桦褐孔菌胞内外混合多糖及其制备方法和药物用途.pdf

《桦褐孔菌胞内外混合多糖及其制备方法和药物用途.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《桦褐孔菌胞内外混合多糖及其制备方法和药物用途.pdf（9页完整版）》请在专利查询网上搜索。

1、(10)授权公告号 CN 101418325 B (45)授权公告日 2012.04.04 CN 101418325 B *CN101418325B* (21)申请号 200810051515.9 (22)申请日 2008.12.03 C12P 19/04(2006.01) A61K 31/715(2006.01) A61P 35/00(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (73)专利权人 王琦 地址 130118 吉林省长春市新城大街 2888 号 (72)发明人 王琦 李雪 王金玲 潘景芝 (74)专利代理机构 吉林长春新纪元专利代理有 限责任公司 22100 代理人。

2、 魏征骥 WO 2007126221 A1,2007.11.08, 全文 . 项小燕 . 桦褐孔菌深层发酵培养基的优化及 甾醇类化合物的调控. 中国优秀博硕士学位论文 全文数据库 ( 硕士 ) 农业科技辑 .2007, 第 2007 年卷 ( 第 1 期 ), 第 D047-62 页 . 殷涌光等 . 超声波辅助提取桦褐孔菌中白桦 脂醇的研究 . 农业机械学报 .2008, 第 39 卷 (第 4 期 ),204-206,199. 张立秋 . 桦褐孔菌菌丝培养特性及其诱变效 应研究 .中国优秀博硕士学位论文全文数据库 ( 硕士 ) 农业科技辑 .2006, 第 2006 年卷 ( 第 12 期。

3、 ), 第 D048-107 页 . (54) 发明名称 桦褐孔菌胞内外混合多糖及其制备方法和药 物用途 (57) 摘要 本发明涉及一种桦褐孔菌胞内外混合多糖及 其制备方法和药物用途， 属于医药领域。 无菌条件 下取斜面菌种接入新鲜的综合固体培养基的平皿 内， 经过一级发酵、 二级发酵， 将二级发酵产物进 行抽滤， 得到桦褐孔菌的菌丝体和发酵液 ； 经过 浓缩、 水提醇沉得桦褐孔菌胞内外混合多糖。 本发 明利用液体深层发酵所得的发酵产物中， 同样含 有药用活性成分， 其生长周期短， 可以成为获取活 性成分的一种有效手段。 本发明经过实验， 从桦褐 孔菌菌丝体及其发酵液中提取得到混合粗多糖， 并。

4、对其抗肿瘤活性进行了研究， 得出桦褐孔菌胞 内外混合多糖具有高抑瘤活性和低毒性的特征。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 潘浩 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 2 页 说明书 6 页 CN 101418325 B1/2 页 2 1. 一种桦褐孔菌胞内外混合多糖， 其特征在于它是由下列方法得到的 ： 一、 无菌条件下取斜面菌种接入新鲜的综合固体培养基的平皿内， 培养温度 26-29， 培养 240-360 小时 ； 该综合固体培养基配方 g/100ml ： 马铃薯 16-26， 葡萄糖 1.2-3.2， 琼脂 1.5-2.5， MgSO40.1。

5、2-0.2， KH2PO40.28-0.35， VB10.0008-0.0012 加水定溶至所需体积， pH 值 自然 ； 二、 一级发酵 ： 在无菌条件下， 用 6mm 的打孔器菌落边缘处打孔， 用接种铲取 6-10 块的 菌饼接入含有 100-150ml 液体培养基的 250ml 摇瓶中， 置于 26-29， 转速为 120-185rpm/ min 的摇床中， 恒温培养 210-300 小时后进行二级发酵培养 ； 该液体培养基配方 g/100ml ： 马铃薯 16-26， 葡萄糖 1.2-3.2， MgSO40.12-0.2， KH2PO40.28-0.35， VB10.0008-0.00。

6、12 加水 定溶至所需体积， pH 值自然 ； 三、 二级发酵 ： 取一级发酵液接种于含有 250-350ml 该液体培养基的 1000ml 二级摇 瓶中， 接种量为 10 -13， 置于 26-29， 转速为 120-170rpm/min 的摇床中， 恒温培养 160-240 小时 ； 四、 将二级发酵产物进行抽滤， 得到桦褐孔菌的菌丝体和发酵液 ； 将菌丝体用蒸馏 水冲洗三次， 置 55-60鼓风干燥箱中烘干， 称重， 60 目粉碎， 按蒸馏水与菌丝体粉末比 45-50 1 置于超声仪内， 48-52， 65-75KHz 超声提取 40min， 重复提取 2-3 次， 合并提取 液， 45。

