(一)技术领域
本发明涉及一种干扰猪PACAP基因表达的siRNA及其shRNA，以及利用该shRNA构建的慢病毒介导的猪PACAP基因干扰载体及应用。
(二)背景技术
慢病毒载体是一类逆转录病毒载体，以其转染效率高，可感染分裂期和非分裂期细胞，可容纳较大的基因片段等优点，现已被作为转移目的基因的理想载体。而RNA干扰技术是近年来迅速发展起来可以特异性地剔除特定基因或者抑制特定基因表达的一种新技术，在病毒感染、心血管疾病、肿瘤等疾病的治疗中被广泛应用。慢病毒载体介导的RNA干扰，是将慢病毒载体高效感染的特性与RNA干扰特异性抑制同源基因表达的作用结合起来，有望为特定基因的功能以及相关疾病的治疗研究提供新的手段和方法。
垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)由下丘脑合成并分泌，具有多种生理功能，其中刺激生长激素(GH)的释放是其重要功能之一。利用慢病毒介导的猪PACAP基因RNA干扰载体，能够显著降低PACAP基因在细胞内的表达，为研究猪GH调控、转基因高瘦肉率猪提供了研究基础。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种干扰猪PACAP基因表达的siRNA及其shRNA，以及利用该shRNA构建的慢病毒介导的猪PACAP基因干扰载体及应用。
本发明采用的技术方案是：
干扰猪PACAP基因表达的siRNA，其序列如SEQIDNo.1所示：5’-GCTACAGCCGCTATCGGAAACAAAT-3’。该干扰序列为人工设计，能够有效的降低目的细胞PACAP基因和蛋白的表达，荧光定量PCR结果显示PACAP基因的表达量下降了90％，Westernblot结果显示PACAP蛋白表达量下降了88％。
干扰猪PACAP基因表达的shRNA，其序列如SEQIDNo.2所示：5’-GATCGCTACAGCCGCTATCGGAAACAAATTTCAAGAGAATTTGTTTCCGATAGCGGCTGTAGCTTTTTTC-3’。由于直接导入外源的siRNA的话其作用时间有限(一般只有几天)，需要稳定表达的siRNA就有了shRNA，shRNA是在设计的两段siRNA两边加上一段序列、中间加上一段loop序列以后形成的，可以连接到载体上、并通过载体能进入细胞中稳定表达的形式。
本发明还涉及利用所述shRNA构建的慢病毒介导的猪PACAP基因干扰载体，由所述shRNA插入pLV-U6-Zsgreen载体中获得，所述pLV-U6-Zsgreen载体质粒图谱如图1所示，其中U6启动子后为MCS区，目的片断shRNA插入BamHI，EcoRI位点。
本发明还涉及所述siRNA在猪生长激素调控中的应用。
本发明还涉及所述siRNA在培育转基因高瘦肉率猪中的应用。
本发明的有益效果主要体现在：本发明设计的siRNA能够有效降低PACAP基因和蛋白的表达，利用其shRNA构建的慢病毒介导的猪PACAP基因RNA干扰载体，能够显著降低PACAP基因在细胞内的表达，为研究猪GH调控、转基因高瘦肉率猪提供了研究基础。
(四)附图说明
图1为pLV-U6-Zsgreen干扰载体质粒图谱；
图2为PACAPshRNA1测序结果；
图3为PACAPshRNA2测序结果；
图4为PACAPshRNA3测序结果；
图5为有限稀释法测定慢病毒滴度图；
图6为荧光定量PCR结果；
图7、图8为WesternBlotting结果。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：PACAPshRNA慢病毒载体构建
1.1实验材料
(一)载体及目的基因信息：
1)pLV-U6-Zsgreen干扰载体(保存于浙江大学动物遗传育种与繁殖实验室)图谱如图1，U6启动子后为MCS(多克隆位点)区，BamHI和EcoRI为插入位点：
2)目的片断插入BamHI，EcoRI位点，由U6启动子调控表达，该慢病毒载体中含有CMV启动子调控的Zsgreen标记。
3)干扰序列设计如下：
PACAPsiRNA1序列：GCTGGTCTACGGGATAATAAT
PACAPshRNA1序列：
PACAPsiRNA2序列：GCTACAGCCGCTATCGGAAACAAAT
PACAPshRNA2序列：
PACAPsiRNA3序列：CGGAAACAAATGGCTGTTAAGAAAT
PACAPshRNA3序列：
1.2实验流程
PACAPshRNA的构建
1.2.1引物合成
1.2.2载体pLV-U6-Zsgreen用BamHI，EcoRI双酶切，酶切体系如下：
