技术领域
本发明涉及piRNA，具体涉及一种用于检测胃组织的高表达piRNA探针及其检测 方法。
背景技术
真核基因组中除了有编码蛋白质的基因外，还有一大部分DNA被转录成非编码 RNA(noncoding RNAs，ncRNAs)。近年来的研究发现，许多ncRNA可在多个层次上调 节着基因的表达，特别是小RNA在基因表达调控中的作用及其与疾病发生、发展的关 系越来越引起了人们的重视。前期研究已经发现了2类对基因表达有重要调控作用的小 RNA——短干扰RNA(short interfering RNA，siRNA)和微小RNA(microRNA，miRNA)。
2006年俄罗斯、日本和美国的四家实验室几乎同时报道，在生物体内存在除siRNA 和miRNA以外的另一类小RNA。这些小RNA与前2类小RNA的主要区别在于其长度 更长(约为30个核苷酸)和采用不同的机制实现对基因表达的调控。因此，这类RNA 被称为第三类小RNA。目前已从多种生物中发现了第三类小RNA。研究发现，它们可 与小鼠和大鼠的阿格蛋白亚家族Piwi相互作用，因此根据其功能将其命名为Piwi相互 作用RNA(Piwi-interacting RNA，piRNA)。
阿格蛋白(argonaute protein)的主要功能与小分子RNA相关的基因沉默作用有密 切关系。RNA沉默作用通过降解mRNA、抑制翻译和重建染色体等方式调节基因的表 达。RNA沉默主要通过RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC) 和转录的基因沉默RNA诱导起始复合物(RNA-induced initiation of transcriptional gene silencing，RITS)来发挥作用。这些复合物的主要成分包括小分子RNA和阿格蛋白。阿 格蛋白家族是在所有RISC和RITS复合物中均存在的唯一共同成分。这说明阿格蛋白 在小分子RNA相关的RNA沉默机制中具有独特的功能。也说明piRNA在基因表达调 控中起着重要作用。
我国是胃癌高发区，现有的技术中均没有涉及到胃组织的癌变与哪些高表达的 piRNA有关。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用于检测胃癌组织的piRNA异常表达的探 针，还提供了利用该探针检测胃癌组织的piRNA高表达的方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种用于胃组织的高表达piRNA 探针，探针的序列由化学修饰过的寡聚核苷酸编码片段和延伸臂片段组成，所述的寡聚 核苷酸编码片段为至少一种下述piRNA序列：hsa_piR_009466，hsa_piR_005270， hsa_piR_000663，hsa_piR_012518，hsa_piR_001302，hsa_piR_000562，hsa_piR_001048， hsa_piR_002062和hsa_piR_011186。
所述的寡聚核苷酸编码片段为hsa piR_009466序列。
所述的寡聚核苷酸编码片段为hsa_piR_009466序列和hsa_piR_005270序列组成。
所述的寡聚核苷酸编码片段为hsa_piR_009466序列、hsa_piR_005270序列和 hsa_piR_000663序列组成。
所述的寡聚核苷酸编码片段还包括下述piRNA序列：hsa_piR_001809， hsa_piR_000139，hsa_piR_001184，hsa_piR_001205，hsa_piR_001318，hsa_piR_011187， hsa_piR_000775和hsa_piR_000651。
所述的寡聚核苷酸编码片段为hsa_piR_009466序列和hsa_piR_001809序列组成。
所述的寡聚核苷酸编码片段还包括下述piRNA序列：hsa_piR_001040， hsa_piR_001159，hsa_piR_000823，hsa_piR_000121、hsa_piR_001934，hsa_piR_000794， hsa_piR_000441和hsa_piR_000560。
所述的寡聚核苷酸编码片段为hsa_piR_009466序列和hsa_piR_001040序列组成。
所述的寡聚核苷酸编码片段为hsa_piR_009466序列、hsa_piR_001809序列和 hsa_piR_001040序列组成。
寡聚核苷酸编码片段也可以为下述piRNA序列组成：hsa_piR_009466、 hsa_piR_005270、hsa_piR_000663、hsa_piR_012518、hsa_piR_001302、hsa_piR_000562、 hsa_piR_001048、hsa_piR_002062、hsa_piR_011186、hsa_piR_001809、hsa_piR_000139、 hsa_piR_001184、hsa_piR_001205、hsa_piR_001318、hsa_piR_011187、hsa_piR_000775、 hsa_piR_000651、hsa_piR_001040、hsa_piR_001159、hsa_piR_000823、hsa_piR_000121、 hsa_piR_001934、hsa_piR_000794、hsa_piR_000441和hsa_piR_000560。
一种用上述高表达探针检测胃癌组织的piRNA的方法，依次包括总RNA提取、总 RNA质量分析、微离心过滤得到小RNA样品、添加Poly(A)聚合酶和用Cy3和Cy5特 异性荧光标记小RNA样品步骤，用所述的高表达piRNA探针对荧光标记的小RNA样 品杂交检测。
