胚胎肾脏的体外器官培养方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102391983 A (43)申请公布日 2012.03.28 CN 102391983 A *CN102391983A* (21)申请号 201110345247.3 (22)申请日 2011.11.04 C12N 5/073(2010.01) (71)申请人 四川大学华西医院 地址 610041 四川省成都市武侯区外南国学 巷 37 号 (72)发明人 周钦 吕小岩 陈铁林 孙环 魏于全 (74)专利代理机构 成都虹桥专利事务所 51124 代理人 梁鑫 (54) 发明名称 胚胎肾脏的体外器官培养方法 (57) 摘要 本发明属于生物技术领域， 涉及哺乳动物的 胚。

2、胎肾脏的体外器官培养方法， 特别是小鼠胚胎 期肾脏的离体器官培养。本发明要解决的技术问 题主要是现有培养方法需要特殊材料和占用空间 大的缺陷。本发明技术方案是胚胎肾脏的体外器 官培养方法， 包括以下步骤 ： a、 在多孔培养板的 培养孔中放入尺寸与之适配的承载片， 在培养孔 底部构建出培养空间 ； b、 将取得的哺乳动物胚胎 肾脏或胚胎肾脏原基放置于承载片上， 加入培养 基， 使肾脏处于培养基和空气的交界处 ； c、 37 培养箱中培养， 然后每 1 到 2 天进行培养基换液。 使用本发明方法能大量低成本地获得稳定发育且 便于后继操作的体外培养肾脏器官， 还能满足大 规模药物筛选的需求。 (5。

3、1)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 1 页 附图 6 页 CN 102391991 A1/1 页 2 1. 哺乳动物胚胎肾脏的体外器官培养方法， 其特征在于包括以下步骤 ： a、 在多孔培养板的培养孔中放入尺寸与之适配的承载片， 在培养孔底部构建出培养空 间 ； b、 将取得的哺乳动物胚胎肾脏放置于承载片上， 加入培养基， 使肾脏处于培养基和空 气的气 - 液交界处 ； c、 36 38培养箱中培养， 然后每 1 到 2 天进行培养基换液。 2.根据权利要求1所述的哺乳动物胚胎肾脏的体外器官培养方法， 其特。

4、征在于 ： 步骤a 所述的多孔培养板为 24 孔培养板。 3. 根据权利要求 1 所述的哺乳动物胚胎肾脏的体外器官培养方法， 其特征在于 ： 在使 用多孔培养板的各孔间隙加入湿度平衡液， 以减缓培养基挥发。 4. 根据权利要求 1 所述的哺乳动物胚胎肾脏的体外器官培养方法， 其特征在于 ： 步骤 b 中加入培养基后调整承载片于培养孔的底部的中心， 哺乳动物胚胎肾脏位于承载片的中 部。 5.根据权利要求1所述的哺乳动物胚胎肾脏的体外器官培养方法， 其特征在于 ： 步骤c 中所述的培养基采用半量递增的方式换液， 即每次换液时保留上次培养基体积的一半在原 培养孔中， 然后将比上次培养基体积的一半按体。

5、积分数还多增加 6 -12的新鲜培养基 加入培养孔。 6.根据权利要求1所述的哺乳动物胚胎肾脏的体外器官培养方法， 其特征在于 ： 步骤a 所述的承载片为透明玻璃圆片。 7. 根据权利要求 1 所述的哺乳动物胚胎肾脏的体外器官培养方法， 其特征在于 ： 所述 湿度平衡液为无菌的磷酸盐缓冲液或蒸馏水。 8. 根据权利要求 1 所述的哺乳动物胚胎肾脏的体外器官培养方法， 其特征在于 ： 所述 胚胎肾脏为分离的胚胎期 10 13 天的小鼠肾脏原基。 9. 根据权利要求 1 所述的哺乳动物胚胎肾脏的体外器官培养方法， 其特征在于 ： 将肾 脏平放。 权 利 要 求 书 CN 102391983 A C。

6、N 102391991 A1/6 页 3 胚胎肾脏的体外器官培养方法 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 涉及哺乳动物的胚胎肾脏的体外器官培养方法， 特别 是小鼠胚胎期肾脏的离体器官培养。 背景技术 0002 体外器官培养属于组织培养的一种高级形式， 它能再现器官的发育过程， 模拟器 官在不同状态及条件下的功能状态， 是是了解器官发育过程， 研究疾病致病机制及药物筛 选的重要技术手段。 0003 目 前 肾 脏 体 外 器 官 培 养 目 前 有 ： 由 Saxen L 等 于 1966 年 发 表 于 杂 志 InternationalJournal of Cancer 上 Cel。

