技术领域
本发明属于水产动物病原的检测技术，具体是一种采用环介导等温扩增技术对鱼类黄尾鰤腹水病毒 进行快速检测的试剂盒及其检测方法。
背景技术
黄尾鰤腹水病毒隶属于双片段RNA病毒科(Birnaviridae)、水生双片段RNA病毒属 (Aquabirnavirus)，于1985年首次从黄尾鰤(Seriolaquinqueradiata)分离到。该病毒可以感染鲈鱼、真鲷、 日本比目鱼、琥珀鱼、黄尾鰤等鱼类，目前也已经从贝——日本珍珠贝中分离到黄尾鰤腹水病毒。黄尾 鰤腹水病毒是严重影响海水养殖鱼类的一种传染性疾病的病原，对亚洲海洋水产养殖业造成了严重的危 害。鉴于其严重的危害性，中国国家质量监督检验检疫总局与韩国海洋水产部于2005年发布的《中韩进 出口活水生动物检验检疫协议》中规定，中国出口到韩国的鲈鱼、真鲷、大菱鲆、牙鲆等鱼类必须进行 黄尾鰤腹水病毒的检验检疫，以防止黄尾鰤腹水病毒传播蔓延，给本国的水产养殖业造成损失。因此， 迫切需要建立快速、灵敏、准确的黄尾鰤腹水病毒的检测方法，打破国外技术壁垒，为国家贸易服务。
目前鱼类病毒的检测方法主要包括细胞学诊断技术、免疫学诊断技术、分子生物学诊断技术三大类。 细胞学诊断技术主要包括采用细胞培养分离病毒、组织病理切片及电镜观察，其操作繁琐，检测周期长， 且灵敏度低；免疫学诊断技术主要包括免疫荧光检测、免疫点杂交，其方法具有特异性强、敏感性高的 优点，但方法相当繁琐，不适宜对大量样品进行检测；分子生物学诊断技术主要包括聚合酶链式反应 (PCR)，比较快速、灵敏，但是需要昂贵的PCR仪器，另外需要琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色观察 结果，溴化乙锭是致癌物，对人体和环境有危害，交叉污染问题比较严重。
环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification，简称LAMP)技术，是一种敏感性高、特 异性强的靶DNA快速检测方法，不需要昂贵的仪器，样品中含有少量的病原就能检出。环介导等温扩 增目前已被广泛应用于检测水生动物的病原体，如鱼类病毒(鲤春血症病毒、传染性胰脏坏死病毒、传 染性造血器官坏死病毒、锦鲤疱疹病毒)、对虾病毒(对虾白斑综合症病毒、黄头病毒)、细菌(迟钝爱 德华氏菌)等。据检索，目前尚未见采用环介导等温扩增技术对黄尾鰤腹水病毒进行快速检测的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用环介导等温扩增技术检测黄尾鰤腹水病毒的检测试剂盒，克服现有技 术的不足，以满足现场即时检测的要求。
本发明的另一目的是提供这种检测试剂盒的检测方法，以方便在水产养殖业和国际鱼类贸易中对黄 尾鰤腹水病毒进行快速检测中的应用。
本发明的主要原理为：LAMP技术是使核酸通过在等温环境中的循环置换扩增实现对靶序列的放 大，从而达到检测的目的。基本程序是针对靶基因的6个区域，设计2对特异性引物，同时可以设计1-2 条环引物以加快反应速度，利用一种链置换脱氧核糖核酸聚合酶(Bacillus stearothermophilus DNA polymerase，简称Bst DNA聚合酶)，在恒温65℃左右反应约1h。Bst DNA聚合酶有两大特性：一是具 有5′-3′聚合酶活性，能在恒温状态下扩增DNA核酸；二是Bst DNA聚合酶具有链置换活性，能将新合 成的核酸单链从新生成的DNA双链上置换(取代)下来，形成两条独立的核酸单链以开启下一轮的DNA 核酸合成，进而免去了每次扩增前的DNA变性环节。LAMP反应过程中，一对引物的5′端含有一段 与下游扩增产物互补的序列，因此，这对引物的单链产物就可形成一个类似哑铃状的回文结构，这种结 构正好为下一步等温置换扩增反应提供了一个可被周而复始利用的模板，Bst DNA聚合酶发挥链置换活 性，后阶段退火的引物置换前面引物所形成的链，从而保证了扩增的持续进行。LAMP反应形成一系列 不同长度的具有茎环结构的DNA产物，可以通过荧光染料进行检测。
本发明的技术方案如下：
