberdy Crit Rev Biotechnol (1997)17(4)：273-306中。
转化的酵母
在另一个实施方案中，转基因生物体可以是酵母。
在例如Methods Mol Biol(1995)，49：341-54，和Curr Opin Biotechnol(1997) Oct；8(5)：554-60中提供关于异源基因在酵母中表达的原理的综述。
在该方面，可以将酵母——诸如物种啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisi) 或巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)(见FEMS Microbiol Rev(2000 24(1)：45-66)用作异源基因表达的载体。
在E Hinchcliffe E Kenny(1993，″Yeasts as a vehicle for the expression of heterologous genes″，Yeasts，Vol 5，Anthony H Rose and J Stuart Harrison，eds， 第二版，Academic Press Ltd.)中提供在啤酒糖酵母中异源基因表达和基因产 物的分泌的原理的综述。
对于酵母的转化，已经开发了一些转化方法。例如，可以按照Hinnen等， (1978，Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75，1929)； Beggs，J D(1978，Nature，London，275，104)；和Ito，H等(1983，J Bacteriology 153，163-168)的教导制备根据本发明的转基因的酵母。
可以使用各种选择标记——如营养缺陷型标记、显性抗生素抗性标记 来选择转化的酵母细胞。
转化的植物/植物细胞
适合于本发明的宿主生物可以是植物。一般技术的综述可以见于 Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol[1991]42：205-225)和Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)的文章。
培养和生产
用本发明的核苷酸序列转化的宿主细胞可以在有益于编码的酶的产生 并有利于酶从所述细胞和/或培养基中回收的条件下培养。
用于培养所述细胞的培养基可以是适合于培养目的宿主细胞并获得所 述酶的表达的任何常用培养基。
可以在细胞的表面上呈现由重组细胞产生的蛋白质。
酶可以从宿主细胞中分泌并可以方便地使用众所周知的方法从培养基 中回收。
分泌
可以希望使酶从表达宿主中分泌到其中酶可能更易于回收的培养基 中。根据本发明，分泌前导序列可以基于期望的表达宿主进行选择。杂交 体信号序列也可以用于本发明的背景中。
异源分泌前导序列的典型实例是从真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因(glaA -例如来自曲霉菌的18和24个氨基酸的形式)，α-因子基因(酵母，例如， 酵母属(Saccharomyces)，克鲁维酵母属(Kluyveromyces)和汉森氏酵母 属(Hansenula))或α-淀粉酶基因(芽孢杆菌属)起源的那些。
作为实例，在大肠杆菌中的异源蛋白质的分泌在Methods Enzymol (1990)182：132-43中进行综述。
检测
用于检测和测量氨基酸序列的表达的各种方法是本领域众所周知的。 实例包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)，放射免疫测定法(RIA)和荧光激活的 细胞分选术(FACS)。
广泛种类的标记和缀合技术是本领域那些技术人员已知的并且可以用 在多种核酸和氨基酸测试中。
许多公司如Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ)，Promega(Madison，WI)， 和US Biochemical Corp(Cleveland，OH)提供用于这些步骤的商业试剂盒和 方法。
适合的报告分子或标记包括那些放射性核素，酶，荧光，化学发光， 或显色剂以及底物，辅因子，抑制剂，磁性颗粒等。教导这些标记的应用 的专利包括US-A-3,817,837；US-A-3,850,752；US-A-3,939,350； US-A-3,996,345；US-A-4,277,437；US-A-4,275,149和US-A-4,366,241。
此外，可以如在US-A-4,816,567中所显示产生重组免疫球蛋白。
检测肌醇六磷酸酶活性的其它合适的测试法是本领域已知的并且在本 文进行例示。
融合蛋白
可以将根据本发明使用的氨基酸序列作为融合蛋白进行制备，从而例 如有助于提取和纯化。融合蛋白配偶体的实例包括谷胱甘肽-S-转移酶 (GST)，6xHis，GAL4(DNA结合和/或转录激活结构域)和β-半乳糖苷酶。 在融合蛋白配偶体和目标蛋白序列之间包括蛋白水解剪切位点从而容许去 除融合蛋白序列也可以是有利的。
优选地，融合蛋白不会干扰蛋白质序列的活性。
已经在Curr Opin Biotechnol(1995)6(5)：501-6中综述了在大肠杆菌中 的基因融合表达系统。
在本发明的另一个实施方案中，氨基酸序列可以连接于异源序列以编 码融合蛋白。例如，为了筛选能够影响物质活性的试剂的肽库，编码表达 由商购抗体识别的异源表位的嵌合物质可以是有用的。
其它序列
还可以结合一个或多个另外的目标蛋白质(POI)或目标核苷酸序列 (NOI)来使用根据本发明应用的序列。
POI的非限制性实例包括：木聚糖酶，脂肪酶，酸性磷酸酶和/或其它。 这些包括例如调节饲料粘性的酶。所述NOI甚至可以是任何那些序列的反 义序列。
POI甚至可以是融合蛋白，从而例如有助于提取和纯化或有利于增加体 内肌醇六磷酸代谢。
POI甚至可以与分泌序列融合。
其它的序列也可以有利于分泌或增加分泌的POI的产率。这些序列可 以编码伴侣蛋白，如例如在英国专利申请9821198.0中所述的黑曲霉cyp B 基因的产物。
可以出于许多原因对编码POI的NOI进行改造从而改变它们的活性， 包括但不限于，改进其表达产物的加工和/或表达的改变。作为另一个实例， 还可以修饰NOI以优化在特定宿主细胞中的表达。可能需要其它的序列改 变从而引入限制性酶识别位点。
编码POI的NOI在其中可以包括合成或修饰的核苷酸——诸如甲基膦 酸酯和硫代磷酸酯主链。
