一、技术领域
本发明一种复合猪α干扰素的基因序列及其重组载体，属于基因工程生物制品技术领域。与天然的猪α干扰素相比，有更强的抗病毒活性，可针对性的用于猪的各种病毒性疾病的防制和早期治疗。
二、背景技术
干扰素是动物机体最重要细胞因子之一，具有广谱、高效的抗病毒功能，对免疫系统起关键调节作用。早在1986年，Lefevre等就曾对猪α干扰素基因及猪α干扰素作了详细研究。得到了一个含α干扰素基因的片段，序列分析表明该片断有一连续的含190个密码子的开放阅读框，起始密码子上游有约100个核苷酸的5’区域，具TATTTAA序列(现已证实TATTTAA序列存在于绝大多数猪α干扰素基因中)，被认为是经修饰的Hogness-Goldberg盒，然而在终止密码子下游的499bp中没有AATAAA或ATTAAA类多聚腺嘌呤位点。此基因编码的成熟猪α干扰素的70～80位氨基酸有一个潜在的N-糖基化位点。此基因与HuIFN-α1核苷酸的编码序列有78.5％同源，编码的氨基酸与HuIFN-α1有64％同源，是所有已知猪IFN-α基因中与人同源性最高的。1986年Lefevre等用HuIFN-α1作探针从猪基因库中分离出10多个猪α干扰素基因和假基因，并测出其中2个基因的基因序列：PoIFN-α1和PoIFN-α2。1990年Lefevre等在成熟猪α干扰素编码序列的第一个密码子TGT前引入序列5’CATATG 3’，即一个起始密码子和一个NdeI限制性酶切位点，从而在大肠杆菌中表达出了猪α干扰素蛋白。所得猪α干扰素为重组猪α1型干扰素，分子量为17.5kDa，与天然猪α干扰素具有相同的N端氨基酸序列(缺失Met)。在同源的猪细胞上重组猪α1型干扰素的抗病毒活性至少比天然猪白细胞干扰素高6倍。但他们运用的是组合型表达载体，表达量较低，约为5％，目的蛋白以可溶形式存在，可用亲和层析方法小量纯化，难以在实际生产中应用。1995年Moore BR指出干扰素作为一种广谱抗病毒剂有巨大的应用价值；Piasecki E对猪天然干扰素(Natural porcine interferons，PoIFNs)的活性进行了研究，发现在猪的干扰素家族中，猪α干扰素的种属特异性较弱，可在猪、牛、人及鼠类等细胞上产生活性。1999年Ch in sangaram等研究表明猪IFN-α能有效抑制口蹄疫病毒的活力，2001年Riffault等研究表明感染TGEV的仔猪，可在肠道上皮组织中迅速产生抗TGEV的IFN-α。谢海燕等采用PCR技术克隆得到的猪IFN-α基因由501个核苷酸组成，共编码166个氨基酸；2002年国内学者陈涛等成功地在毕赤酵母表达系统和大肠杆菌表达系统中表达出重组干扰素基因，表达产物占菌体总蛋白的比率在20％～35％之间，表达产物具有抗病毒活性，为基因工程干扰素的规模化生产和应用提供了可能。2003年Moraes等用表达猪IFN-α(包含信号肽)的重组腺病毒Ad5-IFN-α和表达FMDV(Foot-and-mouth disease virus，口蹄疫病毒)A24P1蛋白和FMDV A12 3C蛋白的重组腺病毒(Ad5A24)对猪体进行联合免疫使其获得保护，来抵抗口蹄疫病毒的攻击并获得成功。国内秦耀明等报道：猪白细胞干扰素在乳猪的结扎肠段中可明显干扰猪流行性腹泻病毒的增殖；2003年郑永波等用猪白细胞干扰素作临床试验，试验结果表明如果直进行治疗，更能显著提高对患病动物的治率；2005年张泉军等通过实验和临床扩大试验发现猪白细胞干扰素对哺乳仔猪和断奶仔猪某些病毒性腹泻、细菌性腹泻或病毒、细菌混合感染引发的腹泻，均有良好的预防和治疗用；2006年杜以军等构建的重组腺病毒rAd-poIFN-α在HEK-293A细胞上获得的表达产物(含有猪IFN-α)在接种PK-15细胞的上清中表现出了较强的抗猪口蹄疫病毒的活性。
九十年代，美国安进公司研究出一种全新的人复合alpha干扰素：Infergen。这种复合干扰素是一种非自然的干扰素，166aa序列的获得是通过对几种天然alpha亚型干扰素序列的扫描，把最常见的氨基酸转移到各个相应的位置。为便于分子构造，还另改变了4个氨基酸。Infergen序列与alpha II型干扰素的同源性为88％，与beta干扰素的同源性为30％，且相似性较任何天然的alpha干扰素要高。实验证明：Infergen的抗多种病毒的活性较天然的干扰素高5倍，按WHO人源干扰素抗病毒策略为标准得到其抗病毒活性为1×109U/mg。为了进一步研究干扰素作用和扩大干扰素在生物领域的发展应用，我们进行了猪复合新型干扰素的研究工作：