7、l contact and cell adhesion during tissue organization 1966May 15 ； 1(3) ： 271-90. 一文中， 他们利用 3.5cm 培养皿， 放入 2ml 培 养基， 将孔径 5um 左右的聚碳酸脂滤膜漂在培养基上或者用不锈钢网做支架支撑。然后 将小鼠胚胎肾脏放置于滤膜上， 置于气液交界处培养 ( 参见附图 1、 图 2)。最新的是 2010 年， Jamie A.Davies 在杂志 PLoSOne 中发表的 A novel， low-volume method for organ culture of embryonic k。

8、idneys thatallows development of cortico-medullary anatomical organization 2010May10 ； 5(5) ： e10550.一文提出了小体积培养方法。 同样 是利用 3.5cm 培养皿， 改进之处在于利用孔底面积 1 平方厘米的硅胶圈和 22mmX22mm 的玻 璃片组装培养孔， 将胚胎肾脏直接培养在玻璃片上， 加入 85ul 体积培养基培养， 硅胶圈和 培养皿之间的空隙用带抗生素的磷酸盐缓冲液填充维持培养皿湿度 ( 参见附图 3、 图 4)。 0004 但是上述两种方法均受到使用需要使用特殊材料和占用较大空间限制，。

9、 另外也未 考虑到培养基体积和成分变化对肾脏培养产生的影响， 阻碍了胚胎肾脏的体外器官培养技 术的大规模应用以及其在药物筛选中的运用。 发明内容 0005 本发明要解决的技术问题主要是现有培养方法需要特殊材料和占用空间大的缺 陷。 0006 本发明解决技术问题提供的技术方案是提供一种哺乳动物胚胎肾脏的体外器官 培养方法。该方法包括以下步骤 ： 0007 a、 在多孔培养板的培养孔中放入尺寸与之适配的承载片， 在培养孔底部构建出培 养空间 ； 0008 b、 将取得的哺乳动物胚胎肾脏放置于承载片上， 加入培养基， 使肾脏处于培养基 和空气的液 - 气交界处 ； 0009 c、 37培养箱中培养，。

10、 然后每 1 到 2 天进行培养基换液。 0010 其中， 上述方法步骤 a 所述的多孔培养板为 24 孔培养板。 0011 其中， 上述方法中在在使用的多孔培养板的各孔间隙加入湿度平衡液， 以减缓培 养基挥发。 说 明 书 CN 102391983 A CN 102391991 A2/6 页 4 0012 其中， 上述方法步骤 b 中加入培养基后调整承载片于培养孔的底部的中心， 哺乳 动物胚胎肾脏或胚胎肾脏原基位于承载片的中部。 0013 其中， 上述方法 c 步骤中所述的培养基采用半量递增的方式换液， 即每次换液时 保留上次培养基体积的一半在原培养孔中， 然后将比上次培养基体积的一半按体积。

11、分数还 多增加 6 -12的新鲜培养基加入培养孔。 0014 进行 10 天培养时， 第 1-2 天按上次培养基体积的一半加入， 第 9-10 天按上次培养 基体积的一半加入最佳。 0015 其中， 上述方法步骤 a 中所述的承载片为透明玻璃圆片。 0016 其中， 上述方法中所述湿度平衡液为无菌的磷酸盐缓冲液或蒸馏水。 0017 其中， 上述方法中所述胚胎肾脏为分离的胚胎期 10 13 天的小鼠肾脏原基。 0018 其中， 上述方法中所述的肾脏放置方式为 ： 将肾脏平放。 即输尿管走向面与承载片 平面平行的方式放置于承载片上。 0019 本发明方法的有益效果在于 ： 使用本发明方法进行胚胎肾。

12、脏的体外器官培养无需 昂贵进口滤膜或者硅胶圈等进口材料， 成本大大降低 ； 克服了目前所有方法的占用空间大 缺点， 使用本发明放在运用利用 24 孔培养板可以将每个肾脏培养时的占用面积由 38.5 平 方厘米减少到 1.5 平方厘米左右， 大大提高了空间利用率 ； 具有培养基用量少的优点， 利用 24 孔培养板时每孔只需 150ul 左右的培养基培养即可 ； 体系组装简单， 操作便捷， 只需将处 理好的承载片放入培养孔， 放置胚胎肾脏， 加入培养基培养即可， 简单易行且污染环节大大 减少， 有利于培养成功率的提高 ； 培养结果良好， 胚胎肾脏的培养时间能到 10 天以上， 可提 高到 12 天。

