技术领域
本发明属于分子生物学与生物医药技术领域，具体涉及一种靶向沉寂CDK2 基因的重组腺相关病毒。
技术背景
肝癌由于发病率高、治疗困难、死亡率高等特点在我国恶性肿瘤疾病中居第 二位死因，每年死于肝癌的人数占全世界肝癌年死亡总数的53％，其发病机制至 今仍不明了，治疗方法主要包括放化疗、手术及肝移植，然而，80％以上的肝癌 患者病情已到晚期，无法应用上述治疗方法，即使能够实施手术切除，术后的 复发率也比较高，而且术后的长期预后不能令人满意，因此尚需尽快找到有效 的早期诊断方法和治疗靶点。
研究发现细胞的失控性增殖是恶性肿瘤细胞侵袭性生长及转移的最基本特 征，而其根本原因就是细胞周期调控机制的破坏，已发现的与细胞周期调控密 切相关的分子主要有细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependentkinase， CDKs)、细胞周期蛋白(Cyclin)以及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂 (cyclin-dependentkinaseinhibitor，CKI)三大类。CDK2是细胞周期过程 关键的限速因子，在整个细胞周期中表达水平保持不变，如果单独存在是没有 活性的，只有在不同的细胞周期进程中，与相应的Cyclin结合后才会呈现出蛋 白激酶的活性，磷酸化不同的底物，从而启动或调控细胞周期的主要事件，驱 动细胞周期进程。在细胞周期中主要有两个检查点：G1/S期和G2/M期，这些 检查点对细胞周期起着监控作用，其中，G1/S检查点是细胞周期中的主要限制 点(restrictionpoint)，而CDK2/CyclinE复合物在此过程中起关键性作用。 CyclinE是CDK2的调节亚基，调节着CDK2的活性，当细胞由G1期进入S期， 首先CDK2会与CyclinE结合成复合物，激活CDK2，使视网膜母细胞瘤基因 (retinoblastoma，Rb)磷酸化，高磷酸化后的Rb会完全释放出游离的转录因 子E2F，启动DNA的合成，加速细胞从G1期进入S期。当细胞进入S期后， CDK2/CyclinE复合体降解，CDK2转而与CyclinA结合成新的复合体，从而推 进细胞周期由S期越过限制点进入G2期；因此CDK2活性增高，可以促进细胞 的增殖和分化，是细胞周期的正调节因子，可通过抑制相应的CDK或CDK/Cyclin 复合物的活性，阻止细胞周期进程(详见文献：[1]KusumotoK.Structural featuresofglutamate-basedlipidicmaterialsforsmallinterferingRNA deliverysystem[J].JBiomedMaterResA，2009，89(3)：739-750；[2]Yang X，ZuX，TangJ，etal.Zbtb7suppressestheexpressionofCDK2andE2F4 inlivercancercells：implicationsfortheroleofZbtb7incellcycle regulation[J].MolMedReport，2012，5(6)：1475-1480)。
大量研究表明肿瘤的发生与CDK2和其它细胞周期相关因子的异常表达有关， CDK2基因表达异常，会引起细胞周期紊乱、细胞增殖失控，最终导致癌症。张 桂东等研究证实，CDK2蛋白的异常表达会引起早期胃癌的发生，为临床上胃癌 早期诊断提供实验依据。此外还发现肺癌、结直肠癌、鼻咽癌等肿瘤细胞中CDK2 都呈高表达状态。新近研究发现，靶向CDK2的shRNA能够抑制肝癌细胞的增殖， 因此，通过CDK2基因的深入研究，不仅有助于揭示肿瘤的发生机理，还能为肿 瘤的预防和治疗提供新的思路和手段，由此将CDK2作为肿瘤治疗靶点是一种可 行的方法(详见文献：[3]KusumotoK.Structuralfeaturesofglutamate-based lipidicmaterialsforsmallinterferingRNAdeliverysystem[J].JBiomed MaterResA，2009，89(3)：739-750；[4]YangX，ZuX，TangJ，etal.Zbtb7 suppressestheexpressionofCDK2andE2F4inlivercancercells： implicationsfortheroleofZbtb7incellcycleregulation[J].MolMed