设计该干扰素时选择野生型及抗病力较强的品种的α干扰素亚型为模板；将收集的干扰素氨基酸序列用DANMAN或者Lasergene DNAstar等软件进行比对分析，以择量录取原则，选择出现频率最高的氨基酸，拼接出一个人造干扰素氨基酸序列模板。Lasergene DNAstar分析新干扰素氨基酸结构，与其他表达或不表达蛋白质结构进行比较：结构越简单越有利于表达；确定好氨基酸序列后，按照偏嗜密码子的偏嗜性改造新型干扰素基因序列，在偏嗜性差别不大或密码子出现频率不很极端的情况下，选择GC含量高的偏嗜密码子，使酵母表达的基因GC含量控制在45％左右，接近酵母本身基因组的GC含量。确定好新基因序列后根据其长度设计引物，用Primer Premier 5.0软件共设计了十四条引物，根据扩增长度按常规扩增条件反应进行扩增。
由诱生剂诱导产生猪IFN-α，因来源少、成本高、纯化工艺复杂等诸多限制而价格昂贵，极大程度上限制了临床和科研的应用。原核表达系统中其产物主要以无生物活性的包涵体形式存在，若要想获得具有生物活性的重组蛋白必须对包涵体进行变性、复性等繁琐的后续处理工作，而后续处理工作中重组蛋白的损失量大而且对工作人员的技术水平要求也很高，这不利于工业化生产。因此，本试验采用酵母表达系统(J.L.Cereghino，J.M.Cregg，Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris)。此表达系统具有营养要求简单，生长快，操作方便，易于培养，成本低，密度高，发酵技术已非常成熟，具有大规模生产基因工程产品的潜力等优点，发酵上清液中的杂蛋白含量很低，更易进行大规模的生产。
三、发明内容
技术问题本发明的目的在于对猪α干扰素结构进行改造，研制出一种复合重组非天然猪α干扰素的基因序列的生产方法及其重组表达载体，达到高表达、高稳定、高分泌、高活性的生产，可广泛用于猪的各种病毒性疾病的防制和早期治疗，以及增强猪群的整体免疫力。
技术方案
一种复合猪α干扰素基因，其序列为SEQ ID NO.1，大小为501bp；
上述复合猪α干扰素基因的应用，包括：
(一)含有复合猪α干扰素基因酵母表达载体的构建与鉴定
将人工合成的权利要求1所述复合猪α干扰素基因SEQ ID NO.1加EcoRI和XbaI两个酶切位点后设计引物，PCR扩增该猪α干扰素基因的产物与pPICZα-A酵母载体连接后，酶切，T4 DNA Ligase连接过夜，连接产物转化感受态E.coli DH5α得到重组表达载体，重组表达载体再进行双酶切鉴定，酶切切下大小为501bp的条带则鉴定为阳性载体，DNA序列测定完全正确的阳性载体即为构建的含有猪α干扰素基因酵母表达载体，命名为PpICZα-MPoIFNα；
(二)酵母菌毕赤酵母X-33感受态细胞的制备
(三)含有复合猪α干扰素基因酵母表达载体电转化入酵母菌X-33感受态细胞
取经SacI酶线性化后的上述含有猪α干扰素基因的酵母表达载体PpICZα-MPoIFNα10μL，与80μL上述酵母菌毕赤酵母X-33感受态细胞混匀，然后转移到冰预冷的0.2cm的电转化杯中，冰上放置5min；将电转化杯放在电穿孔仪上用脉冲电流进行电击一次，电击结束，立即加入1mL冰预冷的1mol山梨醇，混匀，移入1.5mL的Eppendof管中，置于28℃恒温培养箱，培养1h，然后取250μL转化物涂含有100μg/mLZeocin(博来霉素)抗性的YPDS培养基平皿上，置28℃恒温培养2-4天，将在YPDS培养基上生长的含有PpICZα-MPoIFNα的重组酵母菌落进行阳性鉴定；
(四)含PpICZα-MPoIFNα载体重组酵母菌株的阳性鉴定
(1)提取含PpICZα-MPoIFNα载体重组酵母菌株的基因组DNA
(2)用来阳性鉴定的AOX1引物：
上游：5’-gactggttccaattgagaagc-3’ 下游：5’-gcaaatggcattctgacatcc-3’
(3)PCR扩增鉴定：以酵母基因组DNA为模板，以AOX1引物为特异性引物进行PCR扩增，获得扩增片段总长度为1089bp的条带，则为含有PpICZα-MPoIFNα载体的重组酵母阳性菌株，命名为X-33/PpICZα-MPoIFNα；
(五)X-33/PpICZα-MPoIFNα的诱导表达
从含有上述菌株的YPDS培养基平皿上分别挑取两株菌株接于25mL的BMGY液体培养基中，经28℃摇床培养至OD600＝2-6时，室温1500rpm/min离心5min收获菌体，将收获的菌体用100mL的BMMY培养液悬浮于500mL的三角瓶中，置于28℃摇床进行诱导表达，每24h向培养基中补加终浓度为体积比1％的甲醇，以保持诱导的持续表达，在诱导72h时离心法收集培养的X-33/PpICZα-MPoIFNα表达的上清进行纯化；
(六)X-33/PpICZα-MPoIFNα表达产物的纯化
用45％的硫酸铵沉淀上述收集的X-33/PpICZα-MPoIFNα表达上清，12000rpm/min离心30min，倒掉上清，0.9M硫酸铵重悬蛋白沉淀，然后过疏水柱(Phenyl SepharoseTM 6FastFlow)脱盐，脱盐后的蛋白再经阴离子交换柱(Q Sepharose Fast Flow)纯化后即得到了本发明复合猪α干扰素基因的表达蛋白；
有益效果
