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1、(10)申请公布号 CN 102392003 A (43)申请公布日 2012.03.28 CN 102392003 A *CN102392003A* (21)申请号 201110329338.8 (22)申请日 2011.10.26 C12N 9/42(2006.01) C12N 9/26(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (71)申请人 深圳大学 地址 518060 广东省深圳市南山区南海大道 3688 号 (72)发明人 邢苗 刘森林 陈伟钊 杜坤 (74)专利代理机构 广州市华学知识产权代理有 限公司 44245 代理人 裘晖 (54) 发明名称 EDTA在提高大。
2、肠杆菌重组蛋白胞外分泌量和 表达量中的应用 (57) 摘要 本发明公开了 EDTA 在提高大肠杆菌重组蛋 白胞外分泌量和表达量中的应用。本发明发明人 发现 EDTA 具有提高大肠杆菌重组蛋白胞外分泌 量和表达量的性能， 而且与 EGTA、 瓜氨酸、 盐酸胍 和 Triton X-100 相比， EDTA 提高大肠杆菌重组 蛋白胞外分泌量和表达量的效果最佳。本发明所 提供的应用方法中， 是在用诱导剂对含有重组载 体的大肠杆菌诱导培养后， 再加入 EDTA 或是加入 EDTA 和溶菌酶继续培养即可。本发明所提供的 EDTA 在提高大肠杆菌重组蛋白胞外分泌量和表 达量中的应用方法， 操作简单， 成本。
3、低廉， 而且能 较好地将分子量较大、 分泌较难的蛋白的胞外分 泌量和表达量提高。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 9 页 序列表 4 页 附图 6 页 CN 102392011 A1/1 页 2 1.EDTA 在提高大肠杆菌重组蛋白胞外分泌量和表达量中的应用。 2. 根据权利要求 1 所述的 EDTA 在提高大肠杆菌重组蛋白胞外分泌量和表达量中的 应用， 其特征在于包含以下步骤 ： 用诱导剂对含有重组载体的大肠杆菌进行诱导培养， 加入 EDTA 或是加入 EDTA 和溶菌酶继续培养 ； 所述的大肠杆菌指的是用于作为。
4、宿主菌的大肠杆 菌。 3. 根据权利要求 2 所述的 EDTA 在提高大肠杆菌重组蛋白胞外分泌量和表达量中的应 用， 其特征在于 ： 所述的重组载体为将核苷酸序列如 SEQ ID ： No.1 所示的碱性内切葡聚糖 酶基因 III-3-a 克隆到原核表达载体 pET-28a(+) 中得到的重组载体 pET-28a-III-3-a 或 是将核苷酸序列如 SEQ ID ： No.2 所示的淀粉酶基因克隆到原核表达载体 pET-28a(+) 中得 到的重组载体 pET-28a-III-A。 4. 根据权利要求 2 所述的 EDTA 在提高大肠杆菌重组蛋白胞外分泌量和表达量中的应 用， 其特征在于 ：。
5、 所述的诱导剂为 IPTG ； 所述的诱导培养的条件为 23 37培养。 5. 根据权利要求 4 所述的 EDTA 在提高大肠杆菌重组蛋白胞外分泌量和表达量中的应 用， 其特征在于 ： 所述的 IPTG 的使用条件为含有重组载体的大肠杆菌处于对数生长期时加入 IPTG， IPTG 的终浓度为 0.2 1.0mmol/L。 6. 根据权利要求 2 所述的 EDTA 在提高大肠杆菌重组蛋白胞外分泌量和表达量中的应 用， 其特征在于 ： 所述的大肠杆菌为大肠杆菌 E.coli BL21Star(DE3)。 7. 根据权利要求 2 所述的 EDTA 在提高大肠杆菌重组蛋白胞外分泌量和表达量中的应 用，。
6、 其特征在于 ： 所述的 EDTA 的加入时间为含有重组载体的大肠杆菌处于对数生长期 ； 所述的 EDTA 和溶菌酶的加入时间为含有重组载体的大肠杆菌处于对数生长期。 8. 根据权利要求 1 7 任一项所述的 EDTA 在提高大肠杆菌重组蛋白胞外分泌量和表 达量中的应用， 其特征在于包含以下步骤 ： (1) 将含有重组载体的大肠杆菌培养至 OD600为 0.6 时， 加入 IPTG 于 23、 250r/min 诱 导培养， IPTG 的终浓度为 0.2mmol/L ； (2) 诱导培养至第 4 20h 时加入 EDTA， 或是加入 EDTA 和溶菌酶 ； EDTA 的终浓度为质 量体积比 0。