可以修饰编码POI的NOI从而增加细胞内的稳定性和半衰期。可能的 修饰包括，但不限于，加入分子的5′和/或3′末端的旁侧序列或在所述分子 的主链中使用硫代磷酸酯或2′O-甲基而不是磷酸二酯键。
抗体
本发明的一个方面涉及与SEQ ID No.3的氨基酸具有免疫反应性的氨 基酸。
可以通过标准技术，诸如用本发明的物质进行免疫或通过使用噬菌体 展示文库产生抗体。
出于本发明的目的，除非相反地指出，术语“抗体”包括，但不限于，多 克隆，单克隆，嵌合的，单链，Fab片段，通过Fab表达文库产生的片段 及其模拟物。这些片段包括完整抗体的片段，其保留它们对于目标物质， Fv，F(ab′)和F(ab′)2片段，以及单链抗体(scFv)，融合蛋白和包括抗体的抗原 结合位点的其它合成蛋白质的结合活性。此外，抗体及其片段可以是人源 化抗体。中和抗体，即，抑制物质多肽的生物活性的那些，对于诊断和治 疗是尤其优选的。
如果需要多克隆抗体，用本发明的序列(或包含其免疫表位的序列) 免疫选定的哺乳动物(例如，小鼠，兔，山羊，马等)。根据宿主的物种，可 以使用各种佐剂来增加免疫应答。
收集来自被免疫的动物的血清，并根据已知的方法对其进行处理。如 果包含针对本发明的序列(或包含其免疫表位的序列)的多克隆抗体的血清 包含针对其它抗原的抗体，可以通过免疫亲和层析来纯化多克隆抗体。用 于产生和加工多克隆抗血清的技术是本领域已知的。为了可以制备这些抗 体，本发明还提供本发明的多肽或其片段，其半抗原化(haptenise)成另一 种多肽来在动物或人中用作免疫原。
针对本发明的序列(或包含其免疫表位的序列)的单克隆抗体还可以由 本领域技术人员容易地制备，并且包括，但不限于，杂交瘤技术Koehler和 Milstein(1975Nature 256：495-497)，人B-细胞杂交瘤技术(Kosbor等，(1983) Immunol Today 4：72；Cote等，(1983)Proc Natl Acad Sci 80：2026-2030)和 EBV-杂交瘤技术(Cole等，(1985)Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy， Alan Rickman Liss Inc，pp 77-96)。
此外，可以使用为产生“嵌合抗体”所开发的技术，剪接小鼠抗体基因 与人抗体基因从而获得具有适合的抗原特异性和生物活性的分子 (Morrison等(1984)Proc Natl Acad Sci 81：6851-6855；Neuberger等，(1984) Nature 312：604-608；Takeda等，(1985)Nature 314：452-454)。
或者，可以将对于生产单链抗体所述的技术(美国专利号4,946,779)进行 改进以产生物质特异性单链抗体。
还可以产生包含对于所述物质的特异性结合位点的抗体片段。例如， 这样的片段包括，但不限于，可以通过用胃蛋白酶消化抗体分子产生的 F(ab′)2片段和可以通过还原F(ab′)2片段的二硫键产生的Fab片段。或者， 可以构建Fab表达文库以容许快速和容易地鉴定具有需要的特异性的单克 隆Fab片段。(Huse WD等，(1989)Science 256：1275-1281)。
大规模应用
在本发明的一个优选实施方案中，将编码弗氏柠檬酸杆菌衍生的肌醇 六磷酸酶的氨基酸序列或本发明的方法用于大规模的应用。具体而言，本 发明的方法可以用于大规模生产肌醇六磷酸酶以作为食品或饲料组合物的 添加剂/补充物进行工业应用。
优选地，在培养宿主生物后，所述氨基酸序列以每升总细胞培养物体 积的5g到每升约10g的量产生。
优选地，在培养宿主生物体后，所述氨基酸序列以每升总细胞培养物 体积的100mg到约每升900mg的量产生。
优选地，在培养宿主生物后，所述氨基酸序列以每升总细胞培养物体 积的250mg到约每升500mg的量产生。
肌醇六磷酸酶的应用
如上文指出，本发明还涉及如本文所述的肌醇六磷酸酶的生产。
具体而言，本发明还涉及将在本文公开的氨基酸序列用于制备有机和 无机的磷酸酯化合物。
因此，本发明还涉及将编码肌醇六磷酸酶的核苷酸序列用于产生表达 所述肌醇六磷酸酶的表达载体或系统。
此外，本发明涉及将这些表达载体或系统用于产生表达肌醇六磷酸酶 的宿主细胞。
本发明还涉及将修饰的宿主细胞用于产生有机和无机磷酸酯化合物的 前体或用于产生特定的有机磷酸酯化合物。
合适的有机和无机磷酸酯化合物包括肌肌醇五-，四-，三-，二-和单磷 酸酯。
因此适当地，本发明提供产生有机磷酸酯化合物的方法，所述方法包 括用衍生自弗氏柠檬酸杆菌的肌醇六磷酸酶处理肌醇六磷酸。优选地，所 述方法的特征在于所述酶包含如SEQ ID NOs：3所显示的氨基酸序列，或与 其具有至少75％同一性(同源性)的序列或有效片段，或其修饰形式。适当 地，有机磷酸酯是肌醇六磷酸或肌肌醇二-，三-，四-，和五磷酸酯的所有 可能的立体异构体。其它合适的有机磷酸酯包括肌醇-四磷酸酯和肌醇-寡磷 酸酯。在优选的实施方案中，所述方法是体内生物技术方法。
用于生产有机磷酸酯化合物的这些方法可以适当地包括下列步骤：
a)提供包含可表达的转基因的宿主细胞，所述转基因包含弗氏柠檬酸 杆菌肌醇六磷酸酶；
b)在适合于表达所述转基因的条件下培养所述转基因生物；和
c)从所述培养物中回收有机磷酸酯化合物。
可以将所述化合物用于许多应用，包括用于测试肌醇六磷酸酶的特征。 一些肌醇磷酸酯涉及作为在细胞内调节的信号分子，并可以将其用作研究 用化学药品。
在另一方面，提供生产食品或动物饲料的方法。动物饲料典型地在饲 料粉碎机中生产，其中首先将原材料研磨成适合的颗粒大小，接着将其混 合以适合的添加剂。接着，可以以醪液或粒状沉淀形式生产饲料；后者典 型地包括将温度升高到目标温度，接着将所述饲料通过模具以产生特定大 小的粒状沉淀的方法。随后，可以加入液体添加剂如脂肪和酶。在运输之 前，使所述粒状沉淀冷却。动物饲料的生产还可以包括另外的步骤，所述 另外的步骤包括在粒化之前进行挤压或膨胀。
因此，本发明还提供编码肌醇六磷酸酶的氨基酸序列或表达肌醇六磷 酸酶的宿主细胞的用途，用于产生肌醇六磷酸酶以制备食品或饲料产品。 在一方面，提供了将如本文所述的氨基酸序列用于制备食品或饲料产品的 用途。在另一方面，提供了将根据本发明的宿主细胞用于制备食品或饲料 产品的用途。在另一方面，提供将根据本发明的表达载体或系统用于制备 食品或饲料产品的用途。
本发明还包括使用酶作为饲料的组分与其它组分组合递送给动物。
与其它组分的组合
本发明的酶可以与其它组分或载体组合使用。
用于饲料的酶的合适的载体包括小麦(粗研的)。此外，存在许多封装技 术，包括基于脂肪/蜡覆盖的那些技术、加入植物树胶等。
