技术领域 本发明涉及谷胱甘肽的高密度发酵生产法，属于生物技术领域。
背景技术 谷胱甘肽(GSH)，即γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸，是由三 个氨基酸组成的小肽，通常所说的谷胱甘肽是指还原型谷胱甘肽，其在生物体 内起重要作用。谷胱甘肽是细胞内存在的最丰富的小分子硫醇类化合物，是保 护酶和其他蛋白质的硫氢基的一种抗氧化剂，是细胞内非蛋白硫氢基团的主要 组成部分，参与细胞内的氧化还原反应，是某些酶的辅酶，并对一些巯基酶有 激活作用。越来越多的临床科学实验显示，人体内的谷胱甘肽增加后，对消化 系统、呼吸系统和新陈代谢等等都有帮助。美国著名的医学专家古特曼博士这 样预测：“谷胱甘肽很快就会像胆固醇一样，成为人们衡量健康的指标之一！”。 由于谷胱甘肽在细胞内的重要作用，谷胱甘肽在医药领域中的广泛应用早已得 到公认，其在食品添加剂、运动营养学、保健品和化妆品上的应用也越来越广 泛。
谷胱甘肽的生产方法主要有萃取法、化学合成法、酶转化法和发酵法。自 1938年发表的GSH制备的最早专利以来，国内外学者围绕GSH的生产开展了大 量的研究。概括来说，萃取法主要是通过萃取和沉淀的方法从含有GSH的动植 物组织中进行GSH的分离提取，由于原料不易获得且GSH的含量极低，因此该 法的实际应用价值不大。化学合成法生产GSH，即将L一谷氨酸、L一半胱氨酸 和甘氨酸缩合成GSH。该法较早用于GSH生产，但操作过程复杂、耗时且得到的 GSH是左旋体和右旋体的混合物，分离十分困难，造成产品纯度不高，且生物效 价很难保持一致。GSH的酶法合成是利用GSH合成酶系，在三磷酸腺苷(ATP)的 存在下将三种组成氨基酸催化形成GSH。该法首先需要获得GSH合成的相关酶系， 其次需要加入价格昂贵的前体氨基酸和ATP，目前还处于实验室研究阶段(国家 专利申请号03113418.1)。综合比较，发酵法生产GSH最具竞争力，是当前世 界上主要的生产方法，并且由于避免了昂贵的ATP消耗，比较经济实用(詹谷 宇等.药学学报，1990；25(7).494-499)。由于微生物容易培养，因此该法将 具有极大的应用潜力。国外谷胱甘肽的主要产地在口本，应用的是微生物发酵 法生产谷胱甘肽(詹谷宇等，酵母菌生物合成谷胱甘肽，药学学报，1990；25(7)) 国内谷胱甘肽的研究起步较晚，现在主要还是在一些研究院校内，处于研究阶 段，没有形成一定的生产规模(李寅，陈坚等.氨基酸和酵母膏对谷胱甘肽发 酵的影响，中国医药工业杂志，1998；29(12)：537—542.)。饶志明等(饶 志明等.产谷胱甘肽重组巴斯德毕赤氏酵母发酵条件的研究.食品与发酵工业， 2007，33(5)：1-3)研究利用重组巴斯德毕赤氏酵母(Pichiapastoris)x-33 (pGAPZA-gsh1)生产谷胱甘肽其产量只有97.9mg/L，此法利用摇瓶在试验室进 行且产量过低，在实际生产中无意义。董一群等(董一群等.补料方式对酵母菌 生产谷胱甘肽的影响.工业微生物，2003，33(1)：19-21)研究了分批发酵及 恒速流加、指数流加和恒pH流加补料方法。其结果为分批补料中GSH含量 323.39mg/L；恒速流加中GSH含量为638.2mg/L；指数流加中GSH含量为678.9 mg/L；而恒pH流加补料中GSH含量为977.8mg/L。该试验中明显GSH含量较高 且采用恒pH流加补料其工艺过程易于控制有利于生产，但是其发酵周期为60 小时，同时GSH含量没有显著提高。王峥，谭天伟等(王峥，谭天伟等.谷胱甘 肽发酵过程中的乙醇控制.生物加工过程，2004，5(2)：64-67)研究在酿酒酵 母谷胱甘肽发酵中，比较了乙醇控制在一定浓度和逐步下降两种乙醇控制方式 对谷胱甘肽合成的影响，其结果为后者较好。该研究中GSH含量较高达到 1620mg/L，而此法只有当乙醇形成后并达到一定的检测浓度时才可以进行控制， 虽有一定的指导意义但很有限。在国家专利(专利申请号200510023119.1)“谷 胱甘肽的生产方法”中指出将带有谷胱甘肽合成酶A和酶B的两种表达重组基 因的基因工程大肠杆菌经大规模培养和大规模分离纯化技术，获得酶A和酶B， 并将它们分别用合适的材料固定。