7、.2 1， 溶菌酶的终浓度为 0.05 0.25mg/L ； (3) 继续培养至菌体处于稳定期后期， 收集上清。 9. 根据权利要求 8 所述的 EDTA 在提高大肠杆菌重组蛋白胞外分泌量和表达量中的 应用， 其特征在于 ： 步骤 (2) 为 ： 诱导培养至第 12h 时加入 EDTA， 或是加入 EDTA 和溶菌酶 ； EDTA 的终浓度为质量体积比 5， 溶菌酶的终浓度为 0.15mg/L。 10.根据权利要求8所述的EDTA在提高大肠杆菌重组蛋白胞外分泌量和表达量中的应 用， 其特征在于 ： 步骤 (3) 为 ： 继续培养 18 25 小时， 收集上清。 权 利 要 求 书 CN 102。
8、392003 A CN 102392011 A1/9 页 3 EDTA 在提高大肠杆菌重组蛋白胞外分泌量和表达量中的 应用 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 特别涉及一种 EDTA 在提高大肠杆菌重组蛋白胞外分 泌量和表达量中的应用。 背景技术 0002 大肠杆菌表达系统是现今实验室应用甚至工业生产应用最早、 最为广泛的表达系 统。其本身天然的特点赋予其巨大的应用价值， 这些特点包括 ： (1) 其全基因组测序完成， 遗传背景非常详细 ； (2) 基因克隆表达系统成熟完善 ； (3) 繁殖迅速、 培养简单、 操作方便、 遗传稳定 ； (4) 细胞本身表达蛋白组分少、 表达量低， 易。
9、于纯化回收外源重组蛋白 ； (5) 被美 国 FDA 批准为安全的基因工程受体生物。 0003 大肠杆菌由于其特殊的细胞壁结构所形成的渗透屏障， 严重阻碍了它的工业生产 应用， 主要的限制因素有 ： (1) 外源重组蛋白只能在胞内表达， 无法分泌到细胞外 ； (2) 外 源重组蛋白在胞内表达过程中易形成无活性的包涵体， 严重降低重组蛋白的活性质量 ； (3) 外源重组蛋白表达量总体偏低。因此， 实现大肠杆菌表达系统的胞外分泌同时提高其表达 水平具有重要的工业应用价值。 发明内容 0004 本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足， 提供一种 EDTA( 乙二胺四乙酸 ) 在提高大肠杆菌重组蛋白。
10、胞外分泌量和表达量中的应用。 0005 本发明的目的通过下述技术方案实现 ： 一种 EDTA 在提高大肠杆菌重组蛋白胞外 分泌量和表达量中的应用， 是基于发现 EDTA 具有提高大肠杆菌重组蛋白胞外分泌量和表 达量的性能所得到的技术方案 ； 0006 所述的 EDTA 在提高大肠杆菌重组蛋白胞外分泌量和表达量中的应用， 具体包含 以下步骤 ： 用诱导剂对含有重组载体的大肠杆菌进行诱导培养， 加入EDTA或是加入EDTA和 溶菌酶继续培养即可 ； 0007 所述的重组载体优选为将核苷酸序列如下所示的碱性内切葡聚糖酶基因 III-3-a 克隆到原核表达载体 pET-28a(+) 中得到的重组载体 。
11、pET-28a-III-3-a 或是将 核苷酸序列如下所示的淀粉酶基因克隆到原核表达载体 pET-28a(+) 中得到的重组载体 pET-28a-III-A ； 0008 碱性内切葡聚糖酶基因 III-3-a 的序列如下所示 ： 0009 GAAGGAAACACTCGTGAAGACAATTTTAATCATTTATTAGGTAATGACAATGTTAAGCGCCCTTCCGAG GCTGGCGCATTACAATTACAAGAAGTCGATGGACAAATGACATTAGTAGATCAAGATGGAGAAAAAATTCAATTACG TGGAATGAGTACACACGGATTACAATGGTTTC。
12、CTGAGATTTTAAATGATAACGCATACAAAGCTCTTACTAACGATT GGGAATCAAATATGATTCGTCTAGCTATGTATGTCGGTGAAAATGGCTATGCTTCAAATCCAGATTTAATTAAAAGC AGAGTCATTAAAGGAATAGATCTTGCTATTGAAAATGACATGTATGTCATTGTTGACTGGCATGTACATGCACCTGG 说 明 书 CN 102392003 A CN 102392011 A2/9 页 4 TGATCCTAGAGATCCGGTTTAYGCWGGTGCAGAAGATTTCTTTAGAGAAATTGCA。