其它组分的实例包括下列各项的一个或多个：增稠剂，胶凝剂，乳化 剂，粘合剂，晶体改性剂，甜味剂(包括人工甜味剂)，流变学改性剂，稳定 剂，抗氧化剂，染料，酶，载体，媒介物，赋形剂，稀释剂，润滑剂，增 香剂，着色物质，悬浮剂，崩解剂，颗粒粘合剂等。这些其它的组分可以 是天然的。这些其它的组分可以通过使用化学和/或酶学技术进行制备。
用于本文的术语“增稠剂或胶凝剂”用于本文时，指通过延缓或阻止颗 粒移动来防止分离的产品，所述颗粒为不可混溶的液体、空气、或不可溶 的固体的小滴。
将用于本文的术语“稳定剂″定义为防止产品(例如食品)随时间变化的 成分或成分的组合。
用于本文的术语“乳化剂”指防止乳状液分离的成分(例如食品成分)。
用于本文的术语“粘合剂″指通过物理或化学反应将产品粘合在一起的 成分(例如，食品成分)。
用于本文的术语“晶体改性剂”指影响脂肪或水的结晶作用的成分(例如 食品成分)。
“载体”或“媒介物”指适合于化合物施用的材料并且包括本领域已知的 任何这样的材料，诸如例如任何液体，凝胶，溶剂，液体稀释剂，增溶剂 等，其是无毒的并且不会以有害的方式与所述组合物的任何组分相互作用。
在营养上可接受的载体的实例包括，例如，谷物，水，盐溶液，醇， 聚硅氧烷，蜡，矿脂，植物油等。
赋形剂的实例包括下列各项的一个或多个：微晶纤维素和其它的纤维 素，乳糖，柠檬酸钠，碳酸钙，磷酸氢钙，甘氨酸，淀粉，乳糖和高分子 量的聚乙二醇。
崩解剂的实例包括下列各项的一个或多个：淀粉(优选地是谷物、马铃 薯或木薯淀粉)，羟基乙酸淀粉钠，交联羧甲纤维素钠和某些复杂的硅酸盐。
颗粒的粘合剂的实例包括下列各项的一个或多个：聚乙烯吡咯烷酮， 羟丙基甲基纤维素(HPMC)，羟丙基纤维素(HPC)，蔗糖，麦芽糖，明胶和 阿拉伯胶。
润滑剂的实例包括下列各项的一个或多个：硬脂酸镁，硬脂酸，甘油 二十二烷酸酯和滑石。
稀释剂的实例包括下列各项的一个或多个：水，乙醇，丙二醇和甘油，及 其组合。
所述其它的组分可以同时(例如，当它们一起在混合物中时，或甚至当 它们以不同的路径递送时)或顺序地(例如它们可以通过不同的路径递送)使 用。
用于本文的术语“适合于动物或人食用的组分”意指作为添加物被添加 或可以添加到本发明的组合物中的化合物，其可以是具有营养益处的、是 纤维取代物或通常对于消费者具有有益作用。
作为实例，组分可以是益生元如藻酸盐，黄原胶，果胶，槐豆胶(LBG)， 旋复花粉，瓜尔胶，半乳糖寡糖(GOS)，果糖寡糖(FOS)，乳蔗糖，大豆寡 糖，palatinose，异麦芽寡糖，葡糖寡糖和木糖寡糖。
食品或饲料物质
可以将所述化合物用作食品或饲料物质，或用在食品或饲料物质的制 备中。在此处，术语“食品”以广泛意义使用，并且包括用于人的食物和食品 以及用于动物的食物(即饲料)。关于在牲畜饲养中供应给动物的产品，使用 术语″饲料″。在优选的方面，食品或饲料由单胃动物如猪，家禽和鱼食用。
根据使用和/或应用的模式和/或施用的模式，食品或饲料可以以溶液的 形式或作为固体形式存在。
食品和饲料成分和添加物
可以将化合物用作食品或饲料成分。
用于本文的术语“食品或饲料成分”包括被添加或可以被添加到食品或 食料中的制剂，并且包括可以以低水平使用在多种产品中的制剂。
根据使用和/或应用的模式和/或施用的模式，食品成分可以以溶液的形 式或作为固体形式存在。
所述化合物可以食食品添加物或可以被添加到食品添加物中。
食品和饲料组合物
用于单胃动物的饲料组合物典型地包括包含植物产物的组合物，所述 植物产物包含肌醇六磷酸。这些组合物包括基于玉米粉，大豆粉，油菜籽 粉，棉籽粉，玉米，小麦，燕麦和高梁的饲料。
本文所述的肌醇六磷酸酶可以是食品或饲料组合物，或可以被添加到 食品或饲料组合物中。
本发明还提供制备食品或饲料成分或添加物的方法，所述方法包括将 由本发明的方法生产的肌醇六磷酸酶或按照本发明的组合物与另一种食品 成分混合。制备方法或食品成分也是本发明的另一个方面。在上面提出了 制备动物饲料的方法。所述酶还可以以固体制剂的形式或作为饲料添加剂 如预混合液进行添加。固体形式典型地在混合步骤之前或其过程中进行添 加，液体形式典型地在沉淀步骤后添加。
药物
还可以将本发明的肌醇六磷酸酶用在药物制剂中或用于组合到食料中 从而提供某些药物作用。例如，EP 1,389,915描述了将肌醇六磷酸酶用在食 品或饮料中以增加用于人的食品或饮料中的钙，铁和/或锌的有效性。
此外，EP 1,392,353描述了包含肌醇六磷酸酶的药物或营养添加物，其 对于增加生命元素，例如钙和铁的生物利用率和对抗缺陷型疾病是有用的。
在此处，术语“药物”以广泛意义应用，并且包括用于人的药物和/或营 养药以及用于动物的药物和/或营养药(即，兽医应用)。在优选的方面，所 述药物用于人应用和/或用于动物饲养。
所述药物可以用于治疗目的，其可以在性质上是治疗性的、缓和性的 或预防性的。所述药物甚至可以用于诊断目的。
当用作药物，或用在药物的制备中时，本发明的产物和/或化合物可以 与下列各项的一个或多个结合使用：药用载体，药用稀释剂，药用赋形剂， 药用佐剂，药用活性成分。
根据使用和/或应用模式和/或施用模式，药物可以以溶液的形式或作为 固体形式存在。
药物成分
可以将本发明的产物和/或化合物用作药物成分。在此处，本发明的产 品和/或组合物可以是单一的活性成分或其可以是许多(即，2个或更多)活性 成分中的至少一种。
根据使用和/或应用的模式和/或施用的模式，药物成分可以以溶液的形 式或作为固体形式存在。
药物成分可以以泡腾产品的形式存在以提高药物的溶解性质。
形式
本发明的产品和/或化合物可以以任何合适的形式使用——不管是当单 独存在时还是以组合物形式存在时。同样地，按照本发明产生的肌醇六磷 酸酶(即，成分，诸如食品成分，功能性食品成分或药物成分)可以以任何合 适的形式使用。
形式的合适的实例包括下列各项的一个或多个：片剂，丸剂，胶囊， ovules，溶液，或混悬液，它们可以包含增香剂或着色剂，用于即刻的，延 缓的，改进的，持续的，脉冲式的或受控的释放应用。
作为实例，如果所述产品和/或组合物以片剂形式使用——如用作功能 性成分——所述片剂还可以包含下列各项的一个或多个：赋形剂，崩解剂， 颗粒粘合剂，或润滑剂。
用在制备所述形式中的在营养上可接受的载体的实例包括，例如，水， 盐溶液，醇，聚硅氧烷，蜡，矿脂等。
用于所述形式的优选的赋形剂包括乳糖，淀粉，纤维素，乳糖，或高 分子量的聚乙二醇。
对于水性混悬液和/或酏剂，可以将肌醇六磷酸酶裂解化合物组合以各 种甜味剂或增香剂，着色物质或染料，组合以乳化剂和/或悬浮剂和组合以 稀释剂如水，乙醇，丙二醇和甘油及其组合。
