一种利用化学基团抑制神经干细胞分化的调控方法.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101429494 B (45)授权公告日 2013.04.10 CN 101429494 B *CN101429494B* (21)申请号 200810239130.5 (22)申请日 2008.12.09 C12N 5/0797(2010.01) (73)专利权人 北京奥精医药科技有限公司 地址 100085 北京市海淀区上地开拓路 5 号 生物医药园区 A409 (72)发明人 崔菡 任永娟 胡堃 (74)专利代理机构 北京海虹嘉诚知识产权代理 有限公司 11129 代理人 胡敬红 US 2005181503 A1,2005.08.18, 全文 . CN 101。

2、003801 A,2007.07.25, 全文 . 赵明涛等 . 外遗调节与神经干细胞分化 . 细 胞生物学杂志 .2006, 第 28 卷 523-526. (54) 发明名称 一种利用化学基团抑制神经干细胞分化的调 控方法 (57) 摘要 本发明涉及一种利用化学基团能够抑制神经 干细胞分化的调控方法， 其特征在于 ： 在培养神 经干细胞时， 使神经干细胞与羟基基团接触。 本发 明利用羟基修饰的表面培养神经干细胞， 从而抑 制神经干细胞的分化， 较长时间保持神经干细胞 球的形状， 保持未分化的神经干细胞表型。 本发明 将有助于我们理解生物材料对于神经干细胞的调 控作用， 并对设计具有神经干细。

3、胞调控作用的组 织工程材料具有重要意义。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 于婷 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 3 页 1/1 页 2 1. 一种利用化学基团能够抑制神经干细胞分化的调控方法， 其特征在于 ： 在培养神经 干细胞时， 使神经干细胞与羟基基团接触。 2. 根据权利要求 1 所述的调控方法， 所述神经干细胞置于羟基化表面上。 3. 根据权利要求 2 所述的调控方法， 所述表面的基底为无机物、 或有机物。 4. 根据权利要求 3 所述的调控方法， 所述。

4、表面的基底为玻璃。 5. 根据权利要求 2 所述的调控方法， 所述羟基化为化学修饰法或物理吸附方法。 6. 根据权利要求 1 所述的调控方法， 所述神经干细胞的细胞形式为单细胞或神经干细 胞球。 7. 根据权利要求 1 所述的调控方法， 所述羟基基团添加在培养液内。 权 利 要 求 书 CN 101429494 B 2 1/3 页 3 一种利用化学基团抑制神经干细胞分化的调控方法 技术领域 0001 本发明涉及一种可抑制神经干细胞分化的调控方法， 且利用化学基团抑制其分 化。 背景技术 0002 神经干细胞能够分化为功能神经细胞， 为神经组织工程提供了细胞来源， 这为治 疗中枢神经系统疾病和损。

5、伤提供了希望。体外实验中， 神经干 / 前体细胞能在丝裂原作用 下增殖， 也能在微环境的影响下分化为神经元、 星型胶质细胞和少突胶质细胞。 0003 研究表明， 神经干细胞的行为受到内部程序和外部信号的调控， 其中外部信号来 自培养基、 基底和细胞间的相互作用。例如， 表皮生长因子 (EGF) 和碱性成纤维生长因子 (bFGF) 能促进中枢神经系统胚胎前体细胞的增殖， 形成神经球。而且， 神经生长因子、 睫状 神经营养因子、 胰岛素样生长因子 -1 和视黄酸也对神经干细胞的发育起着非常重要的调 控作用。除了上述的因子之外， 来自细胞 - 细胞接触的信号也对神经干细胞的多潜能分化 具有调控作用。。

6、若干研究已经证实不同的聚合物基底能够调控神经干细胞的行为。尽管如 此， 聚合物表面在外界环境作用下可能发生结构重组， 从而表现出不同的表面粗糙度和形 貌， 这些变化可能干扰对干细胞生物学行为与表面性质之间关系的研究， 从而难以阐释这 些基础相互作用之间的联系。 因此， 不同基底对于神经干细胞在的调控行为尚待深入研究。 0004 研究已经证明， 化学基团能控制细胞的生长和分化， 包括成骨细胞样细胞、 人成纤 维细胞和间充质干细胞。表面化学能调控细胞 - 基质的黏附和 FAK 信号通道。因此， 神经 干细胞对于不同基底的反应可能是源于这些基底的化学性质。而且， 化学基团的组成是生 物材料非常重要的。