13、GCATTATATCCTAACAATCCAC ACATTATTTATGAGTTAGCGAATGAACCAAGTAGTAATAATAATGGTGGAGCAGGGATTCCGAATAATGAAGAAGGT TGGAATGCAGTAAAAGAATACGCTGATCCAATTGTAGAAATGTTACGTGAAAGTGGTAACGCAGATGACAATATCAT CATTGTGGGGAGTCCTAACTGGAGTCAGCGTCCTGACTTAGCAGCTGATAATCCAATTGATGACCACCATACAATGT ACACAGTTCATTTCTATACAGGTTCACATGCAGCTTCAACGGA。
14、GAGTTATCCGCCTGAAACTCCTAACTCTGAAAGA GGAAACGTAATGAGTAACACTCGTTATGCGTTAGAGAACGGAGTAGCGGTATTTGCAACAGAATGGGGAACAAGTCA AGCAAGTGGAGACGGTGGTCCTTACTTTGACGAAGCAGATGTATGGATTGAATTTTTAAATGAAAACAACATTAGCT GGGCTAACTGGTCTTTAACGAATAAAAATGAAGTGTCTGGTGCATTTACACCATTCGAGTTAGGAAAATCTAACGCA ACTAATCTTGACCCAGGTCCAGACCATGTTT。
15、GGGCACCTGAAGAGTTAAGTCTTTCTGGAGAATATGTACGTGCTCG TATTAAAGGTGTGAACTATGAGCCAATCGACCGTACTAAATACACGAAAGTACTTTGGGACTTTAATGATGGAACGA AGCAAGGATTTGGAGTGAATGGAGATTCTCCAAATAAAGAGCTTATTGCAGTTGATAATGAAAACAACACTTTGAAA ATTTCGGGGTTAGATGTAAGTAACGATGTTTCTGATGGCAACTACTGGGCTAATGCTCGTCTTTCAGCCAACGGTTG GGGGAAAAGTGTTGATATA。
16、TTAGGTGCTGAAAAACTAACTATGGATGTTATTGTTGATGAGCCGACGACGGTAGCGA TTGCTGCAATTCCACAAGGTCCATCAGCAAATTGGATTAATCCAATTTGCGCAGTTAAGGTTGAGCCAACTGATTTC GTGCCGTTTGGAGATAAGTTTAAAGCAGAATTAACTATAACTACAGCGGACTCTCCAGCGATAGAAGCGATTGCGAT GCATGCTGAAAATAACAATATGAACAACATCATTCTGTTCGTAGGAACTGATGCAGCTGACGTTATTTATTTAGATA ACATTAA。
17、AGTAATTGGAACAGAAGTTGAAATTCCAGTTGTTCATAATCCAAAAGGAGAAGCTGTCCTTCCGTCTAAT TTTGAAGACGGCACACGTCAAGGTTGGGACTGGGCTGGAGAGTCTGGTGTGAAAACAGCTTTAACCATTGAAGAAGC AAACGGTTCTAACGCGCTATCATGGGAATTTGGATACCCAGAAGTAAAACCTAGTGATAACTGGGCGACAGCTCCAC GTTTAGATTTCTGGAAATCTGACTTGGTTCGCGGTGAGAATGATTATGTAGCTTTTGACTTCTATCTAGATCC。
18、AGTT CGTGCAACAGAAGGCGCGATGAATATCAATTTAGTATTTCAGCCACCTACTAATGGATATTGGGTTCAAGCACCACA AACTTTTACGGTTGACTTTGAAGAGTTAGATCAAGCAAATCAAGTAGACGGTCTATACCATTATGAAGTAAAAATTA ATGTAAGAGATATTACAAACGTTCAAGATGACACTTTACTACGTAATATGATGATTATTTTTGCTGATGTACAAAGT GATTTTGCAGGAAGAGTATTCGTAGATAATGTTCGTTTTGAGGTTGCTGCTACTGGGCCGA。
19、TTGAGCCTGAACCAGT TGATCCTGGCGAAGAGGCGCCTCCTGTAGATGAGAAGGAAGCAGCAAAAGAAGAAAGAGAAGCAGCTAGAGGAGCGG AGAAAGAGGAAAGAGAAGCCGTGAAAGCTGAAAGAGAAGTAGCTAGAGAAGCAGCGAAAGAGGAAAGAGAAACCGCA AAAGAAGAAAAGAAAGAGGCTACGAAAAAATAA ； 0010 淀粉酶基因的序列如下所示 ： 0011 GTAAATGGCACGCTGATGCAGTATTTTGAATGGTATACGCCGAACGACGGCCAGCATTGGAAACGA。