黄尾鰤腹水病毒的环介导等温扩增快速检测试剂盒，包括提供反应必须的Bst DNA聚合酶、逆转录 酶、反应缓冲液、环介导等温扩增混合液、引物混合液和荧光显色剂，以及提供一种使用该试剂盒检测 鱼类样品中黄尾鰤腹水病毒的方法，以实现对黄尾鰤腹水病毒快速检测的标准化，为鱼类黄尾鰤腹水病 毒的检测提供一种快速、简便、高效、实用的检测方法。
本发明的黄尾鰤腹水病毒的环介导等温扩增快速检测试剂盒的配方如下：
试剂A：BstDNA聚合酶(8U/μL)；
试剂B：逆转录酶(200U/μL)；
试剂C：反应缓冲液，提供Bst DNA聚合酶和逆转录酶发挥作用所必须的物质，其中含有200mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)、100mmol/L氯化钾(KCl)、100mmol/L硫酸铵 ((NH4)2SO4)、80mmol/L硫酸镁(MgSO4)和1％曲拉通X-100(Triton X-100)；
试剂D：环介导等温扩增混合液，其中含有4.0μL 2.5mmol/L dNTP、2.0μL 10mol/L甜菜碱、0.5μL 200U/μL RNA酶抑制剂和5-6μL分子生物学级超纯水；
试剂E：引物混合液，其中含有2μL 20μmol/L正向内引物、2μL 20μmol/L反向内引物、1μL5μmol/L 正向外引物、1μL5μmol/L反向外引物和1μL20μmol/L反向环引物；其中引物序列分别如下：
正向内引物：5′-CGCCATGGGGAAGAGTGTTGATTTTCATTGTGAGAGGCATCCGG-3′；
反向内引物：5′-AGCCGCCGACCAATTCATCGTTTTGTCCTCCTGCTGCATGTG-3′；
正向外引物：5′-TCCCAACCTCTCAAGCCT-3′；
反向外引物：5′-CTGGCCCAGGAGTCCATT-3′；
反向环引物：5′-AGACCTGACCAAGACCAACG-3′。
试剂F：荧光显色剂，成分为100×的荧光染料SYBR GREENI。
采用黄尾鰤腹水病毒的环介导等温扩增快速检测试剂盒的检测方法如下：
(1)待检样品的RNA的提取：
用商业化的试剂盒或者传统的方法提取待检样品的RNA，用核酸分析仪测定RNA，保证其OD260/ OD280在1.7-2.0范围内，调整其浓度在100-200ng/μL之间。
(2)进行黄尾鰤腹水病毒的环介导等温扩增反应：
首先取一个0.2mL的聚丙烯塑料管，加入1-2μL的步骤(1)提取的待测样品的RNA，再加入1μL 试剂A，1μL试剂B，2.5μL试剂C，11.5-12.5μL试剂D，8μL试剂E，使得反应总体积为25μL。其中 引物序列分别如下：
正向内引物：5′-CGCCATGGGGAAGAGTGTTGATTTTCATTGTGAGAGGCATCCGG-3′；
反向内引物：5′-AGCCGCCGACCAATTCATCGTTTTGTCCTCCTGCTGCATGTG-3′；
正向外引物：5′-TCCCAACCTCTCAAGCCT-3′；
反向外引物：5′-CTGGCCCAGGAGTCCATT-3′；
反向环引物：5′-AGACCTGACCAAGACCAACG-3′。
将上述塑料管置于60-65℃的恒温水浴锅中，放置40-60min进行环介导等温扩增反应；之后将水温 再调到80-95℃，放置3-5min以终止反应，取出含扩增产物的塑料管待检。
(3)扩增产物的检测：
在步骤(2)的待检塑料管中加入1μL试剂F，混合均匀，肉眼观察产物的颜色。如果为绿色，则 判定待检样品含有黄尾鰤腹水病毒；如果为橙色，则判定待检样品不含有黄尾鰤腹水病毒。
本发明建立的黄尾鰤腹水病毒的环介导等温扩增检测试剂盒及检测方法，可以对各种鱼类特别是牙 鲆、大菱鲆、鲈鱼、真鲷等样品进行快速检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
第一，本发明不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，只需一恒定温度就能反应，能满足现场及时检 测的要求，操作简单简便。
第二，本发明包括DNA提取、环介导等温扩增反应、产物检测3个过程，在不到3小时内即可完 成，检测时间短。