所述形式还可以包括明胶胶囊；纤维胶囊，纤维片剂等。
一般重组DNA方法技术
除非另外指出，本发明使用常规的化学技术，分子生物学技术，微生 物学技术，重组DNA技术和免疫学技术，它们都在本领域普通技术人员的 能力范围内。这些技术都在文献中有所阐述。见，例如J.Sambrook，E.F. Fritsch，和T.Maniatis，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二 版，Books 1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel，F.M.等.(1995 and periodic supplements；Current Protocols in Molecular Biology，ch.9，13，和 16，John Wiley & Sons，New York，N.Y.)；B.Roe，J.Crabtree，和A.Kahn，1996， DNA Isolation and Sequencing：Essential Techniques，John Wiley & Sons；M.J. Gait(Editor)，1984，Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach，Irl Press； 和，D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg，1992，Methods of Enzymology：DNA Structure Part A：Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology， Academic Press.将这些一般性文章的每个并入本文作为参考。
实施例
现在在下面的非限制性实例中进一步举例说明本发明。
实施例1.肌醇六磷酸酶活性测试。
肌醇六磷酸酶测试在微量滴定板中进行。反应混合物(100μl)包含：在 200mM醋酸钠缓冲液，pH 3.5中的2mM肌醇六磷酸和0.8mM CaCl2。 使反应在37℃进行1小时，随后通过改进的已知方法(Heinonen J.K.，Lahti RJ.Anal Biochem.113(2)，313-317(1981))来测量释放的磷酸盐。简言之，在 每个微量滴定板孔中将200μl的新鲜制备的AMM溶液(7.5N H2SO4，15 mM钼酸铵和丙酮-1∶1∶2)加入100μl的反应混合物中。加入AMM试剂后， 在不早于10分钟和不晚于30分钟的时间内，测量在390nm的吸光度。通 过用已知浓度的磷酸盐溶液构建校准曲线来测定磷酸盐的量。为了测试不 同pH值下的肌醇六磷酸酶活性，使用下列的(全部为200mM)缓冲液：介 于pH 2.0和3.0之间的甘氨酸/HCl，介于pH 3.5和5.5之间的乙酸钠/乙 酸，介于pH 6.0和7.5之间的Tris/马来酸。
实施例2.产生肌醇六磷酸酶的菌株P3-42
细菌菌株P3-42最初从一堆腐烂的桦树叶中分离，这堆桦树叶在芬兰南 部的潮湿森林中收集。可以在许多简单培养基上在30℃需氧培养所述菌株， 所述培养基例如LB(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，pH 7.4)或低磷 酸盐培养基PP1(1％蛋白胨，1％牛肉提取物，0.5％酵母提取物，CaCl2- 0.2M)。用NaOH将培养基调节到pH 11并煮沸10分钟。通过过滤去除沉 淀物，并将pH再次调整到5.5，通过在121℃高压灭菌15分钟来对所述培 养基进行灭菌。
在液体PP1培养基中生长后，发现所述菌株在pH 3.5和5.5都显示肌 醇六磷酸酶活性(如在实施例1中所述测试)。在3.5和5.5的活性的比率是 约1.5。还在P3-42的细胞和培养物上清液中分别测量活性。根据这些测量， 在上清液中发现全部肌醇六磷酸酶活性的90％。将所述菌株在2004年9月 22日保藏于NCIMB，登记号为NCIMB 41247。
实施例3.从菌株P3-42中分离染色体DNA
基本上用标准方法(Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology， John Wiley & Sons，New York，1996)来制备染色体DNA。将在30℃在LB培 养基中过夜培养的250ml培养物在10,000rpm离心30分钟，用20ml的50 mM tris-HCl，5mM EDTA pH 8中洗涤，并重悬于10ml的冷TES(50mM tris-HCl，5mM EDTA，15％葡萄糖pH 8)中。加入溶菌酶至10mg/ml，并在 37℃温育细胞混悬液30-60分钟直到裂解发生，所述裂解通过将100μl的 反应混合物稀释到1ml的1％SDS中并检查“粘液(slimy)”稠度进行确定。 在此时，分别将SDS和蛋白酶K(Sigma)加入到终浓度1％和0.5mg/ml。将 反应混合物在56℃温育30分钟，随后加入2ml的5M NaCl和1.4ml的10％ 十六烷基三甲基溴化铵(Sigma)。在65℃持续温育15分钟。用氯仿/异戊醇 (24∶1)提取溶液1次，并用苯酚/氯仿提取一次。提取后，将水相与0.6体积 的异丙醇混合，通过离心(10,000rpm，15min)收集DNA沉淀，用70％乙醇 洗涤，真空干燥并重悬在2ml的10mM tris-HCl，1mM EDTA pH 8，5μg/ml RNA酶中。
实施例4.细菌菌株P3-42的分类学鉴定
使用引物536f(CAGCMGCCGCGGTAATWC)和1392r (ACGGGCGGTGTGTRC)，(Lane，D.J.In Nucleic acid techniques in bacterial systematics，Stackbrandt，E.和Goodfellow，M.eds，John Wiley & Sons，New York：pp 115-117(1991))，用Taq DNA聚合酶(Roche)通过聚合酶链式反应 (PCR)来扩增菌株P3-42的16S rRNA基因片段。使用下列程序：1)在95℃ 进行5分钟的初始DNA变性步骤；2)在94℃1分钟，在55℃1分钟，在72℃ 1分钟，进行30个循环；3)在70℃进行最终的延伸步骤10分钟。在0.8％ 琼脂糖凝胶中通过电泳纯化PCR产物，所述产物约900碱基对大小，并根 据生产商的说明书，使用PCR纯化试剂盒(Qiagen)，将其从凝胶中提取出来。 通过Medprobe(Norway)的商业服务对纯化的PCR产物进行测序。所测序的 区域列于SEQ ID No 1。将该序列与在GenBank数据库 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)中的DNA序列进行比较。发现该序列与 来自弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)DSM 30039的16S RNA基因的序 列最为匹配(824个核苷酸中的823，99,9％)。因此，可以在分类学上将菌株 P3-42分类为弗氏柠檬酸杆菌。