7、化学性质， 包括膜和三维支架。 0005 由于神经干细胞很容易发生分化， 且其分化方向多样化， 因此目前对神经干细胞 的研究多集中在其分化功能的调控方面， 神经干细胞的体外分离培养是研究的重要方法， 然而未分化的神经干细胞具有低的免疫原性和增殖能力。因此， 寻找一种能够抑制神经干 细胞分化， 保持神经干细胞状态的化学基团， 将有助于我们理解生物材料对于神经干细胞 的调控作用， 并且将为设计生物材料来调控神经干细胞的提供了方法。 发明内容 0006 本发明的目的意在提供一种抑制神经干细胞分化的调控方法， 利用化学基团抑制 神经干细胞球中细胞向外迁移， 较长时间保持神经干细胞球的形状， 保持未分化。

8、的神经干 细胞表型。 0007 一种利用化学基团能够抑制神经干细胞分化的调控方法， 其特征在于 ： 在培养神 经干细胞时， 使神经干细胞与羟基基团接触。 0008 所述神经干细胞置于羟基化表面上。 0009 所述表面的基底为无机物或有机物。 0010 所述表面的基底为玻璃。 说 明 书 CN 101429494 B 3 2/3 页 4 0011 所述羟基化为化学修饰法或物理吸附方法。 0012 所述神经干细胞的细胞形式为单细胞或神经干细胞球。 0013 所述羟基基团添加在培养液内。 0014 神经干细胞对于不同的化学基团能产生不同的反应， 本发明人经过多次实验发 现， 在培养神经干细胞的过程中。

9、， 将神经干细胞与羟基基团接触， 能抑制神经干细胞分化。 0015 本发明人通过将神经干细胞接种在羟基化表面的玻璃片上， 在培养液中培养， 经 过 1 天和 5 天后， 神经球并没有发生分化， 说明羟基基团能抑制神经干细胞分化。 附图说明 0016 图 1 神经球在羟基化表面培养 1 天的情况， a 为光镜图片， b 为荧光显微镜图片。 0017 图 2 神经球在羟基化表面培养 5 天的情况， a 为光镜图片， b 为荧光显微镜图片。 0018 图 3 神经球在氨基化表面培养 1 天的情况， a 为光镜图片， b 为荧光显微镜图片。 0019 图 4 神经球在氨基化表面培养 5 天的情况， a。

10、 为光镜图片， b 为荧光显微镜图片。 0020 图 5 神经球在羧基化表面培养 1 天的情况， a 为光镜图片， b 为荧光显微镜图片。 0021 图 6 神经球在羟基化表面培养 5 天的情况， a 为光镜图片， b 为荧光显微镜图片。 具体实施方式 0022 下面结合实施对本发明作进一步的详细说明。 0023 实施例 1 0024 1、 制备羟基修饰表面 0025 将直径 10mm 的圆形玻璃片用作试验的基片， 使用煮沸的 0.01M SDS 溶液和 0.1N HCl 溶液依次清洗 30 分钟， 然后用去离子水漂洗干净保存待用。 0026 将干净的玻璃片放入新鲜配置的 Piranha 溶液。

11、， 即浓硫酸 / 双氧水溶液 (H2SO4 ： H2O2 3 ： 1)， 在 80下反应 30 分钟， 这样处理的玻璃片表面含有羟基基团， 以下称为羟基 化玻璃片。 玻璃片处理清洗完毕后， 使用氮气吹干待用。 Piranha溶液配制后即发生一系列 的化学反应， 不宜保存， 必须配制新鲜的溶液进行清洗操作， 使用时必须佩戴防护面具和手 套等保证身体的安全。 0027 将羟基化玻璃片放入 48 孔培养板 (Corning， USA)， 70医用酒精消毒， 然后使用 无菌 PBS 溶液充分清洗。 0028 2、 培养神经干细胞 0029 神经干细胞取材来源于孕 14 天的 SD 大鼠胚胎脑皮层， 孕。