1.2.3酶切完成后胶回收
1.2.4目的片断shRNA利用3’和5’的单链退火获得：
体系：20ul
10×Buffer：2ul
100mMTris-clpH7.5
1MNaCl
10mMEDTA
shDNA-R/shDNA-F：1/1ul
H2O：16ul
退火程序：
1.2.5处理好的目的片段shRNA与载体pLV-U6-Zsgreen连接反应体系：
以上连接液在4℃过夜。
1.2.6转化(感受态细胞:DH5a)
抗性:Amp；37℃，培养过夜
1.2.7转化后的PACAPshRNA平板进行挑菌，37℃250转/分钟摇菌14小时，将菌液测序。
1.3实验结果：
测序结果如下：
PACAPshRNA1测序结果(参见图2，下划线部分即为shRNA1序列)：TTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAGGATCGCTGGTCTACGGGATAATAATTTCAAGAGAATTATTATCCCGTAGACCAGCTTTTTTCAATTCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGTCGCCACCATGGCCCAGTCCAAGCACGGCCTGACCAAGGAGATGACCATGAAGTACCGCATGGAGGGCTGCGTGGACGGCCACAAGTTCGTGATCACCGGCGAGGGCATCGGCTACCCCTTCAAGGGCAAGCAGGCCATCAACCTGTGCGTGGTGGAGGGCGGCCCCTTGCCCTTCGCCGAGGACATCTTGTCCGCCGCCTTCATGTACGGCAACCGCGTGTTCACCGAGTACCCCCAGGACATCGTCGACTACTTCAAGAACTCCTGCCCCGCCGGCTACACCTGGGACGCT
PACAPshRNA2测序结果(参见图3，下划线部分即为shRNA2序列)：AAAGGACGAGGATCGCTACAGCCGCTATCGGAAACAAATTTCAAGAGAATTTGTTTCCGATAGCGGCTGTAGCTTTTTTCAATTCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGTCGCCACCATGGCCCAGTCCAAGCACGGCCTGACCAAGGAGATGACCATGAAGTACCGCATGGAGGGCTGCGTGGACGGCCACAAGTTCGTGATCACCGGCGAGGGCATCGGCTACCCCTTCAAGGGCAAGCAGGCCATCAACCTGTGCGTGGTGGAGGGCGGCCCCTTGCCCTTCGCCGAGGACATCTTGTCCGCCGCCTTCATGTACGGCAACCGCGTGTTCACCGAGTACCCCCAGGACATCGTCGACTACTTCAAGAACTCCTGCCCCGCCGGCTACACCTGG
PACAPshRNA3测序结果(参见图4，下划线部分即为shRNA3序列)TTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAGGATCGCGGAAACAAATGGCTGTTAAGAAATTTCAAGAGAATTTCTTAACAGCCATTTGTTTCCGTTTTTTCAATTCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGTCGCCACCATGGCCCAGTCCAAGCACGGCCTGACCAAGGAGATGACCATGAAGTACCGCATGGAGGGCTGCGTGGACGGCCACAAGTTCGTGATCACCGGCGAGGGCATCGGCTACCCCTTCAAGGGCAAGCAGGCCATCAACCTGTGCGTGGTGGAGGGCGGCCCCTTGCCCTTCGCCGAGGACATCTTGTCCGCCGCCTTCATGTACGGCAACCGCGTGTTCACCGAGTACCCCCAGGACATCGTCGACTACTTCAAGAACTCCTGCCCCGCCGGCTACACCTGGGACCGCCTCCTCCTGGT
实施例2：慢病毒包装
1、实验流程
制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6h更换为完全培养基，培养48h和72h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，0.45um滤器(Millpore公司)过滤病毒上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液。