20、TTG CAGAATGATGCGGAACATTTATCGGATATCGGAATCACTGCCGTCTGGATTCCTCCCGCATACAAAGGAACGAGCCA ATCCGATAACGGATACGGACCTTATGATTTGTATGATTTAGGAGAATTCCAGCAAAAAGGGACGGTCAGAACGAAAT ACGGCACAAAATCAGAGCTTCAAGATGCGATCGGCTCACTGCATTCCCGGAACGTCCAAGTATACGGAGATGTGGTT TTGAATCATAAGGCTGGTGCTGATGCAACAGAAGATGTAACTGCCGTCGAAGTCAATCCGGC。
21、CAATAGAAATCAGGA AACTTCGGGGGAATATCAAATCAAAGCGTGGACGGATTTTCGTTTTCCGGGCCGTGGAAACACGTACAGTGATTTTA AATGGCATTGGTATCATTTCGACGGAGCGGACTGGGATGAATCCCGGAAGATCAGCCGCATCTTTAAGTTTCGTGGG GAAGGAAAAGCGTGGGATTGGGAAGTATCAAGTGAAAACGGCAACTATGACTATTTAATGTATGCTGATGTTGACTA CGACCACCCTGATGTCGTGGCAGAGACAAAAAAATGGGGTATCTGGTATG。
22、CGAATGAACTGTCATTAGACGGCTTCC GTATTGATGCCGCCAAACATATTAAATTTTCATTTCTGCGTGATTGGGTTCAGGCGGTCAGACAGGCGACGGGAAAA GAAATGTTTACGGTTGCGGAGTATTGGCAGAATAATGCCGGGAAACTCGAAAACTACTTGAATAAAACAAGCTTTAA 说 明 书 CN 102392003 A CN 102392011 A3/9 页 5 TCAATCCGTGTTTGATGTTCCGCTTCATTTCAATTTACAGGCGGCTTCCTCACAAGGAGGCGGATATGATATG。
23、AGGC GTTTGCTGGACGGTACCGTTGTGTCCGAGCATCCGGAAAAGGCGGTTACATTTGTTGAAAATCATGACACACAGCCG GGACAGTCATTGGAATCGACAGTCCAAACTTGGTTTAAACCGCTTGCATACGCCTTTATTTTGACAAGAGAATCCGG TTATCCTCAGGTGTTCTATGGGGATATGTACGGGACAAAAGGGACATCGCCAAAGGAAATTCCCTCACTGAAAGATA AGATAGAGCCGATTTTAAAAGCGCGTAAGGAGTACGCATACGGGCCCCAGCACGATTATAT。
24、TGACCACCCGGATGTG ATCGGATGGACGAGGGAAGGTGACAGCTCCGCCGCCAAATCAGGTTTGGCCGCTTTAATCACGGACGGACCCGGCGG ATCAAAGCGGATGTATGCCGGCCTGAAAAATGCCGGCGAGACATGGTATGACATAACGGGCAACCGTTCAGATACTG TAAAAATCGGATCTGACGGCTGGGGAGAGTTTCATGTAAACGGAGGGTCCGTCTCCATTTATGTTCAGAAATAA ； 0012 所述的大肠杆菌通常指的是基因工程上常用于作为宿主菌的大肠杆菌， 优选为大 肠杆菌 E.co。
25、li BL21 Star(DE3) 菌株 ； 0013 所述的诱导剂优选为 IPTG( 异丙基 -D- 硫代吡喃半乳糖苷 ) ； 0014 所述的 IPTG 的使用条件优选为含有重组载体的大肠杆菌处于对数生长期时加入 IPTG， IPTG 的终浓度为 0.1 1.0mmol/L ； 0015 所述的对数生长期指的是细胞在一定的环境下经过了短暂的适应期， 进而快速生 长的时期 ； 0016 所述的 IPTG 的使用条件更优选为含有重组载体的大肠杆菌的 OD600为 0.6 时加入 IPTG， IPTG 的终浓度为 0.2mmol/L ； 0017 所述的诱导培养的条件优选为 23 30培养 ； 。
