相关申请
根据35 U.S.C.§119(e)，本申请要求2009年3月6日提交的美国临时 申请No.61/158,216的优先权，其内容通过引用全文并入本文。
政府利益
本申请是在政府支持(国家自然科学基金资助号为EEC0540879) 下进行的。政府拥有本发明的某些权利。
技术领域
本发明涉及通过重组基因表达来生产3-羟基酸，例如3，4-二羟基丁 酸和3-羟基丁内酯。
背景技术
3，4-二羟基丁酸(DHBA)和3-羟基丁内酯(3-HBL)是非常有用的 手性中间体，可用于合成他汀类药物(如和)、 肉碱和其它精细化学品。在2003年和2004年，他汀类药物每年的市场 估计是100-150亿美元，而肉碱(用作维生素补充剂)的年需求量估计 为几百吨。DHBA和3-HBL还可容易地衍生为有价值的化合物例如肉 碱，每克肉碱的成本为约5美元，其用作维生素和营养补充剂。
目前尚无市售的DHBA，而3-HBL的成本为每克30-100美元。这 些化合物的高成本和低可得性提高了他汀类药物的成本。现有的DHBA 和3-HBL合成方法依赖于原始的苛刻的化学合成方法，例如苹果酸的 苛性还原或者用酸分解各种己糖。这些化学合成方法产生几种副产物， 需要对DHBA或3-HBL产物进行复杂纯化。这些缺点使DHBA和 3-HBL的化学合成相对缺乏吸引力且不经济。
发明内容
本文描述了在细胞(例如大肠杆菌(E.coli)细胞)中制备3-羟基 酸(例如3，4-二羟基丁酸(DHBA)和3-羟基丁内酯(3-HBL))的高效 的生物学方法。所述方法色括利用重组表达(1)pct基因、(2)phaA、 thil、atoB或bktB基因中至少之一和(3)phaB、S1或hbd基因中至少 之一并且任选地重组表达tesB基因和/或编码乙醇酸还原酶之基因的细 胞作为合成DHBA和3-HBL的高效和有成本效益的工具。
本发明的方面涉及重组表达(1)pct基因、(2)phaA、thil、atoB 或bktB基因中至少之一和(3)phaB或hbd基因中至少之一的细胞。 在某些实施方案中，所述细胞还重组表达tesB基因和/或编码乙醇酸还 原酶的基因。所述细胞可以是细菌细胞、真菌细胞(包括酵母细胞)、 植物细胞、昆虫细胞或动物细胞。在一些实施方案中，所述细胞是细菌 细胞，例如大肠杆菌(Escherichia coli)细胞。
或者，应当理解的是，并非所有的基因都需要在与本发明方法相关 的细胞中重组表达。在其中一个或更多个与本发明相关之基因在细胞中 内源性表达的实施方案中，则细胞不必需要重组表达在所述细胞中内源 性表达的一个或更多个基因。在这些实施方案中，所述细胞可另外重组 表达所述通路中未在所述细胞中内源性表达的任意基因。
在一些实施方案中，所述pct、phaA、thil、atoB、bktB、phaB、hbd、 tesB和乙醇酸还原酶基因中的一种或更多种由一种或更多种质粒表达。 在一些实施方案中，所述pct、phaA、thil、atoB、bktB、phaB、hbd、 tesB和乙醇酸还原酶基因中的一种或更多种被整合到所述细胞的基因 组中。在某些实施方案中，所述phaA、bktB和/或phaB基因是真养雷 氏菌(Ralstonia eutropha)基因，例如真养雷氏菌H16基因。在某些实 施方案中，所述pct基因是埃氏巨球形菌(Megasphaera elsdenii)基因 例如埃氏巨球形菌BE2-2083基因。在某些实施方案中，所述tesB基因 是大肠杆菌(Escherichia Coli)基因，例如大肠杆菌K12基因。在一些 实施方案中，所述编码乙醇酸还原酶的基因是假单胞菌属 (Pseudomonas)基因或酵母属(Saccharomyces)基因。