该方法中存在以下几个不利因素：(1)基因 工程菌因其稳定性差不适合规模生产；(2)大肠杆菌的培养周期较长，在工业 化生产中容易染菌并延长了生产周期；(3)酶A和酶B的分离纯化也存在难度； (4)用合适的材料固定也使得生产工艺复杂化。国家专利(申请号03113418.1) “一种提高产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽产量的方法”中指出采用产朊假丝 酵母(Candidautilis)WSH02-08为出发菌株，经斜面培养和种子培养后，接种 在摇瓶培养或发酵罐培养，在发酵液中添加L-半胱氨酸，添加时间0-20小时， 添加浓度6-10mmol/L。该方法所得最后产量为400mg/L-520mg/L。该方法虽然 时间短工艺简单，但最后目标产量却较低，仍很难用于生产。国家专利(申请 号200510059998.3)“酵母发酵联产麦角固醇和谷胱甘肽的方法”中利用同一种 酵母发酵菌种发酵同时生产两种代谢产物-麦角固醇和谷胱甘肽。该方法在生产 谷胱甘肽的情况下又得到了麦角固醇，做到了产业链的良好延伸，谷胱甘肽产 量930mg/L-1561mg/L，但从GSH的产量来看结果仍不理想，并且乙醇含量的控 制仍然存在滞后的问题。
发明内容 本发明的目的在于提供一种工艺设计更合理、且能够提高谷胱甘 肽产量的酿酒酵母高密度发酵生产还原性谷胱甘肽的方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种酿酒酵母高密度发酵生产还原性谷胱甘肽的方法，包括以下步骤：
a.将斜面酿酒酵母菌种接入摇瓶种子培养基中，在28～32℃温度条件下， 震荡培养10～15小时，震荡频率为100～300rpm；
b.将震荡培养的种子培养液按发酵培养基体积的10％接入发酵培养基，在 温度为28～32℃、初始搅拌转速为50～150rpm、通风比为0.5～1.5VVM条件下 培养6～12小时，当溶解氧低于20％～30％时，提高搅拌转速50～100rpm，使溶 解氧保持在20％～30％以上；
c.按发酵培养基体积的10％接入步骤b中的种子培养液，在温度为28～32 ℃、初始搅拌转速为50～150rpm，之后每过2～4h增加50～150rpm直到升至 500rpm，初始通气量为0.5～1VVM，当转速升至500rpm2～4h后增加至1.5～ 2VVM，在此条件下培养10～14h后，开始按2～6g/l.h均速加入流加培养基， 流加培养基的灭菌参数为：100～110℃，10～20分钟；
当呼吸商RQ值大于0.85时，要仅以RQ为补料依据，立即降低流加补料速 率至原流加补料速率的10％～80％，当RQ小于等于0.85时，每过1～2小时流速 增加10％～50％，同时再以尿素或氨水控制发酵液的pH值在4.5～5.5之间，至 28～36h向发酵液中分别添加2～6mmol/L的甘氨酸、L-谷氨酸和L-半胱氨酸， 并同时开始降温1～6℃，且同时降低流加培养基补料速度的10％～50％，经过36～ 48h发酵停止发酵，此时酵母的生物量干重达到98～128g/L，GSH总量稳定在 1800mg/L～2470mg/L。
上述步骤a中的摇瓶种子培养基，其配方为：葡萄糖20～50g/l；酵母粉3～ 10g/l；(NH4)2HPO4 1～6g/l；MgSO4·7H2O 0.5～1.5g/l；K2HPO4 0.5～2g/l；KH2PO40.5～2g/l。
上述步骤b中的发酵培养基，其配方为：葡萄糖40～70g/l；酵母粉10～ 30g/l；麦芽汁40～80g/l；(NH4)2HPO4 5～16g/l；糖蜜20～50g/l；MgSO4·7H2O 2～6g/l；玉米浆10～30g/l；K2HPO4 0.5～2g/l；KH2PO4 0.5～2g/l；ZnSO4 5～ 15mg/l；FeSO4 5～15mg/l；MnSO4 5～15mg/l；CuSO4 5～15mg/l。
上述步骤c中的流加培养基，其配方为：葡萄糖500～700g/l，酵母粉5～ 20g/l，麦芽汁40～80g/l，玉米浆3～10g/l。
本发明提供的上述酿酒酵母高密度发酵生产还原性谷胱甘肽的方法，对培 养基的配方进行了优化，在过程控制当中实时对发酵尾气进行检测分析，更超 前的预测酵母细胞的代谢情况，为补料提供了更及时、更准确的指导，给出了 更有利于积累谷胱甘肽的工艺技术参数。同时本发明发现在适量添加前体氨基 酸的同时，降低发酵温度和流加补料的速率可以明显提高酵母中GSH的含量， 此方法在发酵的后段可以节省流加补料的用量，降低生产成本。最终GSH含量 可达1800mg/L以上。