实施例5.从弗氏柠檬酸杆菌P3-42中克隆肌醇六磷酸酶基因
将弗氏柠檬酸杆菌菌株P3-42的染色体DNA用限制性核酸内切酶 Sau3A部分消化，并将所述消化产物在1％琼脂糖凝胶上进行分级。使用凝 胶纯化试剂盒(Qiagen)从凝胶上分离3-5kb的DNA片段，并将其与BamHI 消化的去磷酸化的λ-ZAP臂(Strata基因)连接起来。随后的文库构建步骤按 照Stratagene的ZAP Express预消化的载体/Gigapack克隆试剂盒的说明书进 行。将文库的噬菌体形式通过生产商(Stratagene)所述的“大量切除”(“mass excision”)方法转化为质粒形式。通过与早期公开的在培养皿上检测肌醇六 磷酸酶活性的方法(Howson和Davis.Enzyme Microb.Technol.5， 377-382(1983)；Chen J.C.Biotechnology techniques 12(10)751-761(1998)； Riccio MX.等，J.Appl.Microbiol.82，177-185(1997))类似的方法来进行质 粒文库的筛选。通过亚克隆来分离并纯化数个肌醇六磷酸酶阳性克隆。将 这些分离物培养在液体培养物(LB培养基，在30℃和200rpm约24小时) 中并在得到的细胞混悬液中测量肌醇六磷酸酶活性(实施例1)。选择具有最 高肌醇六磷酸酶活性(在pH 3.5约5U/ml)的一个克隆进行随后的表征。将分 离自该克隆的质粒DNA命名为pBK(P3-42)，并通过插入DNA的部分DNA 测序进行表征(测序服务获自Medprobe(Norway)。将包含肌醇六磷酸酶基 因的这一序列列在SEQ ID No：2中。弗氏柠檬酸杆菌肌醇六磷酸酶的推导 氨基酸序列列为SEQ ID No：3。使用由NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)提供的BLAST服务进行SEQ ID No：3与 在GenBank中序列的比较，该比较鉴定了来自大肠杆菌的肌醇六磷酸酶是 弗氏柠檬酸杆菌肌醇六磷酸酶的最接近的已知同源物。然而，同源性水平 很低—在两种蛋白质中仅有约62％的氨基酸残基是相同的。
实施例6.来自弗氏柠檬酸杆菌P3-42的肌醇六磷酸酶基因的扩增和表达
通过PCR扩增肌醇六磷酸酶基因。将菌株弗氏柠檬酸杆菌P3-42的染 色体DNA用作模板，并将寡核苷酸o42-5 (GGAATTCATATGAGTACATTCATCATTCG)和o42-3(GGAATT- CGGATCCCTTATTCCGTAACTGCACAC)用作引物。使用Expand High Fidelity PCR系统试剂盒(Roche)进行扩增。使用下列程序：1)在94℃进行初 始DNA变性3分钟；2)在94℃45秒，在55℃45秒，在68℃1分钟，在 72℃1分钟，在74℃1分钟，进行35个循环；3)在72℃进行最终的延伸 步骤10分钟。将得到的PCR产物通过在0.8％的琼脂糖凝胶上电泳，随后 使用凝胶纯化试剂盒(Qiagen)从凝胶上提取DNA来进行纯化。用限制性酶 NdeI和BamHI来消化纯化的PCR产物，并通过PCR纯化试剂盒(Qiagen) 将其从反应混合物中分离。将载体质粒pET11a(Novagen)用限制性核酸内切 酶NdeI和BamHI进行消化，使用虾碱性磷酸酶(Roche)进行去磷酸化，并 在0.8％琼脂糖凝胶上通过电泳纯化。从凝胶上切下线性化的质粒DNA条 带，使用凝胶纯化试剂盒(Qiagen)进行纯化。使用T4DNA连接酶(Roche) 连接两段纯化的DNA片段。将连接反应物用70％乙醇沉淀，用乙醇洗涤， 并直接重悬在50μl的电感受态大肠杆菌XL1-Blue MRF′细胞中。将所述混 悬液转移到0.1cm的电穿孔杯(BioRad)中，并使用Gene Pulser Xcell(BioRad) 装置，在1800V、25μF和200Ω进行电穿孔。电穿孔后立即加入1ml的LB 培养基，将细胞混悬液转移到15ml的塑料管(Falcon)中并在37℃温育，摇 动(200rpm)1小时。将转化的细胞在包含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上 铺板，并在37℃过夜温育。将24个转化子培养在液体培养物中，并使用该 培养物测试肌醇六磷酸酶的活性和质粒DNA的分离。选择产生最高肌醇六 磷酸酶活性和产生预期限制图谱的质粒DNA的一个克隆。将由该克隆包含 的、命名为pET11(P3-42)的质粒用于转化表达宿主菌株BL21(DE3)pLysS (Novagen)。将转化的细胞混悬液在包含2％的葡萄糖的LB中，于37℃摇 动1小时，并将其接种到包含氨苄青霉素(100μg/ml)和葡萄糖(2％)的50ml 的LB中，在30℃，摇动(200rpm)过夜培养。在600nm测量得到的培养物 的OD，并使用所述培养物接种1升的LB+氨苄青霉素(100μg/ml)到OD600 为0.04。继续在30℃培养过夜。在这样的培养物中的肌醇六磷酸酶活性典 型地是50-60U/ml(在pH 3.5测量)。几乎所有的肌醇六磷酸酶分泌到培养基 中。弗氏柠檬酸杆菌肌醇六磷酸酶在其天然宿主和在大肠杆菌的异源表达 过程中都是被有效分泌的酶的事实与来自布氏柠檬酸杆菌的肌醇六磷酸酶 的细胞内性质(Kim H.W.等.Biotechnol.Lett.25，1231-1234(2003))形成对 比。在相同的条件下培养的、用pET11转化的对照菌株BL21(DE3)pLysS 的培养物中的活性低于0.05U/ml。
实施例7.来自弗氏柠檬酸杆菌P3-42的重组肌醇六磷酸酶的纯化