本发明采用的毕赤氏酵母基因工程菌生产的复合猪α干扰素与传统生产的天然猪α干扰素和用大肠杆菌表达的天然猪α干扰素相比有以下几个优点：
A表达猪α干扰素成熟蛋白的基因扩增简单方便：只要设计好引物不要模板就可以扩增出表达猪α干扰素成熟蛋白的基因。
B获得具有生物活性的复合猪α干扰素方法和程序都简单：只需收集表达的上清进行透析除盐、过滤除菌处理后无需纯化即可投入临床使用；
C无毒害物质：酵母不会分泌像大肠杆菌表达的外源蛋白那样附带一些对猪体细胞有毒害的毒素；
D纯度高：酵母表达的猪α干扰素的SDS-PAGE结果经薄层扫描显示，重组酵母猪α干扰素的目的条带占总表达蛋白量的80％；
E广谱抗病毒作用：现国内外资料表明猪干扰素对猪的各种病毒性疾病的病毒均有较好的抑制作用，尤其对一些烈性传染性病毒性疾病如蓝耳病、口蹄疫的早期治疗和预防有很好的作用，能在很大程度上遏制各种猪传染性的病毒性疾病的流行和爆发；
F抗病毒作用强：该新型基因组表达的蛋白与酵母表达的天然猪α干扰素相比，有更好的抗病毒活性，其在PK-15细胞上抵抗100TCID50VSV病毒感染的作用提高了44.4倍。
G有强大的免疫调节作用：医学临床把干扰素用于SARS、肝炎以及各种病毒性疾病治疗和预防的成功例子为复合猪α干扰素用于猪群各种病毒性疾病的治疗和防制提供了可靠的依据。
复合猪α干扰素的成功研制，以及它所具有的一系列的便于工业化生产的优点和强大的抗病毒功能，必将给我国猪病毒性疾病的防制带来新的局面。将本发明新设计的复合猪α干扰素的基因序列重组到pPICZ α-A载体，然后通过电转化方式整合到酵母菌上的特定位置。并采用毕赤酵母表达系统表达外源基因，有利于猪干扰素商业化生产。该基因组表达的蛋白与酵母表达的天然干扰素相比，其表达量提高了3.17倍。用PK-15-VSV系统检测该复合猪α干扰素的抗病毒活性，比酵母表达的天然猪α干扰素提高了44.4倍。100U该复合干扰素在PK-15细胞上能完全抑制100TCID50的水疱性口炎病毒以及伪狂犬病毒的攻击。
四、附图说明
图1：复合猪α干扰素基因PCR产物电泳分析
1，DNA分子量标准；2，PCR扩增目的片段
图2：PpICZα-MPoIFNα阳性克隆载体的酶切鉴定
1，空质粒酶切对照；2，EcoR I和XbaI酶切的PpICZα-MPoIFNα；3，4500DNA分子量标准
图3：重组酵母菌的PCR鉴定
1，X-33/PpICZα-MPoIFNα；2，未重组上的空酵母X-33对照；3，4500DNA分子量标准
图4：X-33/PpICZα-MPoIFNα表达的复合猪α干扰素SDS-PAGE分析及westernblot鉴定1，Protein Marker；2，X-33/pPICZa表达上清；3，复合猪α干扰素表达产物；4，复合猪α干扰素westernblot结果
图5：干扰素抑制PK-15细胞的MTT结果
1，2，3，4，5，6，7，8分别是浓度为0，0.156，0.313，0.625，1.25，2.5，5，10的干扰素
图6：干扰素抑制PRVmRNA表达的SYBR Green I实时荧光定量PCR结果
1，PRV对照；2，天然猪α干扰素；3，复合猪α干扰素
生物材料保藏
菌株X-33/PpICZα-MPoIFNα，属巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，于2010年01月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC NO.3570。
五、具体实施方式
一、试验材料
Escherichia coli DH5a、酵母菌X-33和pPICZα-A载体均购自上海英俊公司；所用化学试剂及试剂盒均购自Takara公司；Phenyl SepharoseTM 6Fast Flow和Q Sepharose FastFlow购自上海GE公司；PK-15细胞(猪肾细胞)、VSV(水泡型口炎病毒)、PRV(猪伪狂犬病病毒)和猪天然α干扰素均为公知公用(曹瑞兵等，一种新的猪α-干扰素基因克隆及其在大肠杆菌中表达，农业生物技术学报JournalofA griculturalBiotechnology 2004，12(3)：278~282)。
二、试验设计及生产方法
(一)重组到毕赤酵母上的新型复合猪α干扰素的基因序列的的设计及扩增
(A)在GenBank上查找猪α干扰素的基因序列，选择野生型及抗病力较强的27条猪α干扰素亚型为模板；
(B)将选出的27条猪α干扰素通过DANMAN或者Lasergene DNAstar等软件进行比对分析，以择量录取原则，拼接出一条人造干扰素氨基酸序列模板，将此氨基酸序列翻译成核苷酸序列SEQ ID NO.1，根据密码子偏嗜性，全部换用酵母的偏嗜性密码子(赵翔，霍兢，李育阳；毕赤酵母的密码子用法分析)。基因GC含量控制在45％左右，接近酵母本身基因组GC含量(Graham Sinclair，Francis Y.M.Choy. Synonymous codon usagebias and the exp ression of human glucocerebro sidase in the methylotrophic