Report，2012，5(6)：1475-1480；[5]GaoJJ，FengXB，YoshinoriI，et al.Des-γ-carboxyprothrombinandc-Metwereconcurrentlyand extensivelyexpressedinhepatocellularcarcinomaandassociatedwith tumorrecurrence[J].BiosciTrends，2012，6(4)：153-159；[6]JangKY， NohSJ，LehwaldN，etal.SIRT1andc-Mycpromotelivertumorcellsurvival andpredictpoorsurvivalofhumanhepatocellularcarcinomas[J].PLOSOne， 2012，7(9)：e45119)。
基因治疗是通过一定的载体，将外源基因导入靶细胞，并可有效的进行表 达，达到治疗疾病的目的。腺相关病毒(AAV)因其可以长期稳定表达目的蛋白 以及高度的安全性得到了越来越多的关注。作为基因治疗载体AAV有如下优点： (1)AAV感染范围比较广，能感染分裂期细胞和非分裂期细胞；(2)AAV引起 的免疫反应低，致病性低；(3)定点整合，避免了随机整合导致的宿主细胞发 生突变的危险性；(4)携带的外源基因可持续稳定表达；(5)AAV理化性质稳定， 抗酸碱性和热稳定性好，便于保存。基于这些特性，使AAV成为基因转移最为 理想的载体之一。
8型腺相关病毒(AAV8)属于“杂合”载体，将AAV8的cap基因与携带rep 基因、ITR结构的AAV2组合可得到重组AAV2/8，简称rAAV8。AAV8对肝脏的转 染效率较其它血清型高出10～100倍，因其在肝脏组织显示了高效稳定的基因转 染而备受关注。重组AAV8(rAAV8)现已广泛应用于肿瘤、遗传性疾病、自身免 疫性疾病以及抗病毒的基因治疗研究中。Nakai等研究发现通过小鼠尾静脉注射 给药，rAAV8在体内的转染率及表达水平和给药量成线性关系，转染效果可以达 到100％，并且可持续至少1年以上的时间(详见文献：[7]NakaiH，FuessS， StormTA，etal.Unrestrictedhepatocytetransductionwith adeno-associatedvirusserotype8vectorsinmice[J].JVirol，2005， 79(1)：214-224；[8]SarkarR，TetreaultR，GaoG，etal.Totalcorrection ofhemophiliaAmicewithcanineFVIIIusinganAAV8serotype[J].Blood， 2004，103(4)：1253-1260；[9]Lvfeta.Adeno-associatedvirus-mediated anti-DR5chimericantibodyexpressionsuppresseshumantumorgrowthin nudemice[J].Cancerlett，2011，302：119-127；[10]SimonelliF，Maguire AM，TestaF，etal.GenetherapyforLeber’scongenitalamaurosisis safeandeffectivethrough1.5yearsaftervectoradministration[J].Mol Ther，2010，18(3)：643-650)。但是，关于针对CDK2基因的重组腺相关病毒 用于体内靶向治疗肝癌的应用目前尚未见文献报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种靶向沉寂CDK2基因的重组腺相关病毒。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种靶向沉寂CDK2基因的重 组腺相关病毒是由下列方法构建得到的：
a根据人肝癌细胞CDK2基因序列，设计针对CDK2特异性的siRNA序列， 构建重组质粒pAKD-shRNA-CDK2，利用菌落PCR技术进行DNA测序分析；
b将重组质粒pAKD-shRNA-CDK2、包装质粒pAAV-RC和辅助质粒 pHelper用磷酸钙法共转染AAV-293细胞，收获重组腺相关病毒 rAAV-shRNA-CDK2，采用定量PCR方法对病毒进行滴度测定。
所述的步骤a中针对CDK2特异性siRNA序列为： GACCCTAACAAGCGGATTTCG。
所述的步骤a中在选定的靶点序列基础上添加KpnI(-GTAC-)和BgIII (-GATC-)内切酶的酶切位点序列与转录终止序列，合成完整的shDNA序列：