本发明的某些方面涉及生产DHBA和/或3-HBL的方法，所述方法 包括培养与本发明相关的细胞来生产DHBA和/或3-HBL，并任选地从 所述细胞回收DHBA和/或3-HBL。在一些实施方案中，所述细胞是在 葡萄糖和/或乙醇酸和/或丙酸的存在下培养的。
本发明的一些方面涉及制备具有提高的DHBA和/或3-HBL生产的 细胞的方法，包括在所述细胞中重组表达(1)pct基因、(2)phaA、thil、 atoB或bktB基因中至少之一以及(3)phaB或hbd基因中至少之一。 在一些实施方案中，所述细胞还重组表达tesB基因和/或编码乙醇酸还 原酶的基因。在一些实施方案中，为所述细胞提供葡萄糖和/或乙醇酸 和/或丙酸。所述细胞可以是细菌细胞、真菌细胞(包括酵母细胞)、植 物细胞、昆虫细胞或动物细胞。在一些实施方案中，所述细胞是细菌细 胞，例如大肠杆菌细胞。在一些实施方案中，所述细胞表达recA和/或 endA。在某些实施方案中，所述细胞是大肠杆菌MG1655(DE3)细胞。
在一些实施方案中，所述pct、phaA、thil、atoB、bktB、phaB、hbd、 tesB和乙醇酸还原酶基因中的一种或更多种由一种或更多种质粒表达。 在一些实施方案中，所述pct、phaA、thil、atoB、bktB、phaB、hbd、 tesB和乙醇酸还原酶基因中的一种或更多种被整合到所述细胞的基因 组中。在某些实施方案中，所述phaA、bktB和/或phaB基因是真养雷 氏菌基因，例如真养雷氏菌H16基因。在某些实施方案中，所述pct基 因是埃氏巨球形菌基因，例如埃氏巨球形菌BE2-2083基因。在某些实 施方案中，所述tesB基因是大肠杆菌基因，例如大肠杆菌K12基因。 在一些实施方案中，所述编码乙醇酸还原酶的基因是假单胞菌属基因或 酵母属基因。
本发明的一些方面涉及由细胞培养物产生的DHBA，其中所述细胞 培养物中的细胞已被基因修饰以重组表达(1)pct基因、(2)phaA、thil、 atoB或bktB基因中至少之一和(3)phaB或hbd基因中至少之一。在 一些实施方案中，所述细胞还重组表达tesB基因和/或乙醇酸还原酶。 在一些实施方案中，为所述细胞提供葡萄糖和/或乙醇酸。所述细胞可 以是细菌细胞、真菌细胞(包括酵母细胞)、植物细胞、昆虫细胞或动 物细胞。在一些实施方案中，所述细胞是细菌细胞，例如大肠杆菌细胞。
在一些实施方案中，所述pct、phaA、thil、atoB、bktB、phaB、hbd、 tesB和乙醇酸还原酶基因中的一种或更多种由一种或更多种质粒表达。 在一些实施方案中，所述pct、phaA、thil、atoB、bktB、phaB、hbd、 tesB和乙醇酸还原酶基因中的一种或更多种被整合到所述细胞的基因 组中。在某些实施方案中，所述phaA、bktB和/或phaB基因是真养雷 氏菌基因，例如真养雷氏菌H16基因。在某些实施方案中，所述pct基 因是埃氏巨球形菌基因，例如埃氏巨球形菌BE2-2083基因。在某些实 施方案中，所述tesB基因是大肠杆菌基因，例如大肠杆菌K12基因。 在一些实施方案中，所述编码乙醇酸还原酶的基因是假单胞菌属基因或 酵母属基因。
本发明的一些方面涉及由细胞培养物产生的3-HBL，其中所述细胞 培养物中的细胞已被基因修饰以重组表达(1)pct基因、(2)phaA、thil、 atoB或bktB基因中至少之一和(3)phaB或hbd基因中至少之一。在 一些实施方案中，所述细胞还重组表达tesB基因和/或乙醇酸还原酶。 在一些实施方案中，为所述细胞提供葡萄糖和/或乙醇酸。所述细胞可 以是细菌细胞、真菌细胞(包括酵母细胞)、植物细胞、昆虫细胞或动 物细胞。在一些实施方案中，所述细胞是细菌细胞，例如大肠杆菌细胞。