(C)将加了酶切位点和保护性碱基的新型猪α干扰素核苷酸序列522bp设计引物，用Primer Premier 5.0设计引物，共设计14条引物如表1。
(D)SOE法进行PCR扩增，
反应体系：
5×Prime STAR Buffer 10.0μL；Prime STA 0.4μL；
50pmol/μL上游引物 1.0μL； dNTP 4.0μL；
50pmol/μL下游引物 1.0μL；
ddH2O 33.6μL；
在PCR仪上设置95℃5min，随后94℃15s，54℃15s，72℃15s，共30个循环，结束循环后72℃10min；对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定获得的猪α干扰素基因大小。
以上面体系对引物两两进行扩增，然后回收PCR产物，再以PCR产物为模板进行如下体系扩增：
5×Prime STAR Bufier 10.0μL；Prime STAR 0.4μL；
50pmol/μL上游引物 0.25μL；dNTP 4.0μL；
50pmol/μL下游引物 0.25μL；模板1 2.0μL；
模板2 2.0μL； ddH2O 31.1μL；
在PCR仪上设置95℃5min，随后94℃15s，54℃15s，72℃15s，共30个循环，结束循环后72℃10min；对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定获得的猪α干扰素基因大小。
最后扩增出PCR产物的基因片段大小为522bp见图1；
表1
引物 5’-3’ SRpIFN-1 GCGGAATTCATGTGTGATTTGCCACAAACTCATTCCTTGGCTCATACTAGAGCTTTGAG ARpIFN-2 CAGGAGAATGGAGAAATTCTTCTCATTTGAGCCAACAATCTCAAAGCTCTAGTATGAG SRpIFN-3 AAGAATTTCTCCATTCTCCTGTTTGGATCATAGAAGAGATTTCGGTTCTCCACATGAAG ARpIFN-4 CCATAGCTTGAGCCTTCTGAACTTGGTTACCACCCAAAGCTTCATGTGGAGAACCGAAA SRpIFN-5 TCAGAAGGCTCAAGCTATGGCTTTGGTTCATGAAATGTTGCAACAAACTTTCCAGTTGT ARpIFN-6 GATTCGTTCCAAGCAGCAGCAGAACCTTCAGTGGAGAACAACTGGAAAGTTTGTTGC SRpIFN-7 TGCTGCTGCTTGGAACGAATCTTTGTTGCATCAATTCTGTACTGGTTTGGATCAGCAGT ARpIFN-8 CCAGCTTCTTGCATAACACAAGCTTCCAAATCTCTCAACTGCTGATCCAAACCAGTA SRpIFN-9 TGTGTTATGCAAGAAGCTGGTTTGGAAGGTACTCCATTGTTGGAGGAGGATTCC ARpIFN-10 GTCAATCTATGGAAGTATCTCTTAACAGCCAAGATGGAATCCTCCTCCAACAAT SRpIFN-11 GATACTTCCATAGATTGACTTTGTACTTGCAAGAGAAGTCTTACTCTCCATGTGCTT ARpIFN-12 GAGGAGAAGGATCTCATAACTTCAGCTCTAACAATTTCCCAAGCACATGGAGAGTAAG SRpIFN-13 AGTTATGAGATCCTTCTCCTCTTCTACTAACTTGCAAGATAGATT ARpIFN-14 CCGTCTAGATTATTCCTTCTTTCTCAATCTATCTTGCAAGTTAGTA
(二)含有复合猪α干扰素基因酵母表达载体的构建与鉴定
将人工合成的复合猪α干扰素基因SEQ ID NO.1加EcoRI和XbaI两个酶切位点后设计引物用PCR扩增该猪α干扰素基因SEQ ID NO.1，扩增产物与pPICZα-A酵母载体分别进行EcoRI和XbaI双酶切，回收酶切产物，T4 DNA Ligase连接过夜，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞得到重组表达载体，重组表达载体再进行酶为EcoR I和XbaI的双酶切鉴定，酶切切下大小为501bp的条带则鉴定为阳性载体，对阳性载体送上海英俊公司进行DNA序列测定，序列测定完全符合SEQ ID NO.1，其阳性载体即为构建的含有猪α干扰素基因酵母表达载体，命名为PpICZα-MPoIFNα；见图2；
(三)酵母菌感受态细胞的制备