26、更优选为 23培养 ； 0018 所述的 EDTA 的加入时间为添加诱导剂后 ； 0019 所述的 EDTA 和溶菌酶的加入时间为添加诱导剂后 ； 0020 所述的 EDTA 在提高大肠杆菌重组蛋白胞外分泌量和表达量中的应用， 更优选包 含以下步骤 ： 0021 (1) 将含有重组载体的大肠杆菌培养至 OD600为 0.6 时， 加入 IPTG 于 23、 250r/ min 诱导培养， IPTG 的终浓度为 0.2mmol/L ； 0022 (2) 诱导培养至第 4 20h 时加入 EDTA， 或是加入 EDTA 和溶菌酶 ； EDTA 的终浓度 为质量体积比 0.2 1， 溶菌酶的终浓度为。
27、 0.05 0.25mg/L ； 0023 (3) 继续培养至菌体处于稳定期后期， 收集上清 ； 0024 步骤(2)更优选为 ： 诱导培养至第12h时加入EDTA， 或是加入EDTA和溶菌酶 ； EDTA 的终浓度为质量体积比 5， 溶菌酶的终浓度为 0.15mg/L ； 0025 步骤 (3) 中所述的稳定期指的是菌体的比生长速度等于零， 培养液中菌体的浓度 保持不变的阶段 ； 0026 步骤 (3) 更优选为 ： 诱导培养 18 25 小时， 收集培养上清。 0027 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果 ： 0028 (1) 本发明发明人发现 EDTA 具有提高大肠杆菌重组蛋白胞外。
28、分泌量和表达量的 性能， 而且与 EGTA( 乙二醇 - 双 -(2- 氨基乙醚 ) 四乙酸 )、 瓜氨酸、 盐酸胍和 Triton X-100 相比， EDTA 提高大肠杆菌重组蛋白胞外分泌量的效果最佳。 0029 (2) 本发明所提供的 EDTA 在提高大肠杆菌重组蛋白胞外分泌量和表达量中的应 用方法， 操作简单， 成本低廉。 0030 (3) 通过实验证明， 本发明所提供的应用方法能较好地将分子量较大、 分泌较难的 说 明 书 CN 102392003 A CN 102392011 A4/9 页 6 蛋白的胞外分泌量和表达量提高， 以碱性内切葡聚糖酶基因 III-3-a 为例， 其包括 。
29、2412 个 核苷酸， 理论分子量 (MWt) 为 90kD 左右， 是分子量较大、 分泌较难的蛋白， 根据数据比对可 以发现本发明让碱性内切葡聚糖酶的分泌量从 10.9提升到 66.3， 细胞表达重组蛋白 总量 ( 表达量 ) 提高了 80以上， 在此方法下， 细胞外重组蛋白分泌量高于不用 EDTA 和溶 菌酶的表达重组蛋白总量， 效果十分显著。因此， 本发明对其他分子量很大， 表达分泌较难 的外源蛋白有很好的参考价值， 对分子量更小的蛋白有更好的参照价值。 附图说明 0031 图 1 是 pET-28a(+) 表达载体图。 0032 图 2 是 pET-28a(+) 表达载体多克隆位点图。。
30、 0033 图 3 是重组质粒的构建凝胶电泳图， 其中 ： 0034 泳道M为DNAmaker ； 泳道1为Bacillus sp.III-3基因组 ； 泳道2为基因III-3-a ； 泳道 3 为重组质粒 pET-28a-III-3-a ； 泳道 4 为 EcoR I 和 HindIII 双酶切的重组质粒 pET-28a-I-1-a 酶切图。 0035 图 4 是重组大肠杆菌诱导温度对总酶活的影响图。 0036 图 5 是重组大肠杆菌 IPTG 浓度对酶活的影响图。 0037 图 6 是 EDTA 加入时间对胞外酶活的影响图。 0038 图 7 是同时加入 EDTA 和溶菌酶对表达量的影响图。
31、。 0039 图 8 是同时加入 EDTA 和溶菌酶对重组大肠杆菌生长趋势的影响图。 0040 图 9 是 EDTA 和溶菌酶对胞外重组蛋白的 SDS-PAGE 电泳图， 其中 ： 0041 泳道 M 为 protein maker ； 泳道 1 为培养 E.coli BL21 的上清液 ； 泳道 2 为培养 重组菌 E.coli III-3-a 的上清液 ； 泳道 3 为加入 0.15mg/mL 溶菌酶后培养重组菌 E.coli III-I-1-a 的上清液 ； 泳道 4 为加入 0.5 EDTA 后培养重组菌 E.coli III-I-1-a 的上清 液 ； 泳道 5 为加入 0.5 ED。
