毕赤酵母制备人白细胞介素32的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102392043 A (43)申请公布日 2012.03.28 CN 102392043 A *CN102392043A* (21)申请号 201110413360.0 (22)申请日 2011.12.13 C12N 15/81(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C12P 21/02(2006.01) C12R 1/84(2006.01) (71)申请人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市蠡湖大道 1800 号 (72)发明人 陈伟 郑海军 来丽丽 郁心 邬敏辰 吴静 (54) 发明名称 毕赤酵母制备人白细胞介素 32 的方法 (57)。

2、 摘要 本发明提供了一种重组人白细胞介素 32 的制备方法及表达重组 hIL-32 的毕赤酵母工 程菌。本发明的具体制备方法包括以下步骤 ： 1) 人工合成引物 ； 2) 从健康人外周血单个核细胞经 反转录 PCR 得到 hIL-32 的编码基因 ； 3) 构建 含有 hIL-32 编码基因的重组真核表达载体， 融 合于毕赤酵母表达调控元件获得重组毕赤酵母工 程菌 ； 4) 培养重组毕赤酵母工程菌， 于培养液添 加甲醇诱导毕赤酵母工程菌表达重组 hIL-32 ； 5) 采用离子交换层析和分子筛层析从培养液上 清纯化重组 hIL-32。本发明构建的重组毕赤酵 母工程菌可进行高密度培养并且分泌型表。

3、达重组 hIL-32， 适用于工业化制备重组人白细胞介素 32。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 序列表 2 页 附图 1 页 CN 102392051 A1/1 页 2 1. 一种人白细胞介素 32(hIL-32) 的重组真核表达载体， 其特征在于， 所述的重组 真核表达载体中插入了 hIL-32 的编码基因。 2.如权利要求1所述的重组真核表达载体中的hIL-32的编码基因， 其DNA的核苷酸 序列对应于序列表中的 SEQ IDNO ： 1。 3.如权利要求1所述的重组真核表达载体中的hIL-32的编码。

4、基因， 其编码产物的氨 基酸序列对应于序列表中的 SEQ ID NO ： 2。 4. 一种重组毕赤酵母工程菌， 其特征在于， 所述的重组毕赤酵母的染色体中整合有权 利要求 1 所述的 hIL-32 的编码基因， 并且分泌表达重组 hIL-32 至培养液中。 5. 一种制备重组 hIL-32 的方法， 其特征在于， 包括步骤 ： (1) 用适当的培养液， 培养权利要求 4 所述的重组毕赤酵母工程菌 ； (2) 在培养液中添加适当的诱导剂， 诱导重组毕赤酵母工程菌分泌表达重组 hIL-32 ； (3) 从培养液中分离纯化出重组毕赤酵母分泌表达的重组 hIL-32。 6. 如权利要求 5 所述的方法。

5、， 其特征在于， 步骤 (1) 所用的培养液为 BMGY 培养液和 BMMY培养液 ； 步骤(2)所用的诱导剂为甲醇， 添加甲醇的终浓度为培养液体积的0.51； 步骤 (3) 所用的分离纯化重组 hIL-32 的方法为先用弱阴离子型离子交换层析分离培养 液中的重组 hIL-32， 再用凝胶过滤层析得到纯化的重组 hIL-32。 权 利 要 求 书 CN 102392043 A CN 102392051 A1/3 页 3 毕赤酵母制备人白细胞介素 32 的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种毕赤酵母制备重组人白细胞介素 32 的方法及其重组工程菌。 属于生物工程领域。 背景技术 0002 人。

6、白细胞介素 32(human interleukin 32， hIL-32) 是近年新发现的一种细胞 因子， 其生物学活性主要表现为促炎症性细胞因子的特点， 在多种自身免疫性疾病和炎症 性疾病呈高表达状态， 并与疾病的严重程度相关 (Dinarello CA， Kim SH.(2006)IL-32， a novel cytokine with a possible role in disease.Ann Rheum Dis， 65(Suppl III) ： 61-64)。hIL-32 的产生细胞有多种， 由 IL-2 活化的 NK 细胞或用丝裂原激活的 T 细胞均可 产生 IL-32， 用 I。

7、FN- 刺激单核细胞和上皮细胞也可诱导 IL-32 的产生。 0003 人 IL-32 的基因定位于 16 号染色体 (16p13.3) 上， 含有 8 个外显子， 可编码表达 IL-32 蛋白的 6 种剪接变异体 ： IL-32、 IL-32、 IL-32、 IL-32、 IL-32 和 IL-32， 目前已报告了蛋白结构的有IL-32、 IL-32、 IL-32和IL-32， 组成这4种剪接变异体 肽链的氨基酸残基数分别为 131、 188、 234 和 178 个。通过 Northern blot 实验发现， 在人 的脾、 胸腺、 白细胞、 小肠、 结肠、 前列腺、 卵巢、 睾丸均有IL。

