技术领域
本发明一株表达赖氨酸氨肽酶的重组毕赤酵母的构建及表达方法，属于生物工程技术及酶学特征研究领域。具体涉及两个方面：1.一种产赖氨酸氨肽酶的重组毕赤酵母及其构建方法；2.重组赖氨酸氨肽酶酶学性质研究。
背景技术
赖氨酸氨肽酶作为一种外切型蛋白酶，在食品、医药和化工等多种领域都有很重要的应用。可用于去除蛋白水解液中的苦味、蛋白质的深度水解、生物活性肽的制备及重组蛋白固定剂或蛋白序列测定所需的工具酶等，在食品、医药保健与化工行业应用前景广阔。
毕赤酵母，作为一种被广泛应用的宿主，已经成功的表达了上百种外源蛋白。它作为一种真核表达宿主与原核相比有许多的优点：高密度发酵，遗传稳定性高，不易染菌，诱导剂便宜，分泌表达等。毕赤酵母会对所表达的蛋白进行翻译后修饰，而这往往会使所表达的蛋白酶的温度稳定性和酶催化效率有所提升。
因此，实现铜绿假单胞菌赖氨酸氨肽酶在毕赤酵母中的表达将具有重要的意义。
发明内容
本发明目的是提供将来源于铜绿假单胞菌的赖氨酸氨肽酶基因导入到毕赤酵母中得到的基因工程菌的构建方法和基本酶学性质研究。
本发明的技术方案：一种胞外分泌表达来源于铜绿假单胞菌NJ-814（CGMCC No.7638）赖氨酸氨肽酶的重组毕赤酵母的构建方法，是将来源于铜绿假单胞菌NJ-814的赖氨酸氨肽酶基因PLAP导入到毕赤酵母GS115中得到的基因工程菌，简称为重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-PLAP。利用构建好的基因工程菌发酵制备重组赖氨酸氨肽酶，并研究重组赖氨酸氨肽酶的基本酶学性质。
步骤为：
（1）用赖氨酸氨肽酶基因序列设计一对引物P1、P2，以铜绿假单胞菌NJ-814基因组为模板，P1、P2为引物扩增目的基因；
上游引物P1：5＇-CCGGAATTCA TGGGCAAACC CTAACCC- 3＇，下划线表示EcoRΙ酶切位点；
下游引物P2：5＇-TCCCCTAGGT TACTTGATGA AGTCGTGACC CC- 3＇，下划线表示AvrⅡ酶切位点；
（2）将目的基因连接到表达载体pPIC9K上，获得重组质粒pPIC9K-PLAP，转化E.coli JM109，涂布于含氨苄抗性的LB固体平板上，菌落PCR扩增目的基因、双酶切进行验证阳性转化子，验证正确的重组载体pPIC9K-PLAP送去测序；
（3）测序正确的重组载体pPIC9K-PLAP用Bgl II进行单酶切，经酶切线性化之后，同毕赤酵母感受态细胞混匀，进行电击转化，参数设置1500 V，400Ω，25/50 μF，4-6 ms；将电转液涂布于MD平板，待菌长出来以后分别点接于MM及MD平板，获取重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-PLAP；
（4）筛选获得重组菌，进行表达验证。
用所述的方法构建的重组毕赤酵母分泌表达赖氨酸氨肽酶的方法，所述分泌表达方法如下：
（1）挑取MD平板上的单菌落于25 mL BMGY培养基中，30℃、230 rpm 培养18h；
（2）将培养液置于提前灭过菌的离心管中离心收集沉淀，将沉淀重溶于25 mL BMMY培养基中25℃培养120 h，每隔24 h向培养液中添加终浓度1.5%的甲醇进行甲醇诱导；
（3）将获得的发酵液，10000 rpm 离心5 min，即得赖氨酸氨肽酶粗酶液。
所述赖氨酸氨肽酶基因PLAP来源于铜绿假单胞菌NJ-814基因组，赖氨酸氨肽酶基因PLAP序列如 SEQ ID NO.1 所示。
所述毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母菌株GS115。
根据所述的重组毕赤酵母分泌表达赖氨酸氨肽酶的方法，将所得赖氨酸氨肽酶粗酶液进行30%-40%的硫酸铵盐析，pH9.0 的Tris-HCl缓冲液透析过夜，之后进行特性研究；特性如下：其最适反应温度为80℃；在50-60℃条件下保温120min后，相对酶活仍高于80%，具有良好的热稳定性；最适pH为9.0，在pH 7.0-9.5之间相对稳定。
根据所述的重组毕赤酵母分泌表达赖氨酸氨肽酶的方法，对重组赖氨酸氨肽酶的底物特异性研究表明：该酶对Lys-pNA水解能力最强，为Leu-pNA的1.7倍。