将用pET11(P3-42)转化的BL21(DE3)pLysS的培养物进行离心以去除细 菌细胞，使用旋转式汽化器将其浓缩到起始体积的约1/10并针对水进行透 析直到溶液的传导性减少到低于250μS/cm。用tris碱将溶液的pH调节到 8.0，并将其上样到以25mM tris-HCl，pH 8.0平衡的DEAE Sepharose Fast Flow(Amersham Biosciences)的柱(3×20cm)上。用平衡缓冲液以3ml/min的 流速洗涤所述柱30分钟，随后用在25mM tris-HCl，pH 8.0中的三个连续梯 度的NaCl：0-50mM，50-150mM和150-500mM进行洗脱。三个梯度的每个 梯度设置为进行1小时，流速恒定为3ml/min。收集9ml的级分并测试肌 醇六磷酸酶活性。检测到一个强的活性峰：使用Centriplus concentrators (Amicon)来浓缩在峰级分中的蛋白质，并通过使用12％凝胶和标准的 Laemmli缓冲液系统用SDS PAGE进行分析。这种分析的结果显示通过 DEAE Sepharose获得的重组弗氏柠檬酸杆菌P3-42肌醇六磷酸酶的制备 物包含单一显著的蛋白质组分。基于凝胶的数字图像的扫描(图1)进行的半 定量分析显示纯度约60-70％。
实施例8.来自弗氏柠檬酸杆菌P3-42的重组肌醇六磷酸酶的pH谱
在实施例1中所述的缓冲液和条件下，研究弗氏柠檬酸杆菌P3-42肌 醇六磷酸酶(按照实施例7纯化)的活性对pH的依赖性。所述酶在广泛的pH 区域(2-5.5)具有活性，其中在约pH 3和4-4.5具有两个活性最大值(图2)。
实施例9.来自弗氏柠檬酸杆菌P3-42的重组肌醇六磷酸酶的底物特异性
通过离子交换层析从用真菌肌醇六磷酸酶(Natuphos)处理的肌醇六磷 酸的部分水解产物分离肌醇磷酸酯级分，所述肌醇磷酸酯每个肌醇残基包 含三个、四个或五个磷酸酯。这些制备物的产生和纯化是BioChemis Ltd (St.Petersburg，Russia)提供的商业服务。通过HPLC判断(Sandberg A.S.， Ahderinne R.J.Food Sci.51(3)，547-550)具有的不同磷酸化程度的肌醇磷酸 酯的每个级分的污染少于5％。将商购果糖1，6-二磷酸和果糖6-磷酸(Sigma) 用作模型底物来用于评估弗氏柠檬酸杆菌P3-42肌醇六磷酸酶对二磷酸酯 和单磷酸酯底物的特异性。使用最终反应混合物中2mM浓度的底物，在 pH 3.5，通过标准测试法(实施例1)测量按照实施例7纯化的弗氏柠檬酸杆 菌肌醇六磷酸酶对不同底物的活性。结果(图3)显示所述酶对于肌醇五磷酸 酯具有最大的活性。针对肌醇三磷酸和肌醇四磷酸以及肌醇六磷酸的活性 相当类似，而果糖1，6-二磷酸是相当差的底物。果糖6-磷酸的水解低于可靠 的检测极限。
实施例10.来自弗氏柠檬酸杆菌P3-42的重组肌醇六磷酸酶的比活
使用按照实施例7的纯化制备物来评估弗氏柠檬酸杆菌肌醇六磷酸酶 的比活。根据实施例1在pH 3.5测量肌醇六磷酸酶活性。通过用BCA蛋白 质测试试剂盒(Pierce)测量总蛋白质浓度并通过用SDS PAGE估计的肌醇六 磷酸酶含量(实施例7)对其进行校正来计算肌醇六磷酸酶浓度。按照这些测 量，来自弗氏柠檬酸杆菌P3-42的重组肌醇六磷酸酶的比活约1100U/mg。
实施例11.比较弗氏柠檬酸杆菌P3-42肌醇六磷酸酶与来自布氏柠檬酸 杆菌YH-15的肌醇六磷酸酶
早期描述的来自属于柠檬酸杆菌属家族细菌的唯一肌醇六磷酸酶是来 自布氏柠檬酸杆菌(C.brakii)YH-15的细胞内肌醇六磷酸酶(Kim H.W.等 Biotechnol.Lett.25，1231-1234(2003))。这种酶与本发明的弗氏柠檬酸杆菌 的分泌的肌醇六磷酸酶共有一些性质，两种酶都是具有高比活的酸性肌醇 六磷酸酶。直接比较两种酶的氨基酸序列的是不可能的，因为关于布氏柠 檬酸杆菌酶的序列信息被限制在10个氨基酸残基的一段序列。弗氏柠檬酸 杆菌肌醇六磷酸酶的推导氨基酸序列包含这样的片段，所述片段与来自布 氏柠檬酸杆菌酶的序列共享10个残基中的9个。然而，这样短的序列片段 的比较没有给出关于两种酶的整体同源性的任何结论。在两种酶之间最显 著的不同是细胞定位：来自布氏柠檬酸杆菌的酶是细胞内的，而弗氏柠檬 酸杆菌肌醇六磷酸酶明显是分泌酶。所述酶在其天然宿主中是分泌的，其 推导的氨基酸序列包含信号肽(如通过Signal P算法所预期： http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)，所述酶在其天然信号肽下，也有效 地自大肠杆菌中分泌。除此之外，两种酶的生化性质存在许多明显的不同(表 1)。
表1来自弗氏柠檬酸杆菌P3-42的肌醇六磷酸酶与来自布氏柠檬酸杆 菌YH-15的肌醇六磷酸酶的比较
性质 布氏柠檬酸杆菌 YH-15肌醇六磷酸酶 弗氏柠檬酸杆菌 P3-42肌醇六磷酸酶 定位 细胞内 分泌的 比活 3457U/mg(pH4) 1100U/mg(pH3.5) 最佳pH 4.0 3.0，5.0 热稳定性 20％(*) 58％
(*)在Kim等所述的条件下测量(Biotechnol.Lett.25，1231-1234 (2003))：在100mM乙酸钠，60℃热处理30分钟，随后在37℃进行标准测试。
实施例12.肌醇六磷酸酶变体的产生和表征
使用如上列出的诱变方法，诸如在Morinaga等中公开的方法 (Biotechnology(1984)2，p646-649)，或在Nelson和Long(Analytical Biochemistry(1989)，180，p 147-151)中公开的方法，或在WO 92/18645中所 述的错误阈值(Error Threshold)诱变方法，通过序列SEQ ID No.2的诱变 构建肌醇六磷酸酶变体。
在一种或多种下列表达宿主中异源表达后，对肌醇六磷酸酶变体进行 表征：所述表达宿主为大肠杆菌K12、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)啤酒 糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
1.热稳定性
通过酶的失活温度对所述变体的热稳定性进行表征。通过在不同的温 度下温育10分钟，并随后冷却到室温后，在实施例1所述的酶测试法中测 量酶的残余活性来测定失活温度。失活温度是这样的温度，在所述温度下， 残余的活性是在相同的条件下在室温温育相同时间后的残余活性的50％。 当适合时，通过从测量的活性数据进行内推和外推法来确定相应于50％残 余活性的温度。通过彼此扣除两种酶的失活温度来计算以℃表示的热稳定 性的差异(即，热稳定性差异(T.D.)与亲本肌醇六磷酸酶比较(＝失活温度(变 体)-失活温度(亲本))。
表2列出了不同的变体的热稳定性差异：