8、-32的mRNA表达(Goda C， Kanaji T， Kanaji S， et al.(2006)Involvement of IL-32in activation-induced cell death in T cells.Int Immunol， 18(2) ： 233-240)。 0004 近年已发现， 人 IL-32 的表达与多种炎症性疾病及自身免疫性疾病相关， 在类风 湿关节炎、 肠炎、 结核病、 甲型流感、 骨髓增生异常综合征和慢性骨髓单核细胞白血球过多 症、 人体免疫缺陷症等疾病患者中， 都检测到 IL-32mRNA 的表达水平升高。 0005 鉴于 hIL-32 的多种生物。

9、学效应， 尤其是其生物学作用与炎症性疾病及自身免疫 病性疾病的相关性， 并参与细胞凋亡过程的作用， 提示 hIL-32 及其受体有可能成为炎症性 疾病及自身免疫病性疾病的治疗靶点， 而针对 hIL-32 或其受体的相关生物工程制品有可 能成为开发抗炎症药物治疗自身免疫病性疾病药物的新方向， 由此显现出 IL-32 潜在的临 床应用前景。 发明内容 0006 本发明的目的是提供一种利用酵母表达重组人白细胞介素 32(hIL-32) 的制 备方法及其酵母工程菌。 0007 本发明提供的技术方案如下 ： 0008 (1) 本发明的第一方面， 提供一种 hIL-32 的重组真核表达载体， 该载体是将 。

10、pPIC9K(Invitrogen 公司 ) 与本发明所述的 hIL-32 编码基因 (SEQ ID No ： 1) 经过重组 而获得， 该重组真核表达载体为 pPIC9K-hIL-32， 如图 1 所示。 0009 (2) 本发明的第二方面， 提供一种表达人 IL-32 的重组酵母工程菌 GS115/ hIL-32， 该工程菌是毕赤酵母GS115(Invitrogen公司)被本发明所述的重组真核表达载 说 明 书 CN 102392043 A CN 102392051 A2/3 页 4 体 pPIC9K-hIL-32 转化而获得， 而且 pPIC9K 中的信号肽基因序列与 hIL-32 的编。

11、码基 因均已整合到该工程菌的基因组中， 因此该工程菌可分泌性表达 hIL-32 至培养液中。 0010 (3) 本发明的第三方面， 提供一种制备重组 hIL-32 的方法， 该方法包括以下步 骤 ： 0011 a) 培养上述重组酵母工程菌， 于培养液中添加 0.5 1 (v/v) 的甲醇为诱导剂， 诱导重组酵母工程菌表达重组 hIL-32 ； 0012 b) 离心培养液去除菌体和不溶物， 收集培养液上清经过超滤浓缩和透析除盐处 理 ； 0013 c) 除盐后的培养上清用弱阴离子交换层析柱分离纯化培养液中的重组 hIL-32， 收集含有重组 hIL-32 的洗脱液 ； 0014 d) 将含有重组。

12、 hIL-32 的洗脱液用分子筛层析方法进一步纯化 ； 0015 e) 用 SDS-PAGE 和 Western blotting 方法分析鉴定纯化的重组 hIL-32。 附图说明 0016 图 1 为重组真核表达质粒 pPIC9K-hIL-32 的构建图谱 0017 图 2 为人 IL-32 编码基因的 PCR 扩增结果 0018 图 3 为重组真核表达质粒 pPIC9K-hIL-32 的双酶切鉴定结果 具体实施方式 0019 以下结合具体实施例， 进一步阐述本发明的操作方法， 这些实施例仅用于详细说 明本发明， 而不用于限制本发明的范围。 0020 下述实施例中， 所有 PCR 引物的合成。

13、和 DNA 序列的测定均由上海生工生物工程技 术服务有限公司完成 ； 所用的培养基如无特别说明均按毕赤酵母表达手册 (Invitrogen 公 司 ) 的配方进行配制。 0021 实施例一、 人 IL-32 编码基因的克隆 0022 1. 设计和合成 PCR 引物 0023 根据 GenBank 中的人 IL-32 基因序列和 pPIC9K 载体的多克隆位点序列， 用 Oligo 7 软件设计一对特异性引物如下 ： 0024 上游引物 ： 5 -CGGAATTCATGTGCTTCC CGAAGGTCC-3 0025 下游引物 ： 5 -ATTTTGCGGCCGC TCATTTTGAGGATTG。

14、GGGTTC-3 ； 0026 在上游引物中加入了限制性内切酶 EcoR I 识别位点 (GAATTC)， 下游引物中加入 了 Not I 位点 (GCGGCCGC)， 扩增产物的大小约 560bp。 0027 2. 人 IL-32 编码基因的克隆 0028 用 RNA 提取试剂 Trizol(BBI 公司 ) 按说明书操作， 从健康中国人外周血单个核细 胞(PBMC)提取细胞总RNA ； 取提取的总RNA 1L作为模板， 用反转录试剂盒(TaKaKa公司) 按说明书操作， 经反转录扩增得到 IL-32 前体的 cDNA ； 反转录结束后， 取反应液 5L 作 为模板， 用上述特异性引物进行 。