32、TA 和 0.15mg/mL 溶菌酶后培养重组菌 E.coli III-I-1-a 的上 清液。 0042 图 10 是溶菌酶加入时间对胞外酶活的影响图。 0043 图 11 是加入 EDTA 和溶菌酶后不同诱导时间的培养液的 SDS-PAGE 电泳图， 其中 ： 泳道M为protein maker ； 泳道1-7分别为诱导培养12、 14、 16、 18、 20、 22、 24小时加入0.5 EDTA 和 0.15mg/mL 溶菌酶后的上清液。 0044 图 12 是加入 EDTA 对淀粉酶分泌量的影响图。 具体实施方式 0045 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述， 但本发明的。
33、实施方式不限 于此。 0046 实施例 1 0047 ( 一 ) 材料 0048 1、 菌株和质粒 0049 芽孢杆菌 Bacillus sp.III-3( 保藏号 ： CGMCC No.2138， 保藏日 ： 2007 年 8 月 22 日， 已在专利号 ： 200710030787.6、 名称 ： 一种嗜碱芽孢杆菌及其产生的内切葡聚糖酶和应 说 明 书 CN 102392003 A CN 102392011 A5/9 页 7 用中公布 ) 作为碱性纤维素酶基因的原始菌， E.coli Top10(Invitrogen 公司 ) 用于质粒 的维护和操作， E.coli BL21Star(DE。
34、3)(Invitrogen 公司 ) 作为表达宿主菌。表达质粒为 pET-28a(+)(Invitrogen 公司， 其质粒图谱如图 1 所示， 多克隆位点图如图 2 所示 )。 0050 2、 培养基 0051 每升培养基中含有 ： 10g 复合蛋白胨， 5g 酵母粉， 5NaCl， pH 值为 7。 0052 3、 仪器 0053 MyCyclerTM thermal cycler PCR 仪、 DNA 及蛋白电泳系统为 Bio-rad 公司产品 ； 分光光度计及微量分光光度计为 Pharmacia Biotech 公司产品 ； Thermomixer comfort 温 控振荡仪、 移液。
35、枪、 台式离心机为 Eppendorf 公司产品 ； 恒温摇床及恒温水浴锅为 WAGEN 公 司产品 ； 匀浆机、 低温高速离心机为 BECKMAN 和 Sigma 公司产品 ； Dolphin-DOC 成像系统为 美国 WEALTEC 公司产品。 0054 ( 二 ) 实验方法 0055 1、 重组大肠杆菌的构建 0056 芽孢杆菌Bacillus sp.III-3基因组的获得方法参照omega基因提取试剂盒说明 书 ； DNA 限制性酶切、 连接、 PCR 扩增均参照 Takera 试剂说明书 ； 用于扩增碱性纤维素酶基 因 III-3-a 的引物 ( 上海生工合成 ) 为 ： 0057 。
36、上游引物 (EcoR I) ： 5 -CCGggatccGAAGGAAACACTCGTGAAGAC-3 0058 下游引物 (HindIII) ： 5 -CCCacgcgtTTATTTTTTCGTAGCCTCTTTC-3 ； 0059 PCR 产物和表达质粒 pET-28a(+) 经双酶切后连接转化 E.coli Top10 获得重组质 粒 pET-28a-III-3-a， 转化 E.coli BL21Star(DE3)， 经菌液 PCR 和测序， 检验获取重组大肠 杆菌 E.coli III-3-a。 0060 2、 碱性纤维素酶活力的测定 0061 用1mL pH 8.0的Tris-HCl。
37、缓冲液(0.01mol/L)制备的1(质量百分比)CMC-Na 溶液， 加入 100L 经适当稀释的酶液， 40反应 30min， 加入 1mL DNS(3， 5- 二硝基水杨酸 ) 溶液 (DNS 溶液的浓度为 0.63 ) 沸水浴 10 分钟， 再加入 2mL 蒸馏水于 540nm 测定还原糖， 并扣除空白试验测定值。将上述条件下每小时由底物产生 1mg 葡萄糖所需的酶量定义为一 个酶活力国际单位， 用 U/mL 表示， 葡糖糖浓度用 DNS 法测定。 0062 3、 SDS-PAGE 0063 SDS-PAGE 根据 Sambrook 等的方法进行。 0064 4、 发酵温度对酶活的影响。