挑取毕赤酵母X-33菌平板上的一个单菌落转接于2mLYPD(Pichia Expression Kit)试管中，28℃250rpm恒温摇过夜活化12h后，取500μL的活化后的毕赤酵母X-33菌液转接于50mL的含有无菌5mLYPD培养基的三角瓶中，瓶口用三层灭菌纱布扎紧，28℃恒温摇床250rpm摇荡培养20h左右，待菌液OD600＝1.3-1.5时，4℃2500rpm/min离心1min收获毕赤酵母X-33菌体，菌体依次用1mL冰预冷水洗涤两遍，再用1mL冰预冷的1mol山梨醇洗涤，4℃2500rpm/min离心1min，最后用0.8mL冰预冷的1mol山梨醇悬浮菌体，分装不同的1.5mL的Eppendof管后，置4℃待用，即为制备的酵母菌毕赤酵母X-33感受态细胞；
(四)含X-33/PpICZα-MPoIFNα的表达载体电转化入酵母菌
(1)取经SacI酶线性化后的上述含有猪α干扰素基因的酵母表达载体10μL，与80μL上述酵母菌毕赤酵母X-33感受态细胞混匀，然后转移到冰预冷的0.2cm的电转化杯中，冰上放置5min；
(2)将电转化杯放在电穿孔仪上用脉冲电流进行电击一次，电击条件：电压1500V，电容25uF，电阻200Ω，时间5ms；
(3)电击结束，立即加入1mL冰预冷的1mol山梨醇，混匀，移入1.5mL的Eppendof管中，置于28℃恒温培养箱，培养1h，然后取250μL转化物涂含有100μg/mLZeocin抗性的YPDS培养基平皿上，置28℃恒温培养2-4天，将在YPDS培养基上生长的含有PpICZα-MPoIFNα的重组酵母菌落进行阳性鉴定；
(五)含X-33/PpICZα-MPoIFNα载体重组酵母菌株的阳性鉴定
(1)提取酵母基因组DNA：将上述YPDS培养基上生长的含PpICZα-MPoIFNα载体的重组酵母菌落挑至含100μg/mLZeocin的YPDS液体培养基中，28℃摇床培养36h-48h，然后从该菌液中提取酵母基因组DNA：取1mL的菌液放入Eppendof管中，12000rpm/min离心1min，弃上清，用1mL的灭菌水重悬菌体，重复两次，然后加100μL的灭菌水，100℃煮10分钟，消解酵母菌细胞壁，然后放入液氮冻30分钟，100℃煮10分钟，12000rpm/min离心取上清液，即为酵母基因组DNA，以其为模板进行PCR阳性鉴定(Linder，S.，Schliwa，M.，Kube-Granderath，E.，1996.Direct PCR screening of P.pastoris clones.BioTechniques)；
(2)用来阳性鉴定的AOX1引物：
上游：5’-gactggttccaattgagaagc-3’ 下游：5’-gcaaatggcattctgacatcc-3’
(3)PCR扩增鉴定
以酵母基因组DNA为模板，以AOX1引物为特异性引物进行PCR扩增，PCR扩增体系为：
10×PCR Buffer： 5.0μL；10mM dNTPs： 1.0μL；
20pmol/μL 5′AOX1引物：0.5μL；基因组DNA模板：5.0μL；
20pmol/μL 3′AOX1引物：0.5μL；Taq酶： 0.5μL；
灭菌水补体积至50μL
扩增程序：95℃5min，94℃1min，54℃1.5min，72℃2.5min，30个循环，72℃7min，扩增结束，取5μL反应液做琼脂糖凝胶电泳观察，获得扩增片段总长度为1101bp的条带，则为含有PpICZα-MPoIFNα载体的重组酵母阳性菌株，命名为X-33/PpICZα-MPoIFNα；见：图3；
(六)X-33/PpICZα-MPoIFNα的诱导表达
从含有上述菌株的YPDS培养基平皿上分别挑取两株菌株接于25mL的BMGY液体培养基(Pichia Expression Kit)中，经28℃摇床培养至OD600＝2-6时，室温1500rpm/min离心5min收获菌体，将收获的菌体用100mL的BMMY培养液悬浮于500mL的三角瓶中，置于28℃摇床进行诱导表达，每24h向培养基中补加终浓度为体积比1％的甲醇，以保持诱导的持续表达，在诱导72h时收集培养的X-33/PpICZα-MPoIFNα表达的上清进行纯化；
(七)X-33/PpICZα-MPoIFNα表达产物的纯化
用45％的硫酸铵沉淀上述收集的X-33/PpICZα-MPoIFNα表达上清，12000rpm/min离心30min，倒掉上清，0.9M硫酸铵重悬蛋白沉淀，然后过疏水柱(Phenyl SepharoseTM 6FastFlow)脱盐，脱盐后的蛋白再经阴离子交换柱(Q Sepharose Fast Flow)纯化后即得到了本发明复合猪α干扰素基因的表达蛋白；
同时对不同时段表达产物取样，进行SDS-PAGE电泳(U.K.Laemmli，Cleavage ofstructural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4)发现在诱导了72h时的上清的电泳图上在14.4KD与21.5KD之间有一条大约19KD的明显的蛋白电泳条带，与预测的分子量相同，进行纯化后SDS-PAGE电泳见图4；