第三，本发明的扩增模板可仅为10拷贝甚至更少，产量可达到109-1010个拷贝，灵敏度高。
第四，本发明扩增靶序列的六个区段，并且这六个区段的顺序也有规定，因此具有高度特异性。
第五，本发明的LAMP的扩增产物可以与荧光染料结合，肉眼观察就可以进行结果判定，简便高效。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，但不作为对本发明的限制。
实施例1
按照下列配方制作黄尾鰤腹水病毒的环介导等温扩增快速检测试剂盒。
试剂A：1.0μLBstDNA聚合酶(8U/μL)；
试剂B：1.0μL逆转录酶(200U/μL)；
试剂C：2.5μL反应缓冲液，其中含有200mmol/LpH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)、 100mmol/L氯化钾(KCl)、100mmol/L硫酸铵((NH4)2SO4)、80mmol/L硫酸镁(MgSO4)和1％曲拉 通X-100(Triton X-100)；
试剂D：环介导等温扩增混合液，其中含有4.0μL 2.5mmol/L dNTP、2.0μL 10mol/L甜菜碱、0.5μL 200U/μLRNA酶抑制剂和5μL分子生物学级超纯水，共计11.5μL；
试剂E：引物混合液，其中含有2μL20μmol/L正向内引物、2μL20μmol/L反向内引物、1μL5μmol/L 正向外引物、1μL5μmol/L反向外引物和1μL20μmol/L反向环引物；共计7μL。其中引物序列分别如下：
正向内引物：5′-CGCCATGGGGAAGAGTGTTGATTTTCATTGTGAGAGGCATCCGG-3′；
反向内引物：5′-AGCCGCCGACCAATTCATCGTTTTGTCCTCCTGCTGCATGTG-3′；
正向外引物：5′-TCCCAACCTCTCAAGCCT-3′；
反向外引物：5′-CTGGCCCAGGAGTCCATT-3′；
反向环引物：5′-AGACCTGACCAAGACCAACG-3′。
试剂F：1.0μL荧光显色剂，成分为100×的荧光染料SYBR GREENI。
按照以下程序进行检测：
(1)待检样品RNA的提取：
待检样品为某养殖场疑似感染黄尾鰤腹水病毒的牙鲆，体表和鳍充血，腹部膨胀，内有腹水。
使用大连宝生物工程公司的核酸提取试剂盒，按照说明书进行样品RNA的提取。用核酸分析仪测 定牙鲆样品的RNA，其OD260/OD280为1.8，调整RNA浓度为100ng/μL。
(2)进行黄尾鰤腹水病毒的环介导等温扩增反应：
首先取一个0.2mL的聚丙烯塑料管，加入步骤(1)提取的牙鲆样品的RNA2.0μL，再加入1μL试 剂A，1μL试剂B，2.5μL试剂C，11.5μL试剂D，7μL试剂E，使得反应总体积为25μL。
将上述塑料管置于60℃的恒温水浴锅中，放置40min进行环介导等温扩增反应；之后将水浴锅温度 再调到80℃，放置5min以终止反应，取出含扩增产物的塑料管待检。
(3)扩增产物的检测：
在步骤(2)的待检塑料管中加入1μL试剂F，混合均匀，肉眼观察产物的颜色。反应产物颜色为 绿色，据此判定该待检样品牙鲆中含有黄尾鰤腹水病毒。
实施例2
按照下列配方制作黄尾鰤腹水病毒的环介导等温扩增快速检测试剂盒。
试剂A、试剂B、试剂C、试剂E同实施例1。
试剂D：环介导等温扩增混合液，其中含有4.0μL2.5mmol/LdNTP、2.0μL10mol/L甜菜碱、0.5μL 200U/μLRNA酶抑制剂和6μL分子生物学级超纯水；共计12.5μL。
试剂E：同实施例1。
按照以下程序进行检测：
(1)样品RNA的提取：
样品为从某国进口的大菱鲆样品，外观正常。
利用传统的TRIZOL方法进行大菱鲆样品的RNA的提取，参照分子克隆实验指南(第二版)。具体 步骤为取50mg大菱鲆脑、肾、脾等组织进行匀浆，加入600μL TRIZOL裂解液，颠倒混匀，再加入200 μL氯仿，混匀器上震荡混匀5sec。于4℃ 12000rpm离心15min。吸取上清液500μL，加入400μL异丙 醇，-20℃放置30分钟。12000rpm离心15min，倒去上清；然后加入600μL75％乙醇，洗涤沉淀，于12000 rpm离心5min，轻轻倒去上清。将RNA沉淀室温干燥3min后，加入20μL水，轻轻混匀，溶解管壁上 的RNA。2000rpm离心5sec，在冰上保存备用。用核酸分析仪测定大菱鲆样品的RNA OD260/OD280为 2.0，调整RNA浓度为100ng/μL。