在一些实施方案中，所述pct、phaA、thil、atoB、bktB、phaB、hbd、 tesB和乙醇酸还原酶基因中的一种或更多种由一种或更多种质粒表达。 在一些实施方案中，所述pct、phaA、thil、atoB、bktB、phaB、hbd、 tesB和乙醇酸还原酶基因中的一种或更多种被整合到所述细胞的基因 组中。在某些实施方案中，所述phaA、bktB和/或phaB基因是真养雷 氏菌基因，例如真养雷氏菌H16基因。在某些实施方案中，所述pct基 因是埃氏巨球形菌基因，例如埃氏巨球形菌BE2-2083基因。在某些实 施方案中，所述tesB基因是大肠杆菌基因，例如大肠杆菌K12基因。 在一些实施方案中，所述编码乙醇酸还原酶的基因是假单胞菌属基因或 酵母属基因。
在一些实施方案中，表达本文所述重组途径的细胞还表达recA和/ 或endA。在某些实施方案中，所述细胞是大肠杆菌MG1655(DE3)细 胞。在一些实施方案中，对本文所述重组细胞的细胞培养物的上清液进 行内酯化。
本发明的一些方面涉及通过培养与发明相关的任意细胞而产生的 细胞培养物。在一些实施方案中，所述细胞培养物包含至少200mg L-1DHBA。在某些实施方案中，所述细胞培养物包含至少1gL-1DHBA。 在一些实施方案中，所述细胞培养物包含至少10mg L-13-HBL。在某些 实施方案中，所述细胞培养物包含至少100mg L-1或至少500mg L-1 3-HBL。
本发明的一些方面涉及通过培养与发明相关的任意细胞而产生的 细胞培养物的上清液。在一些实施方案中，所述上清液包含至少200mg L-1DHBA。在某些实施方案中，所述上清液包含至少1g L-1DHBA。在 一些实施方案中，所述上清液包含至少10mg L-13-HBL。在某些实施方 案中，所述上清液包含至少100mg L-1或至少500mg L-13-HBL。在一 些实施方案中，对所述上清液进行内酯化。在某些实施方案中，内酯化 是通过酸化以降低所述上清液的pH来实现的。在一些实施方案中，内 酯化是通过DHBA-CoA的自身内酯化来实现的。
附图说明
附图不是旨在按比例绘制的。在附图中，各个图中示例的每个相同 或几乎相同的要素以相似的数字表示。为清楚起见，并非每一个要素都 可标记在每一附图中。在附图中：
图1是描述3-羟基链烷酸途径的示意图。pct的存在产生与乙酰CoA 缩合反应中使用的酰基CoA分子。
图2是描述对本文所用的3-羟基链烷酸途径进行改动以用于合成 DHBA的示意图。
图3是描述通过表达tesB、pct、3种乙酰乙酰-CoA硫解酶(thil、 bktB或phaA)之一以及两种3-羟基丁酰基-CoA还原酶(phaB或hbd) 之一的重组大肠杆菌来生产3HV的图。
图4描述3HV甲酯的HPLC谱。图4A代表含有两种立体异构体(洗 脱时间为6.9和9.2分钟)的外消旋3HV标准品；图4B是来自表达ptb-buk、 phaB和bktB的大肠杆菌的培养基，出峰时间为6.9分钟；图4C是来自表 达ptb-buk、hbd、bktB和tesB的大肠杆菌的培养基，出峰时间为9.2分钟。 与pct相似，所述ptb-buk操纵子编码丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)的磷酸丁酰转移酶(phosphotransbutyrase，ptb)和丁酰 激酶(butyrokinase，buk)，其作用是由丙酸产生高水平的丙酰CoA。所 有样品在HPLC分析之前在酸性甲醇中煮沸以形成3HV甲酯。使用与该 手性HPLC分析方案相同的方案进行的手性3HB实验强烈表明6.9分钟和 9.2分钟的峰分别代表(R)-3HV和(S)-3HV。