(八)目的蛋白浓度的测定
用核酸蛋白分析仪的紫外分光光度法测定样品在280nm波长的光收值，按照公式计算样品中蛋白质含量。
公式为：蛋白质浓度(mg/ml)＝(OD280×稀释倍数)/消光系数
(九)X-33/PpICZα-MPoIFNα表达产物的westenblot鉴定
用纯化的天然猪α干扰素免疫兔子，制备多抗血清，用此多抗血清做一抗SPA-HRP(金黄色葡萄球菌A蛋白)做二抗做westernblot鉴定。转化重组质粒X-33/PpICZα-MPoIFNα的酵母菌X-33在约19KD处有特异蛋白条带显色；见：图5；
(十)X-33/PpICZα-MPoIFNα表达的复合猪α干扰素在PK-15细胞上的抗细胞增殖测定
A、复合猪α干扰素在PK-15细胞上的MTT测定
PK-15细胞记数后用含10％小牛血清的DMEM营养液稀释到适当的密度，以2×103/孔的浓度滴加到96孔板，置于37℃，5％CO2培养箱中待细胞贴壁成单层(约17-18h)后用含10％小牛血清的DMEM营养液将酵母表达的复合猪α干扰素进行两倍倍比稀释，10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.625μg/ml、0.313μg/ml，每个浓度做五个重复。在96孔细胞培养板上将两倍倍比稀释的复合猪α干扰素样品以100μl/孔分别预处理PK-15细胞72h后，每孔加入20μl浓度为5mg/ml的MTT，置于37℃，5％CO2培养箱中继续培养4小时，然后每孔加入200μlDMSO(二甲基亚砜)终止培养，在振荡器上振荡十分钟后置于570nm波长下读数；
B、复合猪α干扰素在PK-15细胞上的MTT测定结果
由图5可知，复合猪α干扰素比相同质量的天然猪α干扰素能更有效地抑制PK-15细胞的增殖。
(十一)酵母表达的复合猪α干扰素生物活性的测定，并与天然猪a干扰素进行活性比较
A、(1)复合猪α干扰素在PK-15细胞上抗VSV的活性
待PK-15细胞在96孔细胞培养板中长成单层后，倾去营养液，用维持液洗两遍，每孔加入用含10％小牛血清的1640营养液作连续10倍稀释的复合猪α干扰素和天然猪α干扰素各100μL，每一稀释度接种四孔。将细胞培养板置于5％CO2，37℃细胞培养箱中继续培养，24h后倾去上清，用维持液洗两遍，每孔加入100μL 1000TCID50/mLVSV病毒液，同时设不加干扰素的阴性对照和不加病毒的空白对照，吸附1h后弃去上清，加入含2％小牛血清的维持液，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中继续培养致病毒阳性孔细胞病变达75％，约24h，置倒置显微镜下观察结果，以最后的记录结果为最终的结果，据Reed-Muench公式算干扰素效价。试验重复三次。将抑制50％细胞病变的干扰素的最高稀释度定为1个干扰素单位。
A、(2)SYBR Green I实时荧光定量PCR检测复合猪α干扰素在PK-15细胞上抗PRV的活性
待PK-15细胞在24孔细胞培养板中长成单层后，倾去营养液，用维持液洗两遍，每孔加入用含10％小牛血清的1640营养液稀释10-6的复合猪α干扰素各100μL。将细胞培养板置于5％CO2，37℃细胞培养箱中继续培养，24h后倾去上清，用维持液洗两遍，每孔加入100μL 1000TCID50/mlPRV病毒液，同时设不加干扰素的阴性照和不加病毒的空白对照，吸附1h后弃去上清，加入含2％小牛血清的维持液，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中继续培养24h后提取病毒DNA。
用Takara公司病毒DNA提取试剂盒按其操作说明书提取PRVDNA，溶于30ml超纯水中，用于SYBR Green I实时荧光定量PCR检测。在ABI公司7300型全自动实时荧光定量PCR仪上扩增并检测荧光。同时采用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因作为内参。所用的PCR引物GAPDH-F：5-ACTCACTCTTCTACCTTTGATGCT-3；
GAPDH-R：5-TGTTGCTGTAGCCAAATTCA-3；PRV-F：5-CTCGCCATCGTCAGCAA-3；
PRV-R：-GCTGCTCCTCCATGTCCTT-3。25μLPCR反应体系中含2×SYBR Green PCRMasterMix 12.5μL，10pmol/L的上、下游引物各1μL，DNA2μL，2.5mMdNTP2μL，TaqDNA聚合酶0.25μL，超纯水6.25μL。扩增参数为：95℃30s，95℃10s、55℃15s、72℃30s，共40个循环。反应结束后，进行熔解曲线的测定，反应条件为：95℃15s、60℃1min、95℃15s、60℃15s。反应结束后通过ABI PRISM7300SDS software(Applied Biosystems)软件分析数据。