所述的铜绿假单胞菌NJ-814（CGMCC No.7638），由本研究室筛选并保存。该菌株在已授权的专利“一株耐热氨肽酶的产生菌及该酶的纯化方法”ZL 201310253385.8公开。
所述编码赖氨酸氨肽酶基因的基因PLAP序列如SEQ ID NO.1所示。
赖氨酸氨肽酶酶活测定方法：
以L-亮氨酸-对硝基苯胺为底物，加入2 mL pH 9.0的Tris-HCl缓冲液，1 mL稀释适当倍数的酶液和1 mL底物（2 mM），80℃反应10 min，在405 nm处测定吸光值，计算酶活力。
赖氨酸氨肽酶酶活定义：
在一定条件下，每分钟分解L-亮氨酸-对硝基苯胺产生1μM的对硝基苯胺所需要的酶量，即为一个酶活单位。
计算公式： （其中Abs为405 nm处吸光值）
本发明的有益效果：本发明提供了一种产赖氨酸氨肽酶的重组毕赤酵母及其构建方法，该方法简单有效，构建的重组毕赤酵母能表达赖氨酸氨肽酶，能为后期研究赖氨酸氨肽酶的特性、结构等提供所需蛋白。
本发明所构建的赖氨酸氨肽酶在重组毕赤酵母中的整合表达，不仅具有很好的遗传稳定性，且表达的重组氨肽酶具有良好的温度稳定性，为氨肽酶的产业化和在食品领域中的应用奠定了优良的基础。
附图说明
图1 赖氨酸氨肽酶（PLAP）的扩增结果（M：Marker，1、2：目的基因）
图 2 重组质粒pPIC9K-PLAP的双酶切验证。
图3重组毕赤酵母的筛选（MD及MM平板）。
图 4 重组毕赤酵母表达SDS-PAGE（M：Marker；1：GS115原始菌；2：重组毕赤酵母上清液其中目的蛋白在55KD附近）。
图 5重组赖氨酸氨肽酶的最适pH。
图 6 重组赖氨酸氨肽酶pH稳定性。
图7 重组赖氨酸氨肽酶最适反应温度。
图8 重组赖氨酸氨肽酶的热稳定性（以赖氨酸对硝基苯胺为底物）。
图 9重组赖氨酸氨肽酶底物特异性。
具体实施方式
所用培养基：
LB（g/L）：胰蛋白胨 10，酵母膏 5，NaCl 10，pH 7.0；
YPD（g/L）：蛋白胨 20，葡萄糖20，琼脂 20；
MD（g/L）：葡萄糖20，琼脂20，YNB 13.4，生物素 0.4；
MM (g/L)：甲醇 5 mL/L，琼脂20，YNB 13.4，生物素 0.4；
BMGY (g/L): 蛋白胨 20，甘油 10，酵母膏10，YNB 13.4，生物素 0.4，100 mM磷酸盐缓冲液pH 6.0：
BMMY (g/L): 蛋白胨 20，甲醇 10，酵母膏10，YNB 13.4，生物素 0.4，100 mM磷酸盐缓冲液pH 6.0；
大肠杆菌E.coliJM109、毕赤酵母GS115和pPIC9K载体由本研究室保藏
T4 DNA连接酶、限制性内切酶EcoRⅠ和AvrⅡ以及共用Buffer购自宝生物工程（大连）有限公司。
实施例1胞外分泌表达赖氨酸氨肽酶的重组毕赤酵母的构建方法。
为实现赖氨酸氨肽酶基因在毕赤酵母中的表达，以赖氨酸氨肽酶基因设计两对基因引物。
上游引物P1：5＇-CCGGAATTCA TGGGCAAACC CTAACCC- 3＇（下划线表示EcoRΙ酶切位点）；
下游引物P2：5＇-TCCCCTAGGT TACTTGATGA AGTCGTGACC CC- 3＇（下划线表示AvrⅡ酶切位点）；
以铜绿假单胞菌基因组为模板，P1及P2为引物扩增目的基因。PCR体系为（50μL）：PrimerSTAR酶 25μL；基因组 1μL；P1 1μL；P2 1μL；ddH2O 22μL。PCR条件为：95 ℃预变性5 min；95℃变性15 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s；72℃后延伸5 min；35个循环。
将扩增获得的目的基因与质粒pPIC9K用EcoR I及AvrⅡ分别单酶切，单酶切体系如下：
单酶切体系（40μL）体系：目的基因/质粒12μL，限制酶2μL，双蒸水22μL，Buffer 4μL。37℃，EcoR I酶切反应3 h，纯化试剂盒回收。再AvrⅡ同温度下酶切3h，胶回收目的条带。
将双酶切后的目的基因与载体按摩尔比8:1的比率混合，16℃过夜并转化E.coli JM109。涂布于含氨苄抗性（100μg/mL）的LB培养基中培养12-16 h。挑取4株菌进行PCR扩增及双酶切验证，验证正确的进行序列测定，测序正确的即为重组载体pPIC9K-PLAP。