化学修饰过的寡聚核苷酸编码片段能与靶piRNA互补杂交；延伸臂片段能使与它 连接的编码片段离片基有一定的距离，减少杂交空间阻碍；探针杂交的Tm值是通过化 学修饰来平衡的。
探针是为光敏试剂原位合成的微流体芯片；piR＝piRNA。
上述piRNA在RNA基因数据库中都能找到，延伸臂片段可以用分子生物学上能减 少杂交空间阻碍的任何延伸臂片段。
与现有技术相比，本发明的优点在于用于胃组织的高表达piRNA探针，探针的序列 由化学修饰过的寡聚核苷酸编码片段和延伸臂片段组成，寡聚核苷酸编码片段为至少一 种下述piRNA序列：hsa_piR_009466，hsa_piR_005270，hsa_piR_000663，hsa_piR_012518， hsa_piR_001302，hsa_piR_000562，hsa_piR_001048，hsa_piR_002062和hsa_piR_011186， 探针能对胃组织的piRNA进行杂交检测，能检测出异常高表达的piRNA，在癌变的胃组 织中探针组成的每种piRNA的量就比正常的胃组织的每种piRNA的量高出许多，piRNA 探针从而就检测出胃癌组织中piRNA异常变异，作为胃组织发生癌变的一种诊断标志， piRNA进一步可作为设计定向胃癌药物的靶点，因此本发明为胃癌的诊断和定向治疗提 供了有利的依据。hsa_piR_001809，hsa_piR_000139，hsa_piR_001184，hsa_piR_001205， hsa_piR_001318，hsa_piR_011187，hsa_piR_000775和hsa_piR_000651和hsa_piR_001040， hsa_piR_001159，hsa_piR_000823，hsa_piR_000121、hsa_piR_001934，hsa_piR_000794， hsa_piR_000441和hsa_piR_000560的任一序列也是组成用于胃组织的高表达piRNA探针 的聚核苷酸编码片段的成份；也能检测出胃癌组织中piRNA异常变异。
附图说明
图1为胃癌旁组织piRNA探针检测照片；
图2为胃癌组织piRNA探针检测照片；
图3为胃癌组织与胃癌旁组织piRNA探针检测差异比较照片。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
一种用于胃组织的高表达piRNA探针，为光敏试剂原位合成的微流体芯片，探针 的序列由化学修饰过的寡聚核苷酸编码片段和延伸臂片段组成，其中寡聚核苷酸编码片 段为hsa_piR_009466序列。
实施例2
一种用于胃组织的高表达piRNA探针，与实施例1基本相同，所不同的只是寡聚 核苷酸编码片段为hsa_piR_005270序列。
实施例3
一种用于胃组织的高表达piRNA探针，与实施例1基本相同，所不同的只是寡聚 核苷酸编码片段为hsa_piR_009466序列和hsa_piR_005270序列组成。
实施例4
一种用于胃组织的高表达piRNA探针，与实施例1基本相同，所不同的只是寡聚 核苷酸编码片段为hsa_piR_009466序列、hsa_piR_005270序列和hsa_piR_000663序列 组成。
实施例5
一种用于胃组织的高表达piRNA探针，与实施例1基本相同，所不同的只是寡聚 核苷酸编码片段为hsa_piR_009466序列、hsa_piR_005270序列、hsa_piR_000663序列 和hsa_piR_001809序列组成。
实施例6
一种用于胃组织的高表达piRNA探针，与实施例1基本相同，所不同的只是寡聚 核苷酸编码片段为hsa_piR_009466序列和hsa_piR_001809序列组成。
实施例7
一种用于胃组织的高表达piRNA探针，与实施例1基本相同，所不同的只是寡聚 核苷酸编码片段为hsa_piR_009466序列、hsa_piR_001809序列和hsa_piR_001040序列 组成。
实施例8
一种用于胃组织的高表达piRNA探针，与实施例1基本相同，所不同的只是寡聚 核苷酸编码片段为hsa_piR_009466序列、hsa_piR_005270序列和hsa_piR_001040序列 组成。
实施例9
一种用于胃组织的高表达piRNA探针，与实施例1基本相同，所不同的只是寡聚 核苷酸编码片段为下述piRNA序列组成：hsa_piR_009466、hsa_piR_005270、 hsa_piR_000663、hsa_piR_012518、hsa_piR_001302、hsa_piR_000562、hsa_piR_001048、 hsa_piR_002062、hsa_piR_011186、hsa_piR_001809、hsa_piR_000139、hsa_piR_001184、 hsa_piR_001205、hsa_piR_001318、hsa_piR_011187、hsa_piR_000775、hsa_piR_000651、 hsa_piR_001040、hsa_piR_001159、hsa_piR_000823、hsa_piR_000121、hsa_piR_001934、 hsa_piR_000794、hsa_piR_000441和hsa_piR_000560。
寡聚核苷酸编码片段能与靶piRNA互补，延伸臂片段能使与它连接的编码片段离 片基有一定的距离，减少杂交空间阻碍，探针杂交的Tm值是通过化学修饰来平衡的， 探针是由光敏试剂原位合成为微流体芯片。