图5描述表达不同3-羟基链烷酸途径基因的重组大肠杆菌MG1655 (DE3)endA-recA-中DHBA(左栏)和3-HBL(右栏)的产量。每个途 径中所用的具体基因以X轴表示。
图6是显示证明重组大肠杆菌所产生的DHBA产量的液相色谱一质谱 (LC/MS)谱图的图。“A”线表示DHBA标准品，而“B”线是表达phaA、 phaB、pct和tesB的重组大肠杆菌所产生的DHBA。“C”线是阴性对照。 MS信号是m/z＝138的离子曲线，其表示质子化DHBA的铵加合物。
图7是显示证明重组大肠杆菌所产生的3-HBL产量的液相色谱一质谱 (LC/MS)谱图的图。“A”线表示3-HBL+DHBA标准品，而“B”线是 在乙醇酸和葡萄糖存在下表达phaA、phaB、pct和tesB的重组大肠杆菌培 养物所产生的3-HBL。“C”线是阴性对照。MS信号是m/z＝120的离子 曲线。
图8描述在存在或不存在tesB的情形下表达不同3-羟基链烷酸途径基 因的重组大肠杆菌MG1655(DE3)endA-recA-中DHBA(左栏)和3-HBL (右栏)的产量。每个途径中所用的具体基因显示在X轴上。
图9描述在tesB和pct存在下表达不同3-羟基链烷酸途径基因的重组 大肠杆菌MG1655(DE3)endA-recA-中DHBA(左栏)和3-HBL(右栏) 的产量。右侧三个样品表示当用酸处理左侧三个样品时所达到的产物滴 度。每个途径中所用的具体的乙酰乙酰CoA硫解酶和3-羟基丁酰CoA还 原酶显示在X轴上。
图10描述96小时后表达bktB、phaB、pct和tesB的重组大肠杆菌 MG1655(DE3)中3-羟基链烷酸途径的产量谱。显示了11种独立培养物 所消耗的葡萄糖和乙醇酸的平均水平以及醋酸、3HB、DHBA和3-HBL 的平均水平，误差线表示标准差。
图11描述96小时后表达bktB、phaB、pct和tesB的重组大肠杆菌 MG1655(DE3)的最高产培养物中DHBA(左栏)和3-HBL(右栏)的 产量。对该培养物进行过夜酸处理以催化内酯化，所得DHBA和3-HBL 水平显示在该图右侧。
图12描述由葡萄糖和乙醇酸生产DHBA和3-HBL的3-羟基链烷酸途 径方案，标出了DHBA-CoA的分支点。随着重组tesB的表达，该途径产 生的DHBA比3-HBL多(图8)，然而，在无tesB的情形下，产生更多的 3-HBL，几乎不产生DHBA，这表明DHBA-CoA可在体内自身内酯化为 3-HBL。在此，所述途径以bktB和phaB表示乙酰乙酰CoA硫解酶和3- 羟基丁酰基CoA还原酶，因为显示这对基因产生的DHBA和3-HBL水平 最高(图5)。
图13描述含有pct(右栏，pct-tesB)和没有pct(左栏，tesB)的大肠 杆菌MG1655(DE3)recA-endA-中3-羟基链烷酸途径48小时后的醋酸产 量。无pct的实验是一式三份进行的，而那些含有pct的实验代表单次试验。
具体实施方式
之前用于合成DHBA和3-HBL的方法依赖于原始的苛性的化学合成 方法，而生物生产DHBA和3-HBL尚未被认为是一种选择。事实上，尽 管能源部的最近报告已将3-HBL列入来自生物质的十大增值化学品中 (Werpy和Petersen，2004)，但是这份报告还声称用于3-HBL合成的生 物途径是“不太可行”的，而提倡开发更好的3-HBL化学合成方法。本文 描述了可以通过涉及细胞中重组基因表达的生物学方法来产生DHBA和 3-HBL这一出乎意料的发现。本发明的方法和组合物涉及在重组表达一种 或多种基因(包括pct、phaA、thil、atoB、bktB、phaB、S1、hbd和tesB) 的细胞中生产DHBA和3-HBL。该系统代表了生产具有广泛应用的DHBA 和3-HBL分子的一种高效的新方法。