2、实验材料
慢病毒载体、包装细胞和菌株
该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pSPAX2，pMD2G，pLV-U6-Zsgreen。
293T生长培养基为DMEM(含10％FBS)。
菌株为感受态细胞：DH5a
3、具体步骤
3.1质粒扩增
构建好的慢病毒载体和辅助质粒需经过大量抽提，浓度大于1ug/ul，A260/280在1.7～1.8间方可用以包毒。
3.2传293T细胞
将培养293T细胞T75瓶中的培养基吸净，加入2mL4度冰箱取出的0.25％胰酶，使其均匀覆盖瓶底，置于37度培养箱中3-5min，取出，摇晃可发现细胞于底部脱离，将其全部晃下，加入3mL37度水浴中预热的10％DMEM，移液枪用10mL移液管进行吹打，较大力吹打6-8次即可，不留死角，瓶口处较难吹打可将移液管对准培口，小力将培养基打出即可覆盖到接近瓶口的细胞。之后，将所有细胞吸出，置于15mL离心管中，取50ul混匀后的细胞于1.5mLeppendorf管中，加入450ul10％DMEM，即为10倍稀释，混匀，取10ul细胞于计数板中计数。计数板上共4大格，每大格16小格。计数时，4大格均计数，总数除以4(得每大格细胞数)，再乘以10(10倍稀释)，即为实际n万/mL细胞浓度。传代当天记为第一天，若第二天进行转染，铺900-1000万/T75；若第三天转染，铺350-400万/T75。每瓶T75加10mL10％DMEM培养基。转染当天观察细胞密度，80-90％满即可进行转染。转染前无需换培养基。
3.3做脂转complex
OptiMEM需在37度水浴中预热，转染试剂恢复至室温使用，使用前需摇匀。
转染每瓶T75的complex成分如下：
pSPAX210μg
pMD2G10μg
pLV载体10μg
转染后6h换新鲜培液。
3.4病毒收集
转染后48和72h分别两次收集病毒上清(24h收集后置换新鲜培液)，收集后以0.45μm滤器过滤，于40mL超速离心管中，4℃，72000g/min离心120分钟；
3.5病毒重悬和保存
500ul新鲜培养液重悬病毒沉淀，置于-80度保存。
3.6滴度测定(稀释计数法)：
I.细胞准备
将生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至1x104/ml,加入96孔板，100ul/孔，为每个病毒准备6个孔。放入37℃，5％CO2培养箱中培养。
II.加病毒
第二天，在EP管中做3倍梯度稀释，连续6个稀释度。稀释方法如下：
1)每种病毒准备6个1.5mlEP管，第一管加入105ul培养液以及15ul病毒原液；
2)混匀后从第一个管吸取40ul加入第二个管(含有80ul培养液)；
3)混匀后从第二个管吸取40ul加入第三个管(含有80ul培养液)；
4)以此类推，做6个稀释度(10～3.3*10^-2)，稀释好后将每管液体加入对应的96孔中。
III.观察结果并计算滴度
第五天，在荧光显微镜下观察结果，荧光百分比在10～30％的孔计算病毒滴度：滴度(PFU/ml)＝细胞数*荧光百分比*MOI(1)*病毒稀释倍数*10^3。滴度结果图见图5。
滴度结果：Lv-PACAPsh1,2,3滴度均为1×108PFU/ml，对照组病毒滴度为2×108PFU/ml。说明经慢病毒包装的病毒滴度较高，可用于后续感染目的细胞。
3.7慢病毒感染目的细胞：
方法：转染前24h，将目的细胞(大白猪胎儿成纤维细胞)以105/ml密度接种于12孔板中，使细胞密度达到60％～70％时进行转染。以每孔500ul培养液和细胞的MOI值配制病毒转染体系(每孔100ul病毒液)，吸去原有培养基，每孔加入新鲜配制的混合液，于37℃，5％CO2培养箱中继续培养，转染48h后观察细胞生长状态和绿色荧光表达情况。
结果：设计的三条干扰序列中，PACAPshRNA1和shRNA3虽然能使PACAP基因和蛋白表达量下降，但是干扰效果不明显。PACAPshRNA2能够有效的降低目的细胞PACAP基因和蛋白的表达，荧光定量PCR结果(图6)显示PACAPshRNA2干扰序列能使PACAP基因的表达量下降了90％，Westernblot结果(图7、8)显示PACAPshRNA2感染序列使PACAP蛋白表达量下降了88％，因此利用其构建的慢病毒介导的猪PACAP基因RNA干扰载体，能够显著降低PACAP基因在细胞内的表达，为研究猪GH调控、转基因高瘦肉率猪提供了研究基础。