shDNA-1-GATCCCCCGACCCTAACAAGCGGATTTCGCTCGAGCGAAATCCG CTTGTTAGGGTCTTTTTTTGTAC-
shDNA-2-AAAAAAAGACCCTAACAAGCGGATTTCGCTCGAGCGAAATCCGC TTGTTAGGGTCGGGG-
本发明的优点在于：
1.本发明构建了一种靶向沉寂CDK2基因的重组腺相关病毒 rAAV-shRNA-CDK2，采用可以长期稳定表达目的蛋白以及高度的生物安全性的8 型腺相关病毒(AAV8)为转导载体，利用AAV8对肝细胞的高度亲嗜性感染肝癌 细胞，使其在体内长期稳定表达，从而起到沉寂CDK2基因、抑制肝癌细胞生长 的作用。
2.通过建立人肝癌HepG2细胞裸鼠皮下移植瘤模型实验证实重组腺相关病 毒rAAV-shRNA-CDK2具有抑制肝癌细胞增值的作用，建立了一种有效治疗肝癌 的手段和方法。
附图说明
附图1是质粒载体pAKD-CMV/bGlobin-eGFP-H1-shRNA。
附图2是质粒载体的酶切鉴定结果：1.质粒载体；2.DNAMarker。
附图3是菌落PCR鉴定结果：N为阴性对照组，M为MarkerDL2000，第1-10泳 道为转化子样本。
附图4是DNA全序列测序报告：寡核苷酸片段位于测序图中177位至241位(65 个碱基)。
附图5是测序比对报告。
附图6是重组腺相关病毒在自然光源下观察转染48h(200×)结果。
附图7是重组腺相关病毒在荧光镜下观察转染48h(200×)结果。
附图8是根据病毒滴度定量PCR结果绘制标准曲线。
附图9是裸鼠成瘤情况：1.肿瘤组；2.NC组；3.rAVV-shRNA-CDK2组。
附图10是裸鼠皮下移植瘤生长曲线。
附图11是各实验组抑瘤率。
附图12是重组腺相关病毒沉寂肝癌细胞CDK2基因的定量PCR结果。
附图13和附图14是重组腺相关病毒沉寂肝癌细胞CDK2基因的Westernblot 检测结果。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1：构建靶向沉寂CDK2基因的重组腺相关病毒
一、构建重组质粒pAKD-shRNA-CDK2
根据人肝癌细胞CDK2基因(GenBankAccessionNumber：NM_001798)的序 列，参照Tuschl等提出的siRNA靶序列选择原则，设计出针对CDK2特异性siRNA 序列：GACCCTAACAAGCGGATTTCG。在选定的靶点序列基础上添加KpnI(-GTAC-) 和BgIII(-GATC-)内切酶的酶切位点序列与转录终止序列，委托上海英骏生物 技术有限公司合成完整的shDNA序列：
进行shRNA(shorthairpinRNA)模板的退火，经退火反应后，形成两端带有 KpnI和BgIII酶切位点的双链寡核苷酸片段，标记为CDK2-shRNA。
取pAKD-shRNA质粒载体，利用KpnI和BgIII酶切将之载体线性化，取适 量产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。按照连接反应体系将双链DNA连接入酶切 载体，连接后于22℃孵育1h，立刻转化或冻存于-20℃备用。
制备感受态细胞进行连接产物的转化。挑取平板上长出的转化子进行阳性 克隆鉴定及DNA测序，根据CDK2-shRNA序列设计一对PCR引物(Primer(+)： 5’-ATTTGCATGTCGCTATGTGTTC-3’，Primer(-)：5’- TAAAGGGAACAAAAGCTGGGTA-3’)进行菌落PCR鉴定。
将上述反应产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统中分析结果， 委托华大基因公司对样品进行测序。
经PCR鉴定为有阳性克隆的菌液进行菌种保存，在1.5mlEP管中按菌液和 30％无菌甘油等比例混合，于-20℃冰箱保存。剩余菌液按Promega公司的质粒 小抽试剂盒说明书抽提质粒，所得DNA于-20℃冰箱保存。
二、病毒包装、纯化及滴度测定
常规方法进行AAV-293细胞培养，当细胞达到70～80％融合时采用磷酸钙法 进行病毒转染，即可得到表达EGFP和CDK2-shRNA的rAAV8。
进行病毒的收集、浓缩和纯化。