15、PCR 扩增 IL-32 的编码基因， 反应条件如下 ： 94 2min， 9430s6130s721min， 30个循环， 最后72延伸10min。 扩增产物经1琼脂糖 凝胶电泳分析， 结果如图2所示 ； 用EZ-10柱式DNA回收试剂(BBI公司)回收纯化约560bp 说 明 书 CN 102392043 A CN 102392051 A3/3 页 5 的目的基因片段 ； 将纯化的目的基因片段于克隆载体 pUCm-T(BBI 公司 ) 相连， 构建为重组 质粒并命名为pUCm-32 ； 将重组质粒pUCm-32转化感受态大肠杆菌JM109， 接种于含IPTG和 X-gaL 的氨苄青霉素 L。

16、B 培养板， 37培养 16h， 挑取阳性菌落接种液体 LB 培养基扩增， 提取 重组质粒进行测序， 测序结果如 SEQ ID No ： 1 所示 ； 测序结果经 Oligo 7 软件分析， 连接到 重组质粒 pUCm-32 中的目的基因序列与 GenBank 中的人 IL-32 的 cDNA 序列一致。 0029 实施例二、 构建表达人 IL-32 的重组真核表达载体 0030 取质粒pUCm-32和载体pPIC9K(Invitrogen公司)分别用限制性内切酶EcoR I和 Not I 进行双酶切， 回收约 560bp 的目的基因片段和载体 pPIC9K 的大片段， 用 T4DNA 连接酶。

17、 (BBI 公司 ) 于 16水浴连接 16h， 将连接产物转化感受态大肠杆菌 JM109， 接种于含卡那霉 素的 LB 培养板， 37培养过夜， 挑取阳性菌落接种液体 LB 培养基扩增， 提取重组真核表达 质粒并命名为pPIC9K-hIL-32 ； 用EcoR I和Not I对重组真核表达质粒pPIC9K-hIL-32 进行双酶切鉴定， 同时进行测序鉴定， 双酶切鉴定结果如图 3 所示， 酶切出的大片段和小片 段分别与载体 pPIC9K 和目的基因的大小相符合， 测序结果证实 pPIC9K-hIL-32 中的人 IL-32 编码基因序列与 pUCm-32 中的完全一致。 0031 实施例三、。

18、 重组真核表达质粒转化酵母 GS115 及其高拷贝重组工程菌的筛选 0032 提取经测序鉴定的 pPIC9K-hIL-32， 用限制性内切酶 Sal I 酶切后， 用 0.7的 琼脂糖凝胶电泳分离并回收线性化的 pPIC9K-hIL-32 ； 将线性化的 pPIC9K-hIL-32 与 酵母 GS115 感受态细胞混合后， 按照毕赤酵母表达手册 (Invitrogen 公司 ) 的方法进行电 转化。 0033 将转化产物涂布于不含 His 的 MD 培养板， 30培养 2 3 天， 挑选 MD 平板上生长 旺盛的优势菌落接种于含 0.5mg/mL G418 的 YPD 平板， 30培养 2 3。

19、 天， 挑选生长旺盛的 优势菌落接种于含 1mg/mL G418 的 YPD 平板， 30培养 2 3 天， 如此重复培养并依次增加 G418 浓度至 4mg/mL， 从含 4mg/mL G418 的 YPD 平板筛选得到高拷贝整合的毕赤酵母重组工 程菌 GS115/hIL-32。 0034 实施例四、 重组人 IL-32 的诱导表达、 纯化及分析 0035 将重组工程菌 GS115/hIL-32 接种 BMGY 培养基， 于 30、 250rpm/min 条件下 振荡培养至菌液 OD600 为 1 3 时， 转换为 BMMY 培养基继续培养， 每隔 24h 加入终浓度 为 1的甲醇诱导表达，。

20、 连续培养 96h， 离心收集培养上清， 先用 SDS-PAGE 检测培养上 清中 hIL-32 的表达情况， 然后用羊抗人 IL-32 多克隆抗体 (R&D 公司 ) 进行 Western blotting 鉴定表达的 hIL-32。将培养上清先用截流分子量为 10kDa 的超滤膜浓缩， 再用 DEAE-Sepharose Fast Flow 离子交换层析和 Sephadex G-75 凝胶过滤层析纯化， 纯化产物 经 SDS-PAGE 检测和 Western blotting 鉴定， SDS-PAGE 结果显示纯化的重组 hIL-32 为 单一蛋白条带， 其分子量为 22kDa， Western blotting 结果显示单一反应条带。 说 明 书 CN 102392043 A CN 102392051 A1/2 页 6 0001 0002 序 列 表 CN 102392043 A CN 102392051 A2/2 页 7 序 列 表 CN 102392043 A CN 102392051 A1/1 页 8 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102392043 A 。