(2)进行黄尾鰤腹水病毒的环介导等温扩增反应：
首先取一个0.2mL的聚丙烯塑料管，加入步骤(1)提取的大菱鲆样品的RNA 1.0μL，再加入1μL 试剂A，1μL试剂B，2.5μL试剂C，12.5μL试剂D，7μL试剂E，使得反应总体积为25μL。
将上述塑料管置于63℃的恒温水浴锅中，放置60min进行环介导等温扩增反应；之后将水浴锅温度 再调到85℃，放置3min以终止反应，取出含扩增产物的塑料管待检。
(3)扩增产物的检测
在步骤(2)的待检塑料管中加入1μL试剂F，混合均匀，肉眼观察产物的颜色。反应产物颜色为 橙色，据此判定待检样品大菱鲆中不含有黄尾鰤腹水病毒。
实施例3
按照同实施例2的配方制作黄尾鰤腹水病毒的环介导等温扩增快速检测试剂盒。
按照以下程序进行检测：
(1)样品RNA的提取：
样品为某养殖场采集的鲈鱼，外观正常。
取50mg鲈鱼肝脏组织，样品的RNA的提取方法同实施例2。用核酸分析仪测定鲈鱼样品的RNA OD260/OD280为1.8，调整RNA浓度为100ng/μL。
(2)进行黄尾鰤腹水病毒的环介导等温扩增反应：
取一个0.2mL的聚丙烯塑料管，加入步骤(1)提取的鲈鱼样品的RNA1.0μL，再加入其它反应成 分同实施例2。
将上述塑料管置于65℃的恒温水浴锅中，放置50min进行环介导等温扩增反应；之后将水浴锅温 度再调到82℃，放置3min以终止反应，取出含扩增产物的塑料管待检。
(3)扩增产物的检测
在步骤(2)的待检塑料管中加入1μL试剂F，混合均匀，肉眼观察产物的颜色。反应产物颜色为 橙色，据此判定待检样品鲈鱼中不含有黄尾鰤腹水病毒。
核苷酸序列表
<110>山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120>黄尾鰤腹水病毒的快速检测试剂盒及其检测方法
<160>5
<210>1
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>primer_bind
<222>(1)...(44)
<223>根据环介导等温扩增反应要求设计，用于扩增黄尾鰤腹水病毒的正向内引物。
<400>1
cgccatgggg aagagtgttg attttcattg tgagaggcat ccgg 44
<210>2
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>根据环介导等温扩增反应要求设计，用于扩增黄尾鰤腹水病毒的反向内引物。
<400>2
agccgccgac caattcatcg ttttgtcctc ctgctgcatg tg 42
<210>3
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>primer_bind
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<223>根据环介导等温扩增反应要求设计，用于扩增黄尾鰤腹水病毒的正向外引物。
<400>3
tcccaacctc tcaagcct 18
<210>4
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<222>(1)...(18)
<223>根据环介导等温扩增反应要求设计，用于扩增黄尾鰤腹水病毒的反向外引物。
<400>4
ctggcccagg agtccatt 18
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>primer_bind
<222>(1)...(20)
<223>根据环介导等温扩增反应要求设计，用于扩增黄尾鰤腹水病毒的反向环引物。
<400>5
agacctgacc aagaccaacg 20