38、 0065 将过夜培养的菌种 500 微升加到 50 毫升 LB 培养基中， 待 OD600为 0.6 时加入终浓 度为 1mmol/L 的诱导物 IPTG， 分别置于 23、 30、 37、 250r/min 培养， 诱导培养 0、 2、 4、 8、 12、 16、 20 小时后测总酶活。 0066 5、 IPTG 浓度对酶活的影响 0067 将过夜培养的菌种 500 微升加到 50 毫升 LB 培养基中， 待 OD600为 0.6 时加入终浓 度为0.1、 0.2、 0.4、 0.8、 1.2mmol/L的诱导物IPTG， 置于23250r/min培养， 诱导培养0、 2、 4、 8、 1。
39、2、 16、 20 小时后测总酶活。 0068 6、 诱导时菌体浓度对酶活的影响 0069 将过夜培养的菌种 500 微升加到 50 毫升 LB 培养基中， 待 OD600为 0.4、 0.6、 0.8、 说 明 书 CN 102392003 A CN 102392011 A6/9 页 8 1.0 时加入终浓度为 0.2mmol/L 的诱导物 IPTG， 置于 23 250r/min 培养， 诱导培养 0、 2、 4、 8、 12、 16、 20 小时后测总酶活 . 0070 7、 不同化合物对酶活的影响 0071 将过夜培养菌种 500 微升加到 50 毫升 LB 培养基中， 待 OD600。
40、为 0.6 时加入终浓度 为 0.2mmol/L 的诱导物 IPTG， 在 23、 250r/min 进行诱导培养， 诱导培养 12 个小时后加入 培养基终浓度分别为0、 0.2、 0.5、 1.0、 1.5、 2.0(g/ml)的EDTA、 EGTA、 瓜氨酸、 盐 酸胍、 Triton X-100， 诱导培养 16 和 20 个小时后用培养基上清液测细胞外酶活。 0072 8、 EDTA 加入时间对酶活的影响 0073 将过夜培养菌种 500 微升加到 50 毫升 LB 培养基中， 待 OD600为 0.6 时加入终浓度 为0.2mmol/L的诱导物IPTG， 在23、 250r/min进。
41、行诱导培养， 诱导培养4、 8、 12、 16个小时 后加入培养基终浓度分别为0.5的EDTA， 诱导培养20个小时后用培养基上清液测细胞外 酶活。 0074 9、 溶菌酶及 EDTA 和溶菌酶对胞外酶活的影响 0075 将过夜培养菌种 500 微升加到 50 毫升 LB 培养基中， 待 OD600为 0.6 时加入终浓 度为 0.2mmol/L 的诱导物 IPTG， 在 23、 250r/min 进行诱导培养， 诱导培养 12 个小时后加 入培养基终浓度分别为 0 和 0.5 (g/ml) 的 EDTA， 再同时分别加入培养基终浓度为 0.05、 0.1、 0.15、 0.2、 0.25、 。
42、0.3mg/mL 的溶菌酶， 诱导培养 14、 16、 18、 20、 22 小时后用培养基上清 液测细胞外酶活。 0076 10、 溶菌酶及 EDTA 和溶菌酶对重组大肠杆菌生长趋势的影响 0077 将过夜培养菌种 500 微升加到 50 毫升 LB 培养基中， 待 OD600为 0.6 时加入终浓 度为 0.2mmol/L 的诱导物 IPTG， 在 23、 250r/min 进行诱导培养， 诱导培养 12 个小时后加 入培养基终浓度分别为 0 和 0.5 (g/ml) 的 EDTA， 再同时分别加入培养基终浓度为 0.05、 0.1、 0.15、 0.2、 0.25、 0.3mg/mL 的。
43、溶菌酶， 诱导培养 12、 14、 16、 18、 20、 22 小时后取 0.5mL 菌 液稀释 5 倍于 600nm 测吸光值。 0078 11、 溶菌酶加入时间对酶活的影响 0079 将过夜培养菌种 500 微升加到 50 毫升 LB 培养基中， 待 OD600为 0.6 时加入终浓度 为 0.2mmol/L 的诱导物 IPTG， 在 23、 250r/min 进行诱导培养， 诱导培养 12 个小时后加入 培养基终浓度分别为 0 和 0.5 (g/ml) 的 EDTA， 再分别在诱导培养 12、 14、 16、 18、 20 小时 后加入培养基终浓度为0.15mg/mL的溶菌酶， 诱导培。
44、养22小时后用培养基上清液测细胞外 酶活。 0080 12、 EDTA 和溶菌酶对细胞酶活的影响 0081 将过夜培养菌种 500 微升加到 50 毫升 LB 培养基中， 待 OD600为 0.6 时加入终浓度 为 0.2mmol/L 的诱导物 IPTG， 在 23、 250r/min 进行诱导培养， 诱导培养 12 个小时后加入 培养基终浓度分别为0和0.5的EDTA和0.15mg/mL的溶菌酶， 诱导培养20小时后用培养 基上清液测细胞外酶活， 同时离心去除上清液， 加 pH 为 9 的 Tris-HCl 缓冲溶液， 再检测细 胞内酶活。 0082 ( 三 ) 实验结果 0083 1、 重。