本实验中采用2-ΔΔCt法进行PRV的相对定量。即提取PRV的DNA作10倍梯度稀释(稀释范围为101-106TCID50/ul)的样品做出标准曲线，由此确定各组所用的稀释度，同时测得各组样品的ct值，然后采用2-ΔΔCt相对定量公式，经内参基因GAPDH的内均一化处理后即可算出各组样品相对于对照组样品的表达量。
B、(1)抗VSV的结果
在PK-15细胞上接水疱性口炎病毒24小时后观察可见阳性对照孔完全出现100％严重病变，而加入进行10倍倍比稀释的酵母表达的复合猪α干扰素的细胞孔中，108未见任何细胞病变，阴性对照孔中的PK细胞未见异常。从上述结果得出复合猪α干扰素的生物学活性为1.716×108，天然猪a干扰素的生物学活性为3.873×106，复合猪α干扰素的生物学活性是天然猪α干扰素的生物学活性的44.4倍；
表2复合猪α干扰素与天然猪a干扰素的活性比较
B、(2)SYBR Green I实时荧光定量PCR检测复合猪α干扰素在PK-15细胞上抗PRV的活性结果
取各组接毒24h后的细胞悬液抽提病毒DNA后进行荧光定量PCR。采用2-ΔΔCt法进行PRV的相对定量，图6显示，接入干扰素的细胞孔中的PRVmRNA水平显著低于对照组中的水平，与对照组相比，接入复合猪α干扰素和天然猪α干扰素的细胞孔中PRVmRNA的水平分别降低了37倍和14倍。
根据以上实验结果可以说明新型复合猪α干扰素已被成功研制出来，本研究为复合猪α干扰素在养猪业中的应用奠定了基础。
序列表
<110>南京农业大学
<120>一种复合猪α干扰素基因及其重组载体
<130>说明书
<140>00
<141>2009-03-12
<160>17
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>501
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>猪α干扰素基因序列
<222>(1)..(501)
<223>
<400>1
atgtgtgatt tgccacaaac tcattccttg gctcatacta gagctttgag attgttggct 60
caaatgagaa gaatttctcc attctcctgt ttggatcata gaagagattt cggttctcca 120
catgaagctt tgggtggtaa ccaagttcag aaggctcaag ctatggcttt ggttcatgaa 180
atgttgcaac aaactttcca gttgttctcc actgaaggtt ctgctgctgc ttggaacgaa 240
tctttgttgc atcaattctg tactggtttg gatcagcagt tgagagattt ggaagcttgt 300
gttatgcaag aagctggttt ggaaggtact ccattgttgg aggaggattc catcttggct 360
gttaagagat acttccatag attgactttg tacttgcaag agaagtctta ctctccatgt 420
gcttgggaaa ttgttagagc tgaagttatg agatccttct cctcttctac taacttgcaa 480
gatagattga gaaagaagga a 501
<210>2
<211>59
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>引物SRpIFN-1
<222>(1)..(59)
<223>
<400>2
gcggaattca tgtgtgattt gccacaaact cattccttgg ctcatactag agctttgag 59
<210>3
<211>58
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>ARpIFN-2
<222>(1)..(58)
<223>
<400>3
caggagaatg gagaaattct tctcatttga gccaacaatc tcaaagctct agtatgag 58
<210>4
<211>59
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>S RpIFN-3
<222>(1)..(59)
<223>
<400>4
aagaatttct ccattctcct gtttggatca tagaagagat ttcggttctc cacatgaag 59
<210>5
<211>59