实施例10
一种用piRNA探针检测胃组织的高表达piRNA的方法，依次包括(1)总RNA提取： 各自称取100mg胃癌组织和胃癌旁组织，分别加入到液氮中研磨至干粉状→加1ml Trizol→继续研磨至匀浆→转入1.5ml离心管中→12000×g离心10min→收集上清至新离 心管中→室温放置5min→加入0.2ml氯仿→涡旋15-30s→室温放置3min→12000×g离 心15min→收集上清→加两倍上清体积的异丙醇→-20℃沉淀过夜→12000×g离心 15min，去上清→加1ml含有DEPC水75％乙醇(预冷)→7500×g离心5min→倒尽液体， 轻微离心，除去管底残液→自然干燥3min→沉淀重溶于50μl DEPC·H2O，得到各自的 总RNA；(2)总RNA质量分析：通过A230、A260、A280检测，以及对各自的总RNA 采用琼脂糖凝胶电泳，根据18S rRNA和28S rRNA的比值分析总RNA质量；(3)微离心 过滤得到小RNA样品：对各自的总RNA用微离心过滤柱过滤，分别得到片段小于300 nt的胃癌组织小RNA样品和胃癌旁组织小RNA样品；(4)在胃癌组织小RNA样品和胃 癌旁组织小RNA样品中分别添加Poly(A)聚合酶：使小RNA 3′端加上poly(A)尾巴； 用Cy3和Cy5特异性荧光标记分别标记胃癌组织小RNA样品和胃癌旁组织小RNA 样品：先用一个寡聚核苷酸与这个poly(A)尾巴连接，然后加入Cy3和Cy5特异性荧 光标记；(5)用本发明的高表达piRNA探针分别对荧光标记的胃癌组织小RNA样品和胃 癌旁组织小RNA样品进行杂交检测：把各自的小RNA样品加入至含有25％的甲酰胺 的100μl 6×SSPE缓冲液中(0.90M NaCl，60mM Na2HPO4，6mM EDTA，pH 6.8)，然 后置于用实施例1的探针合成的微流体芯片上进行杂交检测，杂交反应仪器为微循环泵 杂交仪，杂交温度为34℃，杂交时间为过一夜后采集杂交图像；杂交图象用激光扫描 仪(GenePix 4000B，Molecular Device)采集，分别得到如附图1和附图2的照片，对两种 样品杂交图象组合差异比较得到如附图3的照片，杂交图像数据处理和分析用 Array-Pro(Media Cybernetics)软件，数据处理和分析首先是扣除背景，计算重复点平均 值和标准偏差，然后通过LOWESS(Locally-Weighted Regression)过滤进行标准化，数 据处理结果采用Hierarchical clustering、K-means/medians clustering或者ANOVA(analysis of variance)等方法，得到如表1的结果；从附图1、附图2和附图3的比较可以看出胃 癌组织的有些piRNA的量比胃癌旁组织的piRNA的量要高，从表1数据处理结果进一 步说明了胃癌组织的piRNA的量比胃癌旁组织的piRNA的量要高许多，因此从胃组织 的piRNA的量的异常提高就可以得出胃组织发生癌变的结果，本发明就为胃癌的诊断 提供了依据，进一步可以选用这些piRNA作为对胃癌进行定向靶点治疗。
表1：胃癌组织和胃癌旁组织的piRNA的表达强度及其相互比较对数值
序号 piRNA名称 癌旁组织 癌组织 log2(癌组织/ 癌旁组织) 1 hsa_piR_009466 1.00 1,445.91 10.50 2 hsa_piR_005270 10.61 874.85 6.37 3 hsa_piR_000663 98.64 2,813.15 4.83 4 hsa_piR_012518 114.67 1,732.59 3.92 5 hsa_piR_001302 139.90 1,772.49 3.66 6 hsa_piR_000562 38.90 329.97 3.08 7 hsa_piR_001048 99.70 833.73 3.06 8 hsa_piR_002062 53.90 388.28 2.85 9 hsa_piR_011186 132.91 535.80 2.01 10 hsa_piR_001809 80.54 292.69 1.86 11 hsa_piR_000139 48.88 174.94 1.84 12 hsa_piR_001184 1,200.04 3,893.66 1.70 13 hsa_piR_001205 115.80 374.80 1.69 14 hsa_piR_001318 2,605.71 7,721.21 1.57 15 hsa_piR_011187 200.44 593.80 1.57 16 hsa_piR_000775 1,788.99 5,259.26 1.56 17 hsa_piR_000651 2,674.20 6,233.82 1.22 18 hsa_piR_001040 1,381.62 2,959.81 1.10 19 hsa_piR_001159 4,483.73 9,513.94 1.09 20 hsa_piR_000823 9,696.26 19,333.64 1.00 21 hsa_piR_000121 407.96 714.37 0.81 22 hsa_piR_001934 686.26 1,169.26 0.77 23 hsa_piR_000794 5,269.06 7,535.16 0.52 24 hsa_piR_000441 8,006.39 10,364.01 0.37 25 hsa_piR_000560 8,297.56 10,614.31 0.36