13、， 并可见输尿管平滑肌自主性收缩 ； 使用承载片培养导致后续操作方便， 可进行 原位杂交， 免疫荧光等后继实验操作操作。本发明方法还另外提供了一种优选的培养基后 继换液方案， 使培养效果更好， 体外器官发育更加稳定。 本发明方法能大量低成本地获得稳 定发育且便于后继操作的体外培养肾脏器官， 还能满足大规模药物筛选的需求。 附图说明 0020 图 1、 传统的胚胎肾脏体外器官培养两种方法的体系示意图之一。1、 培养基 ； 2、 聚 碳酸脂滤膜 ； 3、 . 胚胎肾脏原基 ； 4、 不锈钢网支架。 0021 图 2、 传统的胚胎肾脏体外器官培养两种方法的体系示意图之二。1、 培养基 ； 2、 聚 。

14、碳酸脂滤膜 ； 3、 . 胚胎肾脏原基 ； 4、 不锈钢网支架。 0022 图 3、 已报导的小体积胚胎肾脏体外器官培养体系 ( 培养皿 ) 示意图， 示纵剖面。 1、 培养基 ； 2、 硅胶圈 ； 3、 胚胎肾脏原基 ； 4、 22mmX22mm 玻璃片 ； 5、 1X PBS。 0023 图 4、 已报导的小体积胚胎肾脏体外器官培养体系 ( 培养皿 ) 示意图， 俯视。1、 培 养基 ； 2、 硅胶圈 ； 3、 胚胎肾脏原基 ； 4、 22mmX22mm 玻璃片 ； 5、 1X PBS。 0024 图 5、 本发明的培养方法采用的胚胎肾脏体外器官体系示意图。1、 培养基 ； 2、 承载 片。

15、 ； 3、 胚胎肾脏 ； 4、 培养孔 ； 5、 湿度平衡液， 624 孔培养板。 0025 图 6. 本发明的承载片 - 多孔平板法的胚胎肾脏体外器官培养装置 1. 培养基 ； 2. 承载片 ； 3. 胚胎肾脏 ； 0026 图 7. 本发明的承载片 - 多孔平板法的胚胎肾脏体外器官培养装置 1. 培养基 ； 2. 承载片 ； 3. 胚胎肾脏 ； 说 明 书 CN 102391983 A CN 102391991 A3/6 页 5 0027 图 8、 本发明的培养方法使用 24 孔板时， 优化的培养基换液体积方案。 0028 图 9、 本发明方法胚胎肾体外培养效果及原位杂交和免疫荧光检测。图。

16、中第一、 二 排显示的是小鼠胚胎期 12.5 天的肾脏进行培养十天的效果图， 能看得见明显的输尿管分 支及肾单位各阶段前体结果的形成。培养效果良好， 并可见输尿管自主性收缩。第三排为 分别用原位杂交 (in situ) 和免疫荧光检测肾单位标志物 PAX8 和输尿管及远端小管标志 物 E-cadherin(E 型钙粘附蛋白 ) 的表达， 黑色和白色分别显示阳性信号， 实验结果证明了 本发明方法培养的肾脏发育良好， 可应用于多种方式检测。 0029 图 10、 用现有方法培养了 10 天后免疫荧光检测的结果， 示输尿管 ( 来源于 Jamie A.Davies 在杂志 PLoS One 中发表的。

17、 A novel， low-volume method for organ culture of embryonickidneys that allows development of cortico-medullary anatomical organization 2010May 10 ； 5(5) ： e10550.)， 本发明方法 6 天培养的结果就和其 10 天的培 养结果基本一致。 0030 图 11、 用本发明方法培养得到的体外培养胚胎肾脏的 siRNA 转染效果图。该图显 示用 EGFP 绿色荧光转基因小鼠胚胎期 10.5 和 11.5 天取出的肾脏转染 CY5 红色荧光标记 。

18、的 siRNA 效果图， 第一列为镜下肾脏形态图， 第二列为绿色荧光表达图， 第三列为红色荧光 图， 两张图显示了绝大部分细胞转染进了 siRNA。 具体实施方式 0031 以下结合附图通过具体实施方式， 对本发明进行详细说明。 0032 本发明提供了一种胚胎肾脏的体外器官培养方法， 包括以下步骤 ： 0033 a、 在多孔培养板的培养孔中放入尺寸与之适配的承载片， 在培养孔底部构建出培 养空间 ； 0034 b、 将取得的哺乳动物胚胎肾脏或胚胎肾脏原基放置于承载片上， 加入培养基， 使 肾脏处于培养基和空气的气液交界面， 仅有一层薄液膜覆盖在上面， 这与现有技术的常规 方法一致 ； 即使肾脏。