7、-55减压浓缩至原体积的 1/5-1/10， 得胞内多糖浓缩液 ； 将发酵液 45-55减压浓 缩至原体积的 1/5-1/10， 并与胞内多糖浓缩液合并， 加入 95乙醇， 搅拌， 使乙醇终浓度达 到 75 -80， 4沉淀 8-12 小时， 收集沉淀， 用无水乙醇洗涤 3 次， 55-60恒温干燥， 重复 2 3 次， 得桦褐孔菌胞内外混合多糖。 2. 如权利要求 1 所述的桦褐孔菌胞内外混合多糖的制备方法， 包括下列步骤 ： 一、 无菌条件下取斜面菌种接入新鲜的综合固体培养基的平皿内， 培养温度 26-29， 培养 240-360 小时 ； 该综合固体培养基配方 g/100ml ： 马铃薯。

8、 16-26， 葡萄糖 1.2-3.2， 琼脂 1.5-2.5， MgSO40.12-0.2， KH2PO40.28-0.35， VB10.0008-0.0012 加水定溶至所需体积， pH 值 自然 ； 二、 一级发酵 ： 在无菌条件下， 用 6mm 的打孔器菌落边缘处打孔， 用接种铲取 6-10 块的 菌饼接入含有 100-150ml 液体培养基的 250ml 摇瓶中， 置于 26-29， 转速为 120-185rpm/ min 的摇床中， 恒温培养 210-300 小时后进行二级发酵培养 ； 该液体培养基配方 g/100ml ： 马铃薯 16-26， 葡萄糖 1.2-3.2， MgSO4。

9、0.12-0.2， KH2PO40.28-0.35， VB10.0008-0.0012 加水 定溶至所需体积， pH 值自然 ； 三、 二级发酵 ： 取一级发酵液接种于含有 250-350ml 该液体培养基的 1000ml 二级摇 瓶中， 接种量为 10 -13， 置于 26-29， 转速为 120-170rpm/min 的摇床中， 恒温培养 160-240 小时 ； 四、 将二级发酵产物进行抽滤， 得到桦褐孔菌的菌丝体和发酵液 ； 将菌丝体用蒸馏 水冲洗三次， 置 55-60鼓风干燥箱中烘干， 称重， 60 目粉碎， 按蒸馏水与菌丝体粉末比 45-50 1 置于超声仪内， 48-52， 65。

10、-75KHz 超声提取 40min， 重复提取 2-3 次， 合并提取 液， 45-55减压浓缩至原体积的 1/5-1/10， 得胞内多糖浓缩液 ； 将发酵液 45-55减压浓 缩至原体积的 1/5-1/10， 并与胞内多糖浓缩液合并， 加入 95乙醇， 搅拌， 使乙醇终浓度达 到 75 -80， 4沉淀 8-12 小时， 收集沉淀， 用无水乙醇洗涤 3 次， 55-60恒温干燥， 重复 权 利 要 求 书 CN 101418325 B2/2 页 3 2 3 次， 得桦褐孔菌胞内外混合多糖。 3. 如权利要求 1 所述的桦褐孔菌胞内外混合多糖在制备抗肿瘤的药物中的应用。 权 利 要 求 书 C。

11、N 101418325 B1/6 页 4 桦褐孔菌胞内外混合多糖及其制备方法和药物用途 技术领域 0001 本发明属于医药领域。 背景技术 0002 桦褐孔菌 Inonotus obliquus， 国内还称为桦癌褐孔菌、 斜生纤孔菌。也称 Phaeoporus obliquus， Fuscoporia obliqua， Chaga， Black birchtinder(tuchwood)， birch mushroom， Kabanoanoanatake 等。 属 担 子 菌 亚 门 (Basidiomycotina)、 层 菌 纲 (Hymenomycetes)、 非褶菌目 (Aphyllo。