12、鼠由北京大学实验动物 中心提供。取孕 14 天 SD 大鼠， 无菌条件下剖腹取出胎鼠， 剪开胎鼠颅骨， 分离取出大脑皮 层。解剖显微镜下将皮层置于预冷的 D-Hank s 液中， 剪切成 0.1cm3 的小块， 使用玻璃吸管 吹成单细胞悬液。在 DMEM/F12 培养液中添加 2 B27， 20ng/mLEGF， 12.5ng/mLbFGF， 100UI/ mL青霉素和100g/mL链霉素。 将单细胞悬液加入上述培养液， 放入T75培养瓶(Corning， USA)， 在 37 95 air/5 CO2 培养箱中悬浮培养。3-5 天， 半量换液。悬浮生长的细胞形 成细胞球后传代培养， 传代步骤。

13、如下 ： 0030 (1) 将细胞悬液静置沉淀 ； 0031 (2) 将细胞培养瓶中的细胞悬液集中 ； 说 明 书 CN 101429494 B 4 3/3 页 5 0032 (3) 将细胞悬液离心 2000rp， 5 分钟 ； 0033 (4) 弃上清， 使用 DMEM/F12 培养液将沉淀物重悬 ； 0034 (5) 将重悬后的细胞悬液均匀分散至细胞培养瓶中 ； 0035 (6) 维持细胞培养瓶中的细胞密度在 50000 细胞 /cm2。 0036 按照上述步骤， 将神经干细胞传代至第三代。 离心收集神经干细胞， 接种在羟基化 的玻璃片表面， 在上述培养基中培养 24 小时和 72 小时后。

14、， 换液。神经干细胞的培养情况见 图 1 和图 2。 0037 从图 1 中可以看出， (a) 和 (b) 中的神经球都没有明显的分化。 0038 从图 2 中可以看出， (a) 和 (b) 中的神经球与培养 1 天的神经球相比， 没有明显的 分化， 因此羟基基团可以抑制神经干细胞的分化。 0039 实施例 2 0040 1、 制备氨基修饰表面 0041 将制备的羟基化玻璃片浸泡在 1的 (3- 氨丙基 )- 三已氧基硅烷丙酮溶液中， 在 冷却水下反应 30 分钟， 这样处理的玻璃片表面含有氨基基团， 以下称为氨基化玻璃片。处 理的玻璃片先用乙醇清洗， 在用去离子水清洗。玻璃片处理清洗完毕后，。

15、 使用氮气吹干待 用。 0042 将氨基化玻璃片放入 48 孔培养板 (Corning， USA)， 70医用酒精消毒， 然后使用 无菌 PBS 溶液充分清洗。 0043 2、 培养神经干细胞 0044 见实施 1 0045 从图 3 中可以看出， (a) 和 (b) 中的神经球都开始出现明显的分化。 0046 从图 4 中可以看出， (a) 和 (b) 中的神经球与培养 1 天的神经球相比， 分化明显。 0047 实施例 3 0048 1、 制备羧基修饰表面 0049 将制备的氨基化玻璃片浸泡在丁二酸酐/二甲基甲酰胺溶液中30分钟， 这样处理 的玻璃片表面含有羧基基团， 以下称为羧基化玻璃片。

16、。处理的玻璃片先用二甲基甲酰胺清 洗， 在用去离子水清洗。玻璃片处理清洗完毕后， 使用氮气吹干待用。 0050 将羧基化玻璃片放入 48 孔培养板 (Corning， USA)， 70医用酒精消毒， 然后使用 无菌 PBS 溶液充分清洗。 0051 2、 培养神经干细胞 0052 见实施一 0053 从图 5 中可以看出， (a) 和 (b) 中的神经球都开始出现明显的分化。 0054 从图 6 中可以看出， (a) 和 (b) 中的神经球与培养 1 天的神经球相比， 分化明显。 0055 从上述实验可以看出， 在羧基化和氨基化表面， 都明显发生了神经干细胞的分化， 而在羟基化表面上培养的神经干细胞却没有发生分化， 特别是在培养 5 天后与 1 天的情况 对照中可以看出， 神经球还能保持原形， 不发生分化， 因此可以得出， 羟基基因能抑制神经 干细胞的分化。 说 明 书 CN 101429494 B 5 1/3 页 6 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 101429494 B 6 2/3 页 7 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 101429494 B 7 3/3 页 8 图 6 说 明 书 附 图 CN 101429494 B 8 。