表2：来自具有在Seq ID No 3中显示的序列的亲本肌醇六磷酸酶 P3-42的变体的热稳定性差异
变体 热稳定 性差异 P229S 1.5 D112V 1.5 Q82R 1.5 Q274H 1.0 D112Y 2.5 F88Y 1.5 K46E 2.0 S233C 2.0 R288M 4.0 I384L 1.0 Q385R 1.5 Q274L 2.0 E307Y 1.0 T199I 2.0 Q82K 2.0 T203I 1.0 K46E/Q82H 2.5 Q82K/V105I 1.0 N148D/T362I 1.5 K46E/L414I 1.0 F88Y/Y136N 1.0 N95P/N96S 1.5 N95P/N96P 2.0 Q97T/T98G 1.0 Y177F/T199I 2.5 Q274L/Q370H 3.0
K46E/N96Y 2.5 N148D/L301S 1.5 E24D/R288M 1.5 E140V/A322V 2.0 K46E/S195T 2.0 E75K/N365D 1.5 T98P/S235A 2.0 L160F/L215F 1.0 Q274L/K395T 1.5 G67R/Q279E/N308T 2.0 K161N/P229S/R288M 2.0 D53N/D57Y/M152V 2.0 F122Y/S156T/P229S 1.5 E23K/K46E/Q82H 6.0 K46E/Q82H/Q385R 5.0 T203W/E204N/K205R 2.0 T203W/E204H/K205R 3.0 T203W/E204R/K05R 3.0 T203W/E204A/K205R 3.0 A22T/K151G/N308D 2.0 E23K/E75K/F88Y 2.0 M152K/N225D/L301S 2.0 S78T/Q274L/S408I 2.0 L176Q/T199I/T366S 1.5 K46E/V77I/T203S 3.0 K46R/T199I/D367N 1.5 G74R/E204G/R288M 1.5 A22T/T199I/S206T/T207A 1.5 Q82R/F88Y/L126I/I384L 3.0 K46E/Q82H/E168D/Q274L 5.0 Q82K/T154I/Q279E/N308T 5.5 Q82R/D112V/Q274H/T362A 5.0
E24D/E79V/N95D/K360N 1.0 E23K/M28L/A109T/T143P/I384L 2.0 D53N/D57Y/T199L/P229S/R288M 6.0 K46E/Q82R/N148D/T154I/T362I 7.0 D53N/D57Y/P229S/R288M/K358R 5.5 D53N/D57Y/T154I/P2295/R288M 7.0 Y136N/T199T/T203L/E204I/K205P 3.0 E23Q/S101F/Q274L/I384M/K391N 2.0 K46E/Q82H/N95D/D112V/K142R/D383V 5.5 D53N/D57Y/M152V/P229S/R288M/A393P 7.0 D53K/D57Y/M152V/P229S/R288M/A393P 8.0 D53N/D57Y/F88Y/M152V/P229S/Q279E/N308T 6.5 D53N/D57Y/M152V/E204V/P229S/R288M/A393P 8.0 D53N/D57Y/M152V/T154I/P229S/R288M/A393P 8.0 D53N/D57Y/Q82H/G103E/M152V/P229S/R288M/A393P 8.5 K46E/D53N/D57Y/T143I/M152V/L176V/P229S/R288M/A393P 8.0 Q82K/F88Y/N96P/Q97T/T98G/V105I/Q274H/Q279E/A393P 9.0 Q82R/F88Y/N95P/N96P/Q97T/Q279E/I384L/P386Q/A393P 9.0 D53N/D57Y/E75V/M152V/A170T/P229S/R288M/Q385R/A393P 7.5 Q82K/F88Y/N96P/T98G/Y136N/M152V/Y177F/T362I/I384F/A393P/D397 N 10.0 D53N/D57Y/F88Y/N95P/N96P/V105I/D112V/Y136N/N148D/N164D/Q274 H/T362I/I384L/A393P 10.0 D53N/D57Y/Q82K/F88Y/N95P/P102L/V105I/Y136N/N148D/Y177F/Q274 H/Q279E/T362I/A393P 10.0 D53N/D57Y/Q82K/F88Y/N96P/T98G/V105I/D112V/Y177F/Q274L/G343A /T362I/I384L/A393P 9.0
2.其它特征
其它特征也被改善。
使用如上所述的测试法来比较选定变体的热稳定性、比活和胃蛋白酶 稳定性。通过与对照条件相比，在胃蛋白酶温育后，在pH 3.5，37℃测量的 残余活性来表征这些变体的胃蛋白酶稳定性(残余活性＝在胃蛋白酶温育后 的活性/在对照条件下温育后的活性)。在pH 2.0，0.25mg/ml胃蛋白酶，1mM CaCl2和5mg/ml BSA于37℃进行胃蛋白酶温育2小时。对照条件是在pH 5.0， 1mM CaCl2和5mg/ml BSA，在37℃2小时。
表3显示选定变体的性质(来自根据Seq ID No.3的野生型肌醇六磷酸 酶并与其比较)
变体 T.D.[℃] 比活(野 生型活性的％) 胃蛋白酶 稳定性[％残 余活性](野生型 ＝41％) K46E/Q82H 2.2 96 65
序列信息
SEQ ID No：1
CGATTACTAGCGATTCCGACTTCTGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCG
GACTACGACATACTTTATGAGGTCCGCTTGCTCTCGCGAGGTCGCTTCTC
TTTGTATATGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTACTCGTAAGGGCCATG
ATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCAGTTTATCACTGGCAGTCTCC
TTTGAGTTCCCGGCCGAACCGCTGGCAACAAAGGATAAGGGTTGCGCTCG