12、phorales)、 刺革菌科 (Hymenoehaetaeeae)。 0003 桦褐孔菌的形态 ： 它的子实体呈现瘤状 ( 不育性的块状物 )， 直径 25 40cm， 深 色， 表面深裂， 很硬， 干时脆。 孢子阔椭圆状至卵状， 光滑， 有刚毛(setae)。 菌丝为二系菌丝 系统， 具有生殖菌丝和骨架菌丝。气生菌丝多为骨架菌丝， 黄褐色， 具有刚毛状菌丝和稀少 刚毛 ； 基内菌丝多为生殖菌丝， 淡黄褐色， 有隔， 无锁状联合。 0004 分布 ： 桦褐孔菌的菌丝体极其耐寒是生长在寒带的木腐菌， 生于白桦、 银桦、 榆树、 赤杨等活立木的树皮下或砍伐后树木的枯干上， 并能引起白桦、 银杨、。

13、 榆树、 赤杨的白腐。 其 主要分布在北半球北纬4550的地区， 如北美(北部)、 芬兰、 波兰、 俄罗斯(西西伯利 亚、 远东部分地区、 勘察加半岛 )、 中国 ( 黑龙江、 吉林省长白山地区 )、 日本 ( 北海道 ) 等国 家生境。 0005 化学成分 ： 关于桦褐孔菌化学成分的研究已有许多报道， 主要含有羊毛脂烷型 三萜类、 木质素类、 黑色素类等。Lovyagina 等最早从桦褐孔菌中得到一种含叶酸衍生 物蝶酰谷氮酸， 以及芳香物质 ： 香草酸、 丁香酸和一羟基苯甲酸 ； 1961 年和 1962 年 Ludwiczalkt 和 Wrzclono 分别报道从该菌中分离得到桦褐孔菌醇。。

14、Ichimura T 还发现桦 褐孔菌的水提取物中含有低分子量的多酚类。 0006 Yamaguchi T 从桦褐孔菌的水提取物中得到一种水溶性的高分子量的有抑制 HIV-I蛋白酶活性的木质素衍生物。 何坚等还从桦褐孔菌中分离得到麦角甾醇过氧化物、 鞘 氨脂类似物、 甘露醇。 0007 Kukulyanslaya 等发现天然的桦褐孔菌中的黑色素与人工培养的桦褐孔菌合成的 黑色素的理化性质不同， 并存在结构差异， 规定天然合成的黑色素为异黑色素。 Ichimura T 等研究表明桦褐孔菌形成的黑色素属于 1， 1， 3， 4， 4， 6- 六甲基一 7 一乙酰基一 1， 2， 3， 4- 四 氢。

15、萘吐纳麝香类， 从它的碱性降解产物里鉴别得知含有 P 一羟苯酸。 0008 药理作用 ： 桦褐孔菌的主要药理作用为抗肿瘤作用， 其中起主要作用的是三萜类 化合物和多糖类化合物。据李英秀等报道， 桦褐孔菌提取物在 0.5 16.0g/ml 对胃癌 MGC803 细胞株均有抑制细胞增殖作用， 并显示明显的量效关系。张慧丽等研究证明桦褐 孔菌多糖在 1.0 16.0g/ml 范围内， 对肝癌 SMMC7721 细胞株的增殖均有抑制， 并表现出 浓度依赖性关系 . 不同浓度间的抑制率均存在显著性差异。 0009 Jarosz A等研究发现桦褐孔菌菌丝、 菌核中的多糖有抑制细胞周期， 调节酶cdc25 。

16、和 cdc2/cyclin B 的作用。Burczy 报道桦褐孔菌的菌丝体和培养基中的成分能对 Hela 细 说 明 书 CN 101418325 B2/6 页 5 胞的 M、 G 和 Gz 期有阻碍作用， 同时有激活过氧化氢酶活性的作用， 但是这两种作用之间没 有必然的联系。 Rzymowsk研究表明桦褐孔菌的水提取液能够抑制人类母体外子宫颈肿瘤细 胞的生长， 降低肿瘤细胞蛋白质数量和有丝分裂指数值， 干扰肿瘤细胞新陈代谢， 还影响细 胞周期中的 8/G 阶段。此外对恶性肿瘤患者进行放疗、 化疗过程中服用含有桦褐孔菌的有 效成分， 可增强病人的耐受性， 削弱因放疗、 化疗而引起的毒副作用。桦。