19、上表面有一层液膜， 不是完全裸露于空气中。 0035 c、 37培养箱中培养， 然后每天进行培养基换液。 0036 本发明方法步骤 a 所述的多孔培养板为 24 孔培养板。 0037 本发明方法在使用的多孔培养板的各孔间隙加入湿度平衡液， 以减缓培养基挥 发。 0038 本发明方法步骤 b 中加入培养基后调整承载片于培养孔的底部的中心， 哺乳动物 胚胎肾脏或胚胎肾脏原基位于承载片的中部。 0039 本发明方法 c 步骤中所述的培养基采用半量递增的方式换液， 即每次换液时保留 上次培养基体积的一半在原培养孔中， 然后将比上次培养基体积的一半还按体积分数多增 加 6 -12的新鲜培养基加入培养孔。。

20、 0040 优选的， 第 1-2 天按上次培养基体积的一半加入 ； 进行 10 天培养时， 第 9-10 天按 上次培养基体积的一半加入最佳。 0041 本发明方法步骤 a 中所述的承载片可为透明玻璃片。承载片尺寸应小于孔径大 小， 大小为培养孔的 50-80大小， 形状匹配。最好与培养孔一样为圆形的透明玻璃圆片。 承载片一般应贴在底部。 说 明 书 CN 102391983 A CN 102391991 A4/6 页 6 0042 本发明方法中所述湿度平衡液为无菌的磷酸盐缓冲液或蒸馏水。 本发明方法中所 述胚胎肾脏为分离的胚胎期 10 13 天的小鼠肾脏原基。 0043 本发明方法中所述的肾。

21、脏放置方式为 ： 将肾脏原基平放， 即横切面放置于承载片 上。 0044 当然， 在本领域中， 本发明方法中使用的各种试剂和材料， 都应为无菌的， 操作也 应在无菌条件下进行。 0045 本发明方法使用的承载片可以是各种材质的适于组织细胞培养的薄片， 最常用和 最优的是透明玻璃圆片。 承载片使用前应进行充分的清洗和灭菌处理， 在需要的情况下， 可 以用合适的基质预处理， 如多聚赖氨酸， 明胶或者胶原等。 0046 本发明方法中使用的多孔培养板可以是常规的能应用于细胞组织培养的普通 24 孔板， 其孔最好是底面积在 1 3 平方厘米的平底圆孔。最常见的是标准的 24 孔平底细胞 培养板， 材质是。

22、玻璃或者塑料均可。 0047 本发明方法中使用的湿度平衡液必须无菌， 无毒。最好用无菌的磷酸盐缓冲液或 蒸馏水， 根据使用多孔培养板确定用量， 一般的标准 24 孔平底细胞培养板使用的湿度平衡 液体积应大于 200ul， 最好是 500ul。 0048 本发明方法中使用的胚胎肾脏一般为实验用的小鼠的胚胎。 实验小鼠胚胎肾脏可 以为胚胎期 10 13 天的肾脏原基 ( 肾脏原基是本领域就发育早期的胚胎肾脏的一种通用 叫法 )。而每个承载片上可放置 1 4 个胚胎肾脏， 即 1 个孔中最多可培养 4 个小鼠胚胎肾 脏。胚胎肾脏最好平放， 即按横切面水平放置于承载片上以便肾脏原基能发育成形态良好 的。

23、肾脏。在实际操作过程中， 只要输尿管还在， 放下去就是平放的。 0049 本发明方法中使用培养基可为本领域通用的各种细胞培养基， 比如 dulbecco s modifiedeagle s medium(DMEM， 通用的培养基， 如商家 Invitrogen 货号 11965 的产品， 或 也可参考网上公开的 ： 记载的 DMEM(H) 细胞 培养基 ( 粉末型 ) 成分配制 ) 或者 Eagle s minimal essential medium(EMEM， 通用的培 养基， 配方公知。然后在选择的培养基中加入体积分数为 5-20的 FBS( 胎牛血清 ) 或者 F12 营养因子 (In。