45、组大肠杆菌的构建 0084 以芽孢杆菌Bacillus sp.III-3基因组为模板PCR获得2412bp碱性纤维素酶基因 说 明 书 CN 102392003 A CN 102392011 A7/9 页 9 III-3-a(核苷酸序列如SEQ ID ： NO.1所示)， 用EcoR I和HindIII双酶切基因III-3-a与质 粒 pET-28a(+)， 再连接获得表达质粒， 经转化、 检测获得重组大肠杆菌 E.coli III-3-a( 结 果如图 3 所示 )。 0085 2、 发酵温度对酶活的影响 0086 经测定， 重组大肠杆菌 E.coli III-3-a 在 23培养时酶活力最。
46、高， 结果如图 4 所 示。 0087 3、 IPTG 浓度对酶活的影响 0088 经测定， IPTG 培养基终浓度为 0.2mmol/L 时重组大肠杆菌 E.coli III-3-a 酶活 力最高， 结果如图 5 所示。 0089 4、 不同化合物对酶活的影响 0090 分别向培养基中加入适量五种典型的化合物， 增强大肠杆菌的膜通透性， 使目的 蛋白分泌到培养基。经测定， EDTA 在五种化合物中效果最好， 在诱导培养 12 小时后加入培 养基终浓度为 0.5的 EDTA 能使重组大肠杆菌 E.coli III-3-a 胞外原始酶活从 2.3U/mL 提高到 17.4U/mL， 结果如表 1。
47、 所示。 0091 表 1 0092 0093 0094 6、 EDTA 加入时间对酶活的影响 0095 在已知 EDTA 的作用效果最好的条件下， 在诱导培养后 4、 8、 12、 16、 20 小时后加入 培养基终浓度为 0.5的 EDTA， 诱导培养 22 小时后检测培养基外碱性纤维素酶酶活， 发现 在诱导培养 12 个小时后， 重组大肠杆菌 E.coli III-3-a 细胞外酶活力最高， 为 17.4U/mL， 结果如图 6 所示。 0096 7、 溶菌酶及 EDTA 和溶菌酶对重组大肠杆菌生长趋势及其酶活的影响 0097 有研究表明 EDTA 只对大肠杆菌细胞壁有干扰而对细胞膜肽聚。
48、糖层无任何作用， 而溶菌酶正好相反， 所以现结合两者同时作用于重组大肠杆菌， 希望能让重组菌细胞通透 性获得更大的提升， 检测对其生长趋势和产酶的影响。 经检测 ： 单独添加适量溶菌酶的条件 下， 并不能提高重组大肠杆菌 E.coli III-3-a 胞外酶活， 但在加有培养基终浓度为 0.5 的EDTA的条件下再添加适量溶菌酶， 比单独添加EDTA时细胞胞外酶活更高， 能从17.4U/mL 提高到26U/mL以上。 同时， 单独加溶菌酶对大肠杆菌的生长无影响， 培养基终浓度为0.5 的 EDTA 会降低大肠杆菌的密度， 但不会抑制生长， 培养基终浓度为 0.5的 EDTA 和大于或 等于 0。
49、.2mg/mL 的溶菌酶则会抑制大肠杆菌的生长， 所以最佳搭配条件为 ： 培养基终浓度为 说 明 书 CN 102392003 A CN 102392011 A8/9 页 10 0.5的 EDTA 和 0.15mg/mL 的溶菌酶， 结果如图 7、 图 8、 图 9 所示。 0098 8、 溶菌酶加入时间对酶活的影响 0099 在诱导培养后 12 小时后加入培养基终浓度为 0.5的 EDTA， 诱导培养 12、 14、 16、 18、 20 小时后分别加入培养基终浓度为 0.15mg/mL 的溶菌酶， 诱导培养 22 小时后检测培养 基外碱性纤维素酶酶活， 发现在诱导培养12个小时后， 加入EDTA与溶菌酶细胞外酶活力最 高。然后在已知最优条件下分别在诱导培养 12、 14、 16、 18、 20、 22、 24 小时取样测胞外酶活， 发现在诱导培养22小时后重组大肠杆菌E.coli III-3-a表达量最高， 酶活力达26.5U/mL， 结果如图 10 和图 11 所示。 0100 9、 EDTA 和溶菌酶对细胞总酶活的影响 0101 经检测， 在重组大肠杆菌 E.coli III-3-a 对数生长期中前期 (OD660 为 0.4 1.0) 加入诱导剂 IPTG， 然后在对生长期中期 (OD660 为 1.0 3.5) 加入。