17、褐孔菌含有白桦脂 酸， 1999年韩国学者发现这种物质能抑制293型癌细胞达70， 具有很强的抗肿瘤性， 且无 毒副作用。 0010 日本有关报道， 桦褐孔菌对呕吐、 腹泻、 胃肠功能紊乱、 胃及十二指肠溃疡、 肝炎、 胃炎和肾炎有一定的治疗作用 ； 对因不合理的饮食而导致的骨质方面的疾病有一定的预防 和治疗作用。桦褐孔菌还是血液的清洁剂和疼痛的缓解剂， 对皮肤过敏也有一定的疗效。 0011 目前， 国内治疗肿瘤方面的药物很多， 但在天然药物中， 治疗效果很好的中药很 少， 未能达到扶正气， 提高病人的免疫力， 防复发、 转移， 杀灭癌细胞的作用。而桦褐孔菌正 是一种能有效治疗各种癌症并能提高。

18、机体免疫力的天然药物。目前已被列入俄罗斯药典。 对桦褐孔菌子实体的化学成分和药理作用的研究国外已有很多， 特别是对其抗肿瘤作用的 研究。 但在我国桦褐孔菌的研究还处于起步阶段， 大规模人工驯化还没有实现， 其来源主要 是靠采集野生资源， 更加珍贵的是野生的品种只有在活的桦树上生长 10 15 年才具有很 好的药用价值， 并且每两万棵桦树上大约只有一棵生长着桦褐孔菌， 因此野生的桦褐孔菌 价格十分昂贵， 这使桦褐孔菌的开发利用受到了限制。 发明内容 0012 本发明提供一种桦褐孔菌胞内外混合多糖及其制备方法和药物用途， 以解决野生 的桦褐孔菌价格十分昂贵、 使桦褐孔菌的开发利用受到限制的问题。本。

19、发明采取的技术方 案是 ： 它是由下列方法得到的 ： 0013 一、 无菌条件下取斜面菌种接入新鲜的综合固体培养基的平皿内， 培养温度 26-29， 培养 240-360 小时 ； 该综合固体培养基配方 (g/100ml) ： 马铃薯 16-26， 葡萄糖 1.2-3.2， 琼脂 1.5-2.5， MgSO40.12-0.2， KH2PO40.28-0.35， VB10.8-1.2mg 加水定溶至所需体 积， PH 值自然 ； 0014 二、 一级发酵 ： 在无菌条件下， 用 6mm 的打孔器菌落边缘处打孔， 用接种铲取 6-10 块的菌饼接入含有 100-150ml 液体培养基的 250ml。

20、 摇瓶中， 置于 26-29， 转速 为 120-185rpm/min 的摇床中， 恒温培养 210-300 小时后进行二级发酵培养 ； 该液体培 养基配方 (g/100ml) ： 马铃薯 16-26， 葡萄糖 1.2-3.2， MgSO40.12-0.2， KH2PO40.28-0.35， VB10.8-1.2mg 加水定溶至所需体积， PH 值自然 ； 0015 三、 二级发酵 ： 取一级发酵液接种于含有 250-350ml 该液体培养基的 1000ml 二级 摇瓶中， 接种量为 10 -13， 置于 26-29， 转速为 120-170rpm/min 的摇床中， 恒温培养 160-240。

21、 小时 ； 0016 四、 将二级发酵产物进行抽滤， 得到桦褐孔菌的菌丝体和发酵液 ； 将菌丝体用蒸 馏水冲洗三次， 置 55-60鼓风干燥箱中烘干， 称重， 60 目粉碎， 按蒸馏水与菌丝体粉末比 45-50:1 置于超声仪内， 48-52， 65-75Hz 超声提取 40min， 重复提取 2-3 次， 合并提取液， 45-55减压浓缩至原体积的 1/5-1/10， 得胞内多糖浓缩液 ； 将发酵液 45-55减压浓缩 说 明 书 CN 101418325 B3/6 页 6 至原体积的 1/5-1/10， 并与胞内多糖浓缩液合并， 加入 95乙醇， 搅拌， 使乙醇终浓度达到 75 -80， 。