毕赤酵母感受态细胞的制作：
（1）挑取毕赤酵母GS115单菌落接种到5 mL YPD试管培养过夜（10 h）；
（2）以1 %接种量接到50 mL YPD三角摇瓶中，30℃培养过夜，至OD600达到1.5左右（12 h）；
（3）取50 mL灭菌的离心管，每个离心管中装入25 mL菌液，置于冰上半小时；
（4）4℃，4000 rpm离心6 min，用50 mL预冷的无菌水悬浮；
（5）4℃，4000 rpm离心6 min，用25 mL预冷的无菌水悬浮；
（6）按步骤（5），离心10 min，用2 mL预冷的山梨醇洗涤；
（7）将沉淀重悬于80 μL 山梨醇以得到感受态细胞。
取上述感受态细胞与Bgl II线性化处理的pPIC9K-PLAP混合，于1500 V，400Ω，25/50 μF，4-6 ms条件下进行电转，将电转液涂布于MD平板上，30℃培养4 d，待转化子长出后，挑取12株分别点样到MM及MD平板上，30℃培养2 d，其中在MD平板上正常生长但是在MM平板上几乎不长的即为含有目的基因的重组毕赤酵母。
实施例2 重组毕赤酵母分泌表达赖氨酸氨肽酶的方法
挑取活化后的重组毕赤酵母于10 mL/50 mL的YPD培养基中，230 rpm、30℃，培养20 h。按1%接种量吸取培养液于25 mL/250 mL的BMGY培养基中，230 rpm、30℃，培养18 h，而后将培养液3000 rpm离心5 min收集菌体，用BMMY重悬菌体并置于25/50 mL的三角瓶中，230 rpm、25℃培养120 h，中间每隔24 h添加终浓度1.5 %的甲醇进行诱导表达。将获得的发酵液，10000 rpm 离心5 min，即得氨肽酶粗酶液，测得的粗酶液酶活为1.26 U/mL。
实施例3重组赖氨酸氨肽酶的酶学性质研究
对实施例2中的粗酶液经过硫酸铵盐析（30%-40%）、pH9.0 的Tris-HCl缓冲液透析过夜后，对该重组氨肽酶进行酶学性质研究结果表明：
（1）最适反应pH及pH稳定性
将粗酶液稀释适当的倍数，分别在pH为6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5，10.0，10.5的条件下测定氨肽酶酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活力。结果见图5，该重组耐热氨肽酶最适反应pH为9.0，为碱性蛋白酶。
将粗酶液稀释适当的倍数，分别在pH为6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5，10.0，10.5时，50℃分别保温1h及2h，测定氨肽酶酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活力。结果见图6，该重组耐热氨肽酶在pH8.5条件下稳定性最好，其pH稳定范围为7.0-9.5，且温浴1h和2h下相对酶活性变化小。
（2）最适反应温度及稳定性
在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃条件下测定氨肽酶酶活，以酶活最高者为100%。结果见图7，从图上可以看出，80℃为该酶的最适反应温度。
在50℃、60℃、70℃及80℃条件下，将粗酶液分别保温1 h 及2 h后，立即放入冰盒中进行冷却，然后以赖氨酸对硝基苯胺为底物测定氨肽酶酶活，定义未经热处理的氨肽酶测得的酶活为100%，计算相对酶活力。结果见图8，从图中可以看出，该重组耐热氨肽酶在50℃及60℃下较稳定，温浴2 h后，相对酶活仍保持在80%以上。
（3）重组氨肽酶底物特异性
分别以赖氨酸对硝基苯胺(Lys-pNA)、亮氨酸对硝基苯胺(Leu-pNA)、脯氨酸对硝基苯胺(Pro-pNA)、谷氨酰胺对硝基苯胺（Glu-pNA)配制等摩尔（2 mmol/L）的底物，在最适条件下测定酶活，定义最高酶活为100%。结果见图9，从图中可以看出，该酶对Lys-pNA水解能力最强，约为Leu-pNA的1.7倍。
<210> SEQ ID NO: 1