具体实施方式 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，实施例中的酿 酒酵母是以从中国工业微生物菌种保藏管理中心购买的1253热带假丝酵母为培 养菌株。
实施例1
a.将摇瓶种子培养基在121℃灭菌30分钟，自然冷却至室温后，接入斜面 酿酒???酵母菌种，在28℃温度条件下，震荡培养15小时，震荡频率为100rpm， 其中：摇瓶种子培养基配方为：葡萄糖50g/l；酵母粉10g/l；(NH4)2HPO4 3g/l； MgSO4·7H2O 1g/l；K2HPO4 0.5g/l；KH2PO4 0.5g/l；
b.将发酵培养基在121℃灭菌30分钟，自然冷却至室温后，将震荡培养的 种子培养液按发酵培养基体积的10％接入，在温度为28℃、初始搅拌转速为 100rpm、通风比为1VVM条件下培养12小时，当溶解氧低于20％时提高搅拌转速 50rpm使溶解氧保持在20％以上。其中：发酵培养基配方为：葡萄糖70g/l；酵 母粉10g/l；麦芽汁80g/l；(NH4)2HPO410g/l；糖蜜20g/l；MgSO4·7H2O4g/l； 玉米浆20g/l；K2HPO41g/l；KH2PO4 1g/l；ZnSO4 10mg/l；FeSO4 5mg/l；MnSO4 5mg/l； CuSO4 5mg/l；
c.将发酵培养基在121℃灭菌30分钟，自然冷却至室温后，按发酵培养基 体积的10％接入步骤b中的种子培养液，在温度为28℃、初始搅拌转速为100rpm， 之后每过2h增加50rpm直到升至500rpm，初始通气量为1VVM，当转速升至500rpm 2h后增加至2VVM，在此条件下培养14h后，开始按2g/l.h均速加入流加培养 基。流加培养基的配方为：葡萄糖700g/l，酵母粉20g/l，麦芽汁80g/l， 玉米浆10g/l。流加培养基的灭菌参数为：100℃，20分钟.
当呼吸商RQ值大于0.85时，要仅以RQ为补料依据，立即降低流加补料速 率至原流加补料速率的80％。当RQ小于等于0.85时，每过1小时流速增加10％。 同时再以尿素控制发酵液的pH值为4.5，至36h向发酵液中分别添加4mmol/L 的甘氨酸、L-谷氨酸和L-半胱氨酸，并同时开始降温1℃，且同时降低流加培 养基补料速度的10％，至48h停止发酵，此时酵母的生物量为108g/L(干重)，GSH 总量为2470mg/L。
实施例2
a.将摇瓶种子培养基在121℃灭菌30分钟，自然冷却至室温后，接入斜面 酿酒酵母菌种，在32℃温度条件下，震荡培养10小时，震荡频率为300rpm， 其中：摇瓶种子培养基配方为：葡萄糖40g/l；酵母粉5g/l；(NH4)2HPO4 1g/l； MgSO4·7H2O 0.5g/l；K2HPO42g/l；KH2PO4 2g/l；
b.将发酵培养基在121℃灭菌30分钟，自然冷却至室温后，将震荡培养的 种子培养液按发酵培养基体积的10％接入，在温度为32℃、初始搅拌转速为 150rpm、通风比为0.5VVM条件下培养6小时，当溶解氧低于25％时提高搅拌转 速150rpm使溶解氧保持在25％以上。其中：发酵培养基配方为：葡萄糖60g/l； 酵母粉30g/l；麦芽汁40g/l；(NH4)2HPO45g/l；糖蜜40g/l；MgSO4·7H2O 2 g/l；玉米浆10g/l；K2HPO40.5g/l；KH2PO4 0.5g/l；ZnSO4 5mg/l；FeSO4 10mg/l； MnSO4 15mg/l；CuSO4 15mg/l；
c.将发酵培养基在121℃灭菌30分钟，自然冷却至室温后，按发酵培养基 体积的10％接入步骤b中的种子培养液，在温度为32℃、初始搅拌转速为150rpm， 之后每过4h增加150rpm直到升至500rpm，初始通气量为0.5VVM，当转速升至 500rpm4h后增加至1.5VVM，在此条件下培养10h后，开始按6g/l.h均速加入 流加培养基。流加培养基的配方为：葡萄糖600g/l，酵母粉10g/l，麦芽汁 60g/l，玉米浆5g/l。流加培养基的灭菌参数为：110℃，10分钟.