22、4沉淀 8-12 小时， 收集沉淀， 用无水乙醇洗涤 3 次， 55-60恒温干燥， 重复 2 3 次， 得桦褐孔菌胞内外混合多糖。 0017 本发明桦褐孔菌胞内外混合多糖在制备抗肿瘤的药物中应用。 0018 本发明药物的活性组分可以加入制备不同剂型时所需的各种常规辅料， 如崩解 剂、 润滑剂、 粘合剂等以常规的中药制剂方法制备成任何一种常用口服剂型， 如颗粒剂、 丸 剂、 散剂、 片剂、 胶囊剂、 口服液等。 0019 本发明利用液体深层发酵所得的发酵产物中， 同样含有药用活性成分， 其生长周 期短， 可以成为获取活性成分的一种有效手段。 本发明经过实验， 从桦褐孔菌菌丝体及其发 酵液中提取。

23、得到混合粗多糖， 并对其抗肿瘤活性进行了研究， 得出桦褐孔菌胞内外混合多 糖具有高抑瘤活性和低毒性的特征。成人日服药量为 0.81 1.62g/kg。 具体实施方式 0020 试验例 1， 本发明桦褐孔菌胞内外混合多糖的抗肿瘤试验 0021 试验材料， 桦褐孔菌菌种， 2006 年购于黑龙江省伊春市食药用菌研究所 ； 桦褐孔 菌胞内外混合多糖。 0022 阳性对照药， 复方环磷酰胺片为通化茂祥制药有限公司产品， 规格为每片含环磷 酰胺 50mg， 人参茎叶总皂甙 50mg， 批号 ： 070601。 0023 动物及瘤株， 昆明种小鼠， 雌性， 体重 202g， 6 周龄， 购于长春生物制品研。

24、究所， 合格证编号 ： 0006456。 0024 瘤株 ： 肉瘤 S180和肝癌 H22购于吉林省肿瘤研究所。 0025 试验方法 0026 取昆明种小鼠 50 只， 在无菌条件下将接种了 7d 的小鼠腹水用 9g/L 的生理盐水以 1 ： 3的比例稀释至含肿瘤细胞数为5106cfu/只， 小鼠右腋窝皮下接种(0.2mL/只)。 接种 24h 后称重并随机分为 5 组， 每组 10 只， 分别为空白对照组 ( 生理盐水 )、 阳性对照组 复方环磷酰胺组 (30mg/kg) 及桦褐孔菌胞内外混合多糖高剂量组 (500mg/kg)、 中剂量组 (250mg/kg)、 低剂量组 (125mg/kg。

25、)。同时在接种 24h 后灌胃给药， 给药体积为 20mL/kg， 每 日 1 次， 连续给药 10d， 停药后次日称重脱臼致死取瘤块， 称重并计算抑瘤率。 0027 抑瘤率 ( 空白组瘤重 - 给药组瘤重 / 空白组瘤重 )100 0028 胸腺指数胸腺重 / 体重 (mg/g) 0029 脾系指数脾中 / 体重 (mg/g) 0030 统计学处理， SPSS12.0 软件进行统计学处理， 分析组间差异， 试验结果用 (xs) 表示。 0031 结果 0032 1、 桦褐孔菌胞内外混合多糖对小鼠肉瘤 S180抑制作用 0033 桦褐孔菌胞内外混合多糖的高剂量组、 中剂量组和低剂量组对小鼠 S。

26、180肉瘤的抑 制作用均达 30以上， 且高、 中、 低剂量组与空白对照组比较均有极显著性差异 (P0.01)。 其中低剂量组的效果最佳。参考文献将小鼠低剂量 125mg/kg 换算成人服用剂量为 10.125mg/kg， 结果详见表 1。 说 明 书 CN 101418325 B4/6 页 7 0034 表 1 桦褐孔菌胞内外混合多糖对小鼠 S180肉瘤肿瘤抑制率及小鼠体重的影响 0035 (n 10， xs) 0036 0037 注 ： 与空白对照组比较 *P0.05*P0.01 0038 2、 桦褐孔菌胞内外混合多糖对小鼠肝癌 H22抑制作用 0039 桦褐孔菌胞内外混合多糖的高、 中、。