<211> 1500
<212> DNA
<213> 赖氨酸氨肽酶基因
<400> 1
atgggcaaac ccaacccgtc gatctgcaaa tcgccgttgc tggtcagcac cccgcttggc 60 ctgccgcgct gcctgcaagc cagcaacgtg gtcaagcgcc tgcagaagct ggaggacatc 120 gccagtctca acgacggcaa ccgcgccgcc gccacgccgg gctaccaggc ctccgtcgac 180 tacgtgaagc agaccctgca gaaagccggc tacaaggtca gcgtgcagcc cttcccgttc 240 accgcctact acccgaaagg cccgggtagc ctgagcgcca ccgtgccgca gccggtcacc 300 tacgaatggg agaaggactt cacctacctg tcgcagaccg aggcaggcga cgtcaccgcc 360 aaggtggtcc cggtggacct gtccctcggc gccggcaaca cctccaccag cggttgcgag 420 gcggaagact tcgccaactt cccggccggc tcgatcgcgc tgatccagcg cggcacctgc 480 aacttcgagc agaaggccga gaacgccgcg gccgccggcg ccgccggggt gatcatcttc 540 aaccagggca acaccgacga ccgcaagggc ctggagaacg tcaccgtggg cgagtcctac 600 gagggcggca tcccggtgat cttcgccacc tacgacaacg gcgtggcctg gtcgcagacc 660 ccggacctgc agttgcacct ggtggtcgac gtggtacgca agaagaccga gacctacaac 720 gtggtcgccg agacccgtcg cggcaacccg aacaacgtgg tgatggtcgg cgcgcacctc 780 gactcggtgt tcgaaggccc cggtatcaac gacaacggtt cgggcagcgc cgcccaactg 840 gagatggccg tgctgctggc caaggcgctg ccggtcaaca aggtgcgctt cgcctggtgg 900 ggcgccgagg aagccggcct ggtgggctcg acccactacg tgcagaacct cgccccggaa 960 gagaagaaga agatcaaggc ctacctgaac ttcgacatga tcggctcgcc gaacttcggc 1020 aacttcatct atgacggcga cggttccgac ttcggcctcc agggtccgcc cggctcggcc 1080 gccatcgagc gcctgttcga agcctacttc cgcctgcgcg gccagcaatc ggaaggcacc 1140 gagatcgact tccgctccga ctacgccgag ttcttcaaca gcggcatcgc cttcggcggc 1200 ctgttcaccg gcgccgaggg cctgaagacc gaagagcagg cgcagaagta cggcggcacc 1260 gccggcaagg cctacgacga gtgctaccac agcaagtgcg acggcatcgc caacatcaac 1320 caggacgccc tggagatcca cagcgacgcc atggccttcg tgaccagttg gctgtcgctg 1380 tcgaccaagg tggtcgacga cgagatcgcc gccgccggcc agaaagcaca atcgcggtcg 1440 ctgcagatgc agaagagcgc cagccagatc gaacgctggg gtcacgactt catcaagtaa 1500