采用定量PCR的方法对病毒进行滴度测定。通过检测病毒基因组中rAAV载 体的基因组拷贝数来测定rAAV的病毒颗粒数，滴度单位用v.g/ml来表示，即 每ml含有的病毒基因组数(VirusGenome)。将待测病毒样品用DNase和RNase 于37℃消化2～3h，提取病毒DNA，沸水浴5min使之变性，立即置于冰上2min， 将病毒样品与标准品做倍比稀释成不同浓度，进行定量PCR检测，所用引物为： forwardprimer：5’-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3’， reverseprimer：5’-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3’。
反应条件为：94℃变性15s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共进行40循 环。PCR结束后，根据标准品绘制标准曲线，从而计算病毒样品滴度。
三、结果
1.质粒载体的酶切鉴定
利用BglII和KpnI酶将质粒载体(见图1)线性化，进行1％琼脂糖凝胶 电泳检测，于大约6943bp处出现阳性条带(见图2)，表明质粒载体构建正确， 可用于后续实验。
2.菌落PCR鉴定
对菌落PCR结果进行2％琼脂糖凝胶电泳分析(见图3)，结果显示第4、6 泳道在大约174bp处可见阳性条带，与预期结果一致，表明此阳性菌落含有目 的DNA片段，转化成功。取6号转化子进行DNA测序，测序引物为Primer(+)： 5’-ATTTGCATGTCGCTATGTGTTC-3’。
3.测序鉴定分析
采用DNAStar的MegAlign软件对插入片段与测序结果比对。结果证实所选 送测序的重组载体碱基序列完全正确，为正确序列的shDNA，寡核苷酸片段位于 测序图中177位至241位(65个碱基)(见图4和图5)。
4.重组腺相关病毒的荧光表达情况
通过三质粒共转染法转染AAV-293细胞，48h后光镜下观察，可见细胞贴壁 状态良好，呈现不规则的多角形，胞浆透亮，胞核隐约可见(见图6)，在荧光 显微镜下可以看到绿色荧光布满整个细胞，分布较均匀(见图7)，提示转染效率 符合实验要求。
5.定量PCR检测病毒滴度
根据定量PCR结果绘制标准曲线(见图8)，R2＝0.9994，表明线性关系非常 好，通过比对标准曲线计算病毒基因组拷贝数，其平均滴度为3.56×1012v.g/ml。
实施例2：重组腺相关病毒靶向沉寂CDK2基因的动物实验
一、裸鼠皮下移植瘤模型的建立
BALB/c-nu裸鼠，雌性，适应性饲养3天后开始接种，用PBS缓冲液稀释 HepG2细胞悬液浓度至2×107个/ml，取0.2ml/只细胞悬液接种于皮下。接种 后15天将裸鼠随机分成三组：肿瘤组、NC(非相关序列)对照组、rAAV-shRNA-CDK2 组。三组均通过尾静脉注射一次性给药0.2ml/只，肿瘤组注射PBS缓冲液。接 种后每隔五天用游标卡尺测量肿瘤的长径(a)、短径(b)，按照公式V＝a×b2/2， 计算肿瘤体积(见图9)。根据每组裸鼠移植瘤体积的平均值，绘制移植瘤生长 曲线(见图10)。于给药10天后处死裸鼠，称取瘤重，按公式计算抑瘤率(见 图11)：抑瘤率＝(肿瘤组瘤重-给药组瘤重/肿瘤组瘤重)×100％
二、实时荧光定量PCR检测肝癌细胞CDK2基因mRNA表达
根据Genbank数据库查找人CDK2mRNA和内参基因GAPDH(磷酸甘油醛脱氢 酶)mRNA全基因序列，应用引物设计软件PrimerPremie5.0进行设计，委托上 海英骏生物技术有限公司合成。引物序列见表2.1：
表2.1待测基因及内参基因PCR引物序列信息
根据PCR整个反应过程中收集的荧光，采用美国Stratagen公司的MX-3000P 软件来分析各检测样本的Ct值(C代表Cycle，t代表threshold)，采用相对 定量法对CDK2基因进行检测(见图12)。
三、Westernblot检测肝癌细胞CDK2基因蛋白表达
于液氮中取出50g肿瘤组织，加入400μl组织蛋白裂解液，冰上快速制备 组织匀浆，以考马斯亮蓝蛋白定量法测定各组提取的总蛋白浓度，进行SDS-PAGE 凝胶电泳。所得胶片经扫描后应用Gel-ProAnalyzer软件进行条带的灰度分析， 经过独立的3次重复实验，以CDK2条带的灰度值与内参照β-actin条带灰度 值的比值来表示CDK2蛋白的相对表达量(见图13)。
四、结果
实验结果表明，成功构建的靶向沉寂CDK2基因的重组腺相关病毒 rAAV-shRNA-CDK2能够有效抑制人肝癌HepG2细胞的增殖，其抑瘤率为72.18％； 并可以有效抑制肝癌细胞CDK2基因mRNA与蛋白水平的表达，其抑制率分别为 81％、83.2％，可为肝癌基因治疗进一步应用于临床提供理论与实验基础。