27、 低剂量组对小鼠肝癌 H22的生长均有显著的 抑制作用， 其抑制率均达 30以上， 且呈明显量效关系， 与空白组相比有极显著性差异 (P0.01)。其中高剂量组的效果最佳。参考文献将小鼠高剂量 500mg/kg 换算成人服用剂 量为 40.5mg/kg， 结果详见表 2。 0040 表 2 桦褐孔菌胞内外混合多糖对小鼠肝癌 H22肿瘤抑制率及小鼠体重的影响 0041 (n 10， xs) 0042 0043 注 ： 与空白对照组比较 *P0.05*P0.01 0044 试验例 2 桦褐孔菌胞内外混合多糖急毒实验 0045 方法 0046 经预试， 无法找出 100致死量， 测出 LD50， 因。

28、此对其小鼠最大耐受量进行了试验。 参照文献， 取昆明种小鼠 40 只， 雌雄各半， 随机分为 2 组， 禁食不禁水， 12h 后， 以 20g/kg.d， 16g/kg.d 的高， 中两个剂量给药， 给药体积为 40ml/kg d， 一天内给药一次， 隔日称重， 连续 观察 14d， 每天观察两次， 记录小鼠外观， 行为活动， 精神状态， 大、 小便形状及颜色， 被毛， 肤 色， 呼吸， 运动等状况。 14d后将动物处死， 大体解剖活检动物心、 肝、 脾、 肺、 肾、 脑、 胸腺、 胃、 肠等器官色泽、 位置、 质地等。 说 明 书 CN 101418325 B5/6 页 8 0047 结果 。

29、0048 小鼠， 连续观察 14d 时间小鼠无一只死亡， 其进食、 饮水、 行为方式、 排泄等均未见 异常， 体重均有不同程度的增长， 体重变化见表 3。第 15 天后处死小鼠进行尸体解剖， 均未 有肉眼可见的病变。 0049 表 3 小鼠体重变化情况 (g， xs) 0050 0051 结果显示， 桦褐孔菌胞内外混合多糖组小鼠最大耐受量为 20g/kg。 0052 参考文献计算得到成人最大服药量为 1.62g/kg。 0053 实施例 1 本发明片剂的制备 0054 一、 无菌条件下取斜面菌种接入新鲜的综合固体培养基的平皿内， 培养温度 26， 培养 240 小时 ； 该综合固体培养基配方 。

30、(g/100ml) ： 马铃薯 16， 葡萄糖 1.2， 琼脂 1.5， MgSO40.12， KH2PO40.28， VB10.8mg 加水定溶至所需体积， pH 值自然 ； 0055 二、 一级发酵 ： 在无菌条件下， 用6mm的打孔器菌落边缘处打孔， 用接种铲取6块的 菌饼接入含有100ml液体培养基的250ml摇瓶中， 置于26， 转速为120rpm/min的摇床中， 恒温培养 210 小时后进行二级发酵培养 ； 该液体培养基配方 (g/100ml) ： 马铃薯 16， 葡萄糖 1.2， MgSO40.12， KH2PO40.28， VB10.8mg 加水定溶至所需体积， pH 值自然。

31、 ； 0056 三、 二级发酵 ： 取一级发酵液接种于含有 250-350ml 该液体培养基的 1000ml 二级 摇瓶中， 接种量为 10， 置于 26， 转速为 120rpm/min 的摇床中， 恒温培养 160 小时 ； 0057 四、 将二级发酵产物进行抽滤， 得到桦褐孔菌的菌丝体和发酵液 ； 将菌丝体用蒸馏 水冲洗三次， 置55鼓风干燥箱中烘干， 称重， 60目粉碎， 按蒸馏水与菌丝体粉末比45:1置 于超声仪内， 48， 65Hz 超声提取 40min， 重复提取 3 次， 合并提取液， 45减压浓缩至原体 积的 1/5， 得胞内多糖浓缩液 ； 将发酵液 45减压浓缩至原体积的 1。

32、/5， 并与胞内多糖浓缩 液合并， 加入95乙醇， 搅拌， 使乙醇终浓度达到75， 4沉淀8小时， 收集沉淀， 用无水乙 醇洗涤 3 次， 55恒温干燥， 重复 2 次， 得桦褐孔菌胞内外混合多糖 ； 0058 五、 桦褐孔菌胞内外混合多糖与制备片剂的常规辅料混合， 压片。 0059 实施例 2 ： 本发明颗粒剂的制备 0060 一、 无菌条件下取斜面菌种接入新鲜的综合固体培养基的平皿内， 培养温度 28， 培养 300 小时 ； 该综合固体培养基配方 (g/100ml) ： 马铃薯 21， 葡萄糖 2.4， 琼脂 2.0， MgSO40.16， KH2PO40.31， VB11.0mg 加水。