24、vitrogen 公司产品， 品名 ： 营养因子混合物， 货号 ： 21700)， 一般还可添加 按终度 0.1mg/ml 添加抗生素 penicillin 或 streptomycin( 青霉素或链霉素 ) 防止污染。 0050 本发明方法中的培养条件为通用细胞培养条件。一般温度为 36 38； 最好在 37下， 体积分数为 5二氧化碳的环境中培养。 0051 本发明方法中使用的培养基可每隔 24 48 小时， 去掉旧培养基并加入等体积新 培养基继续培养。 0052 还可以采用的优选的换液方式是采用半量递增的方式换液， 即每次换液时保留上 次培养基体积的一半在原培养孔中， 然后将比上次培养基。

25、体积的一半还按体积分数多增加 6 -12的新鲜培养基加入培养孔。若用标准 24 孔平底细胞培养板时， 标准的 24 孔平底 细胞培养板时， 培养基体积可用每孔 130-170ul， 最佳的体积应为每孔 150ul。那么是换液 时将比上次培养基体积的一半多 2 10ul 的新鲜培养基加入培养孔。优选 5 10ul， 最佳 为 8ul。 0053 实施例一使用本发明方法培养 Balb/c 小鼠胚胎期 11.5 天肾脏。 0054 1、 准备承载片 ： 用直径 12mm 的玻璃圆盖片作为承载片， 购买于海门市华凯实验玻 说 明 书 CN 102391983 A CN 102391991 A5/6 页。

26、 7 璃仪器有限公司。首先， 用蒸馏水配制体积分数为 1的盐酸溶液， 在室温摇动清洗圆盖片 一个小时。用蒸馏水清洗后， 放入体积分数为 70的酒精溶液中， 摇动清洗过夜。用 10cm 玻璃平皿盛放清洗后的圆盖片， 沥干液体后放入高温蒸汽灭菌锅内， 121灭菌 20 分钟。烘 干后置于超净工作台备用。 0055 2、 组装培养装置 ： 用无菌的镊子夹取处理好的圆盖片放置于无菌的 24 孔培养板 的培养孔中中。无菌的 24 孔培养板为购置于 Costar( 康宁公司， 美国 ) 的 3524 型组织培 养板。 0056 3、 获得胚胎期11.5天小鼠肾脏 ： 以受孕Balb/c母鼠， 来源于四川大。

27、学华西医院基 因工程小鼠中心 SPF 级 ( 无特殊病原菌 ) 动物房， 阴道见栓当天为 0.5 天开始计算胚胎发 育时间， 在第 11.5 天从动物饲养房取出孕鼠。引颈法处死孕鼠后， 用酒精消毒孕鼠及解剖 器械。取出小鼠胚胎后于冰上预冷的解剖液 (1X PBS， HBSS 或者 DMEM) 中解剖， 体视镜下取 出肾脏原基， 用 200ul 吸头转移到装有培养基 (DMEM+10 FBS)1.5ml 的 EP 管中。 0057 4、 在超净工作台内， 用 200ul 的移液器转移肾脏原基到培养孔， 每孔一个。用移液 器吸走培养孔中残余培养基并加入 150ul 培养基。用酒精灯高温灭菌尖镊子，。

28、 待冷后移动 轻轻移动肾脏原基至园盖片中部， 并调整园盖片位置使得肾脏原基位于培养孔正中。培养 体系的构建参见图 5、 图 6、 图 7 的示意图。 0058 5、 小心将种好的肾脏放置于细胞培养箱于 37， 5 CO2中培养 24 小时。 0059 6、 用移液器将培养孔中培养基全部转移至对应换液孔， 再用移液器回吸 75ul 培 养基到培养孔， 并丢弃剩余培养基。 0060 7、 加入 75+5ul 的新鲜培养基到培养孔， 混匀后于细胞培养箱中培养 24 小时。 0061 8、 然后同步骤 6 和 7 进行半量递增换液 ： 留 80ul 原培养基 +80ul 新培养基。 0062 9、 每。

29、隔 24 小时换液。换液体积方案如图 8 所示。 0063 10、 培养 10 天效果 ( 附图 9)。 0064 图 9 中第一、 二排显示的是小鼠胚胎期 12.5 天的肾脏进行培养十天中每天的情 况， 能看得见明显的输尿管分支及肾单位各阶段前体结果的形成， 并可第七、 八天开始出现 输尿管平滑肌自主性收缩， 说明了输尿管感受到液体刺激进行排尿， 和生理状况一样， 说明 培养肾脏接近体内情况， 有部分生理功能。 而且的输尿管分支和肾单位还能充分的形成， 如 图9的136小时可见输尿管分支很充分， 另免疫荧光结果显示的输尿管分支也很充分， 结果 与最新报道的培养方法的十天的结果 ( 图 10)。