当呼吸商RQ值大于0.85时，仅以RQ为补料依据，立即降低流加补料速率 至原流加补料速率的10％。当RQ小于等于0.85时，每过2小时流加补料速率增 加50％。同时再以氨水控制发酵液的pH值为5.5，至28h向发酵液中分别添加 6mmol/L的甘氨酸、L-谷氨酸和L-半胱氨酸，并同时开始降温6℃，且同时降低 流加培养基补料速度的50％，至36h停止发酵，此时酵母的生物量可达到 98g/L(干重)，GSH总量为1895mg/L。
实施例3
a.将摇瓶种子培养基在121℃灭菌30分钟，自然冷却至室温后，接入斜面 酿酒酵母菌种，在30℃温度条件下，震荡培养12小时，震荡频率为150rpm， 其中：摇瓶种子培养基配方为：葡萄糖20g/l；酵母粉3g/l；(NH4)2HPO4 6g/l； MgSO4·7H2O 1.5g/l；K2HPO4 1g/l；KH2PO4 1g/l；
b.将发酵培养基在121℃灭菌30分钟，自然冷却至室温后，将震荡培养的 种子培养液按发酵培养基体积的10％接入，在温度为30℃、初始搅拌转速为 50rpm、通风比为1.5VVM条件下培养8小时，当溶解氧低于30％时提高搅拌转速 100rpm使溶解氧保持在30％以上。其中：发酵培养基配方为：葡萄糖40g/l； 酵母粉20g/l；麦芽汁60g/l；(NH4)2HPO416g/l；糖蜜50g/l；MgSO4·7H2O6 g/l；玉米浆30g/l；K2HPO42g/l；KH2PO4 2g/l；ZnSO4 15mg/l；FeSO4 15mg/l； MnSO410mg/l；CuSO4 10mg/l；
c.将发酵培养基在121℃灭菌30分钟，自然冷却至室温后，按发酵培养基 体积的10％接入步骤b中的种子培养液，在温度为30℃、初始搅拌转速为50rpm， 之后每过3h增加100rpm直到升至500rpm，初始通气量为0.8VVM，当转速升至 500rpm 3h后增加至1.8VVM，在此条件下培养12h后，开始按4g/l.h均速加入 流加培养基。流加培养基的配方为：葡萄糖500g/l，酵母粉5g/l，麦芽汁40g/l， 玉米浆3g/l。流加培养基的灭菌参数为：105℃，15分钟.
当呼吸商RQ值大于0.85时，要仅以RQ为补料依据，立即降低流加补料速 率至原流加补料速率的30％。当RQ小于等于0.85时，每过1.5小时流速增加 30％。同时再以氨水控制发酵液的pH值为5.0，至30h向发酵液中分别添加 2mmol/L的甘氨酸、L-谷氨酸和L-半胱氨酸，并同时开始降温3℃，且同时降低 流加培养基补料速度的20％，至42h停止发酵，此时酵母的生物量为128g/L(干 重)，GSH总量为2080mg/L。
对比实施例1
将实施例1流加培养基配方中的麦芽汁、酵母粉和玉米浆去掉，只以700g/L 的葡萄糖配制补料，其它条件不变。这样导致补料以后，培养基中的营养成分 逐渐单一化，不利于细胞的生长和GSH的积累，最终下罐结果为：生物量50g/L (细胞干重)，GSH含量452mg/L。
对比实施例2
在实施例2中，28h添加氨基酸后，同时降温6℃，现将降温6℃改为升温 2℃，其它条件不变。由于环境温度的改变，使GSH的积累受到了严重影响，最 终下罐结果为：生物量80g/L(细胞干重)，GSH含量352mg/L。
对比实施例3
在实施例3中添加氨基酸为2mmol/L，现将添加量升高为12mmol/L.改变氨 基酸添加量后的最终下罐结果为：生物量75g/L(细胞干重)，GSH含量630mg/L。
对比实施例4
在实施例3中发酵至30h时，将流加补料的速率降低了20％，现将流加补料 的速率升高20％，其它条件不变。最终下罐结果为：生物量65g/L(细胞干重)，GSH 含量430mg/L。