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>ARpIFN-4
<222>(1)..(59)
<223>
<400>5
ccatagcttg agccttctga acttggttac cacccaaagc ttcatgtgga gaaccgaaa 59
<210>6
<211>59
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>S RpIFN-5
<222>(1)..(59)
<223>
<400>6
tcagaaggct caagctatgg ctttggttca tgaaatgttg caacaaactt tccagttgt 59
<210>7
<211>57
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>ARpIFN-6
<222>(1)..(57)
<223>
<400>7
gattcgttcc aagcagcagc agaaccttca gtggagaaca actggaaagt ttgttgc 57
<210>8
<211>59
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>S RpIFN-7
<222>(1)..(59)
<223>
<400>8
tgctgctgct tggaacgaat ctttgttgca tcaattctgt actggtttgg atcagcagt 59
<210>9
<211>57
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>ARpIFN-8
<222>(1)..(57)
<223>
<400>9
ccagcttctt gcataacaca agcttccaaa tctctcaact gctgatccaa accagta 57
<210>10
<211>54
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>S RpIFN-9
<222>(1)..(54)
<223>
<400>10
tgtgttatgc aagaagctgg tttggaaggt actccattgt tggaggagga ttcc 54
<210>11
<211>54
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>ARpIFN-10
<222>(1)..(54)
<223>
<400>11
gtcaatctat ggaagtatct cttaacagcc aagatggaat cctcctccaa caat 54
<210>12
<211>57
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>S RpIFN-11
<222>(1)..(57)
<223>
<400>12
gatacttcca tagattgact ttgtacttgc aagagaagtc ttactctcca tgtgctt 57
<210>13
<211>58
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>A RpIFN-12
<222>(1)..(58)
<223>
<400>13
gaggagaagg atctcataac ttcagctcta acaatttccc aagcacatgg agagtaag 58
<210>14
<211>45
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>S RpIFN-13
<222>(1)..(45)
<223>
<400>14
agttatgaga tccttctcct cttctactaa cttgcaagat agatt 45
<210>15
<211>46
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>A RpIFN-14
<222>(1)..(46)
<223>
<400>15
ccgtctagat tattccttct ttctcaatct atcttgcaag ttagta 46
<210>16
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>AOX1引物上游
<222>(1)..(21)
<223>
<400>16
gactggttcc aattgagaag c 21
<210>17
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>AOX1引物下游
<222>(1)..(21)
<223>
<400>17
gcaaatggca ttctgacatc c 21