30、 相似， 质量相近。 0065 第三排为分别用原位杂交和免疫荧光检测肾单位标志物 PAX8 和输尿管及远端小 管标志物 E-cadherin 的表达， 黑色和白色分别显示阳性信号， 实验结果证明了本发明方法 培养的肾脏发育良好， 可应用于多种方式检测。 0066 经多次试验， 利用上述方法使用 E12.5 天的肾脏进行体外培养几乎是 100成功 率， 而 E11.5 天则有 75左右的成功率， 一个孔可培养培养 1 个到 4 个肾脏， 一般采用 1 个 孔1个的方式， 24孔平板所有孔用完至少可培养24个， 最佳是使用8个内圈的孔进行培养。 24 孔板 (13cmX8.5cmX2.5cm 养 。

31、24 个即约 11 立方厘米空间 1 个肾脏， 而现有技术最小是一 般 3.5cmX3.5cmX2.5cm 养一个， 即 31 立方厘米空间 1 个肾脏， 另外本方案 24 个肾脏在一 起可联系同环境同时操作， 生长一致性更好， 也更便于实现大规模药物筛选。 0067 实施例二本发明培养方法得到的胚胎肾脏的转染 说 明 书 CN 102391983 A CN 102391991 A6/6 页 8 0068 1、 准备承载片 ： 直径 12mm 的玻璃圆盖片作承载片， 购买于海门市华凯实验玻璃仪 器有限公司。首先， 用蒸馏水配制体积分数为 1的盐酸溶液， 在室温摇动清洗圆盖片一个 小时。用蒸馏水。

32、清洗后， 放入体积分数为 70的酒精溶液中， 摇动清洗过夜。用 10cm 玻璃 平皿盛放清洗后的圆盖片， 沥干液体后放入高温蒸汽灭菌锅内， 121灭菌 20 分钟。烘干后 置于超净工作台备用。 0069 2、 组装培养装置 ： 用无菌的镊子夹取处理好的圆盖片放置于无菌的 24 孔培养板 中。无菌的 24 孔培养板为购置于 Costar 公司的 3524 型号组织培养板。 0070 3、 获得胚胎期 11.5 天小鼠肾脏 ： 以 EGFP 转基因母鼠 ( 需要简要说明该鼠的来 源。( 增强的绿色荧光蛋白 EGFP 转基因小鼠由美国 The Jackson Laboratory 构建， 货号 ： 。

33、003115) 阴道见栓当天为 0.5 天开始计算胚胎发育时间， 在第 11.5 天从动物饲养房取出孕 鼠。引颈法处死孕鼠后， 用酒精消毒孕鼠及解剖器械。取出小鼠胚胎后于冰上预冷的解剖 液 (1X PBS， HBSS 或者 DMEM) 中解剖， 体视镜下取出肾脏原基， 用 200ul 吸头转移到装有培 养基 (DMEM+10 FBS)1.5ml 的 EP 管中。 0071 4、 用 49ul 培养基转移肾脏到 200ul PCR 管中， 在避强光环境下加入 1ul 20umol/ L修饰后的Cy5-siRNA(siRNA序列为GCUCUUACGAUGAUA， 由广州锐博生物合成并提供商品化 修。

34、饰 )。于细胞培养箱中培养 6 小时。 0072 5、 在超净工作台内， 用 200ul 的移液器转移肾脏原基到培养孔， 每孔一个。用移液 器吸走残余培养基并加入 150ul 培养基。用酒精灯高温灭菌尖镊子， 待冷后移动轻轻移动 肾脏原基至园盖片中部， 并调整园盖片位置使得肾脏原基位于培养孔正中。 0073 6、 小心将种好的肾脏放置于细胞培养箱于 37， 5 CO2中培养 1 天后， 用倒置荧 光显微镜观察并拍照， 可检测很高的转染效率。效果见图 11。 说 明 书 CN 102391983 A CN 102391991 A1/1 页 9 0001 序 列 表 CN 102391983 A 。

35、CN 102391991 A1/6 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102391983 A CN 102391991 A2/6 页 11 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102391983 A CN 102391991 A3/6 页 12 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102391983 A CN 102391991 A4/6 页 13 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 102391983 A CN 102391991 A5/6 页 14 图 9 图 10 说 明 书 附 图 CN 102391983 A CN 102391991 A6/6 页 15 图 11 说 明 书 附 图 CN 102391983 A 。