TTGCGGGACTTAACCCAACATTTCACAACACGAGCTGACGACAGCCATGC
AGCACCTGTCTCAGAGTTCCCGAAGGCACCAAAGCATCTCTGCTAAGTTC
TCTGGATGTCAAGAGTAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACC
ACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAAC
CTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCGACTTAACGCGTTAGCTCCGGAAG
CCACGCCTCAAGGGCACAACCTCCAAGTCGACATCGTTTACGGCGTGGAC
TACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTGAGCGT
CAGTCTTTGTCCAGGGGGCCGCCTTCGCCACCGGTATTCCTCCAGATCTC
TACGCATTTCACCGCTACACCTGGAATTCTACCCCCCTCTACAAGACTCT
AGCCTGCCAGTTTCGGATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGATTTCACA
TCCGACTTGACAGACCGCCTGCGTGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATT
AACGCTTGCACCCTCCGTATTAC
SEQ ID No 2：
AAAGGTGGTGCTGGTAATGAGTACATTCATCATTCGTTTATTATTTTTTT
CTCTCTTATGCGGTTCTTTCTCAATACATGCTGAAGAGCCGAACGGTATG
AAACTTGAGCGGGTTGTGATAGTGAGCCGTCATGGAGTAAGAGCACCTAC
GAAGTTCACTCCAATAATGAAAGATGTTACACCCGATCAATGGCCACAAT
GGGATGTGCCGTTAGGATGGCTAACGCCTCGTGGGGGAGAACTTGTTTCT
GAATTAGGTCAGTATCAACGTTTATGGTTCACAAGCAAAGGTCTGTTGAA
TAATCAAACGTGCCCATCTCCAGGGCAGGTTGCTGTTATTGCAGACACGG
ATCAACGCACCCGTAAAACGGGTGAGGCGTTTCTGGCTGGGTTAGCACCA
AAATGTCAAATTCAAGTGCATTATCAGAAGGATGAAGAAAAAACTGATCC
TCTTTTTAATCCAGTAAAAATGGGGACATGTTCGTTTAACACATTGAAGG
TTAAAAACGCTATTCTGGAACGGGCCGGAGGAAATATTGAACTGTATACC
CAACGCTATCAATCTTCATTTCGGACCCTGGAAAATGTTTTAAATTTCTC
ACAATCGGAGACATGTAAGACTACAGAAAAGTCTACGAAATGCACATTAC
CAGAGGCTTTACCGTCTGAACTTAAGGTAACTCCTGACAATGTATCATTA
CCTGGTGCCTGGAGTCTTTCTTCCACGCTGACTGAGATATTTCTGTTGCA
AGAGGCCCAGGGAATGCCACAGGTAGCCTGGGGGCGTATTACGGGAGAAA
AAGAATGGAGAGATTTGTTAAGTCTGCATAACGCTCAGTTTGATCTTTTG
CAAAGAACTCCAGAAGTTGCCCGTAGTAGGGCCACACCATTACTCGATAT
GATAGACACTGCATTATTGACAAATGGTACAACAGAAAACAGGTATGGCA
TAAAATTACCCGTATCTCTGTTGTTTATTGCTGGTCATGATACCAATCTT
GCAAATTTAAGCGGGGCTTTAGATCTTAACTGGTCGCTGCCCGGTCAACC
CGATAATACCCCTCCTGGTGGGGAGCTTGTATTCGAAAAGTGGAAAAGAA
CCAGTGATAATACGGATTGGGTTCAGGTTTCATTTGTTTATCAGACGCTG
AGAGATATGAGGGATATACAACCGTTGTCGTTAGAAAAACCTGCCGGCAA
AGTTGATTTAAAATTAATTGCATGTGAAGAGAAAAATAGTCAGGGAATGT
GTTCGTTAAAAAGTTTTTCCAGGCTCATTAAGGAAATTCGCGTGCCAGAG
TGTGCAGTTACGGAATAAGTAACTAATTACTATATATAGCGTATTAAAAA
ATAGAAACCCCCGGTTTGTAGTCGGGGGTATTCGTATTGTTCATAATTAC
A
SEQ ID No：3
MSTFIIRLLFFSLLCGSFSIHAEEPNGMKLERVVIVSRHGVRAPTKFTPI
MKDVTPDQWPQWDVPLGWLTPRGGELVSELGQYQRLWFTSKGLLNNQTCP
SPGQVAVIADTDQRTRKTGEAFLAGLAPKCQIQVHYQKDEEKTDPLFNPV
KMGTCSFNTLKVKNAILERAGGNIELYTQRYQSSFRTLENVLNFSQSETC
KTTEKSTKCTLPEALPSELKVTPDNVSLPGAWSLSSTLTEIFLLQEAQGM
PQVAWGRITGEKEWRDLLSLHNAQFDLLQRTPEVARSRATPLLDMIDTAL
LTNGTTENRYGIKLPVSLLFIAGHDTNLANLSGALDLNWSLPGQPDNTPP
GGELVFEKWKRTSDNTDWVQVSFVYQTLRDMRDIQPLSLEKPAGKVDLKL
IACEEKNSQGMCSLKSFSRLIKEIRVPECAVTE
将在上述说明书中提及的所有的出版物，和在所述出版物中引用的文 献都并入本文作为参考。在不背离本发明的范围和精神的前提下，本发明 所述方法和系统的各种改进和变化对于本领域技术人员而言是显而易见 的。尽管本发明已经结合具体的优选实施方案进行描述，应该理解的是要 求保护的本发明不应该被局限于这些具体的实施方案。实际上，对于分子 生物学或相关领域中的那些技术人员显而易见的用来进行本发明的所述模 式的各种改进意图包含在下述权利要求的范围内。