33、定溶至所需体积， pH 值自然 ； 0061 二、 一级发酵 ： 在无菌条件下， 用6mm的打孔器菌落边缘处打孔， 用接种铲取8块的 菌饼接入含有120ml液体培养基的250ml摇瓶中， 置于28， 转速为150rpm/min的摇床中， 恒温培养 260 小时后进行二级发酵培养 ； 该液体培养基配方 (g/100ml) ： 马铃薯 21， 葡萄糖 2.4， MgSO40.16， KH2PO40.31， VB11.0mg 加水定溶至所需体积， pH 值自然。 说 明 书 CN 101418325 B6/6 页 9 0062 三、 二级发酵 ： 取一级发酵液接种于含有 250-350ml 该液体培。

34、养基的 1000ml 二级 摇瓶中， 接种量为 11， 置于 28， 转速为 150rpm/min 的摇床中， 恒温培养 200 小时 ； 0063 四、 将二级发酵产物进行抽滤， 得到桦褐孔菌的菌丝体和发酵液 ； 将菌丝体用蒸馏 水冲洗三次， 置57鼓风干燥箱中烘干， 称重， 60目粉碎， 按蒸馏水与菌丝体粉末比47:1置 于超声仪内， 50， 70Hz 超声提取 40min， 重复提取 3 次， 合并提取液， 50减压浓缩至原体 积的 1/7， 得胞内多糖浓缩液 ； 将发酵液 50减压浓缩至原体积的 1/7， 并与胞内多糖浓缩 液合并， 加入 95乙醇， 搅拌， 使乙醇终浓度达到 78， 。

35、4沉淀 10 小时， 收集沉淀， 用无水 乙醇洗涤 3 次， 57恒温干燥， 重复 3 次， 得桦褐孔菌胞内外混合多糖。 0064 五、 桦褐孔菌胞内外混合多糖与制备颗粒剂的常规辅料混合， 制颗。 0065 实施例 3 本发明胶囊剂的制备 0066 一、 无菌条件下取斜面菌种接入新鲜的综合固体培养基的平皿内， 培养温度 29， 培养 360 小时 ； 该综合固体培养基配方 (g/100ml) ： 马铃薯 26， 葡萄糖 3.2， 琼脂 2.5， MgSO40.2， KH2PO40.35， VB11.2mg 加水定溶至所需体积， pH 值自然 ； 0067 二、 一级发酵 ： 在无菌条件下， 用。

36、 6mm 的打孔器菌落边缘处打孔， 用接种铲取 10 块 的菌饼接入含有 150ml 液体培养基的 250ml 摇瓶中， 置于 29， 转速为 185rpm/min 的摇床 中， 恒温培养 300 小时后进行二级发酵培养 ； 该液体培养基配方 (g/100ml) ： 马铃薯 26， 葡 萄糖 3.2， MgSO40.2， KH2PO40.35， VB11.2mg 加水定溶至所需体积， pH 值自然 ； 0068 三、 二级发酵 ： 取一级发酵液接种于含有 350ml 该液体培养基的 1000ml 二级摇瓶 中， 接种量为 13， 置于 29， 转速为 170rpm/min 的摇床中， 恒温培养。

37、 240 小时 ； 0069 四、 将二级发酵产物进行抽滤， 得到桦褐孔菌的菌丝体和发酵液 ； 将菌丝体用蒸馏 水冲洗三次， 置60鼓风干燥箱中烘干， 称重， 60目粉碎， 按蒸馏水与菌丝体粉末比50:1置 于超声仪内， 52， 75Hz 超声提取 40min， 重复提取 2 次， 合并提取液， 55减压浓缩至原体 积的 1/10， 得胞内多糖浓缩液 ； 将发酵液 55减压浓缩至原体积的 1/10， 并与胞内多糖浓 缩液合并， 加入 95乙醇， 搅拌， 使乙醇终浓度达到 80， 4沉淀 12 小时， 收集沉淀， 用无 水乙醇洗涤 2 次， 60恒温干燥， 重复 3 次， 得桦褐孔菌胞内外混合多糖。 0070 五、 桦褐孔菌胞内外混合多糖与制备胶囊剂的常规辅料混合， 制颗粒， 装入胶囊。 说 明 书 。