本发明的应用不限于其在下文说明书所述或附图所举例说明的对 要素的组织和安排的细节上。本发明能够用于其它实施方案并且可以多 种方式实施或进行。此外，本文所用的短语和术语是用于描述的目的， 而不应被视为限定。本文所用的“包括”、“包含”或“具有”、“含有”、 “涉及”及其变化形式旨在包括下文列举的项目及其等同物以及其它项 目。
3-羟基链烷酸途径
本文所述的方法和组合物应用3-羟基链烷酸途径从糖及糖衍生底物 合成3-羟基酸(例如3-羟基丁内酯(3-HBL)和/或其水解形式3，4-二羟 基丁酸(DHBA))。本文所用的“羟基酸”指同时含有羧基和羟基部分 的化合物。
图1代表3-羟基链烷酸途径的示意图。在与本发明相关的方法和组 合物中，使用一种或更多种乙酰乙酰CoA硫解酶(例如thil、bktB、phaA 或atoB)来进行缩合反应，以得到3-酮脂酰CoA中间体，其随后通过 phaB或hbd进行还原而得到3-羟基酰基CoA化合物。任选地，可以通 过tesB将CoA部分从3-羟基酰基CoA化合物上水解下来，释放出游离 的3-羟基酸。
可用作该途径底物的短链酰基CoA化合物是大肠杆菌中不易获得的 代谢物。为了回避这一点，使用具有广泛底物特异性的酶即丙酰CoA转移 酶(pct)来在短链有机酸之间替换CoA部分。在本文所述的方法和组合 物中，使用pct来将CoA从酰基CoA上转移至到提供给所述细胞的底物 (例如酸)上，形成该途径所用的酰基CoA。在一些实施方案中，使用磷 酸丁酰转移酶(ptb)基因和丁酰激酶(buk)基因而不是pct来制备丙 酰CoA。
在一些实施方案中，所述底物是丙酸，并且所述途径产生的产物是3- 羟基戊酸(3HV)。在另一些实施方案中，所述底物是乙醇酸并且所述途径 产生的产物是3-HBL和/或DHBA。应该理解，其它底物也可以与本发明 的一些方面相容，对于本领域普通技术人员而言显而易见的是，可以同时 使用一种以上的底物。在一些实施方案中，还提供了葡萄糖。在一些实施 方案中，在表达bktB-phaB、phaA-phaB、bktB-hbd或thil-phaB的培养物 中产生3HV和/或DHBA和/或3-HBL。
本发明的一些方面涉及编码所述3-羟基链烷酸途径中一种或更多种酶 的一种或多种基因的重组表达。与此途径相关的酶包括硫解酶(由thil、 bktB、phaA或atoB编码)和还原酶(phaB、hbd或S1)。本发明的一些 方面还涉及丙酰CoA转移酶(由pct编码)和硫酯酶B(由tesB编码)的 重组表达。在一些实施方案中，与本发明相关的细胞还重组表达编码乙醇 酸还原酶的基因。
根据本发明的一些方面，提供了重组表达与本发明相关的一种或更多 种基因的细胞以及所述细胞在生产DHBA和3-HBL中的用途。应当理解， 与本发明相关的基因可以从多种来源获得。在一些实施方案中，所述phaA、 phaB和bktB基因是从真氧雷氏菌菌株(例如真氧雷氏菌H16)获得的， 所述tesB基因是从大肠杆菌菌株(例如大肠杆菌K12)获得的，所述pct 基因是从埃氏巨球形菌菌株(例如埃氏巨球形菌BE2-2083)获得的，所述 atoB基因是从恶臭假单胞菌(P.putida)菌株(例如恶臭假单胞菌KT2440) 获得的，所述hbd和thil基因是从丙酮丁醇梭菌菌株(例如丙酮丁醇梭菌 824)获得的，以及所述S1基因是从木兰假丝酵母(C.magnolia)菌株获 得的。在其中表达ptb和buk而不是pct的一些实施方案中，所述ptb和 buk基因在一个操纵子中共表达。在一些实施方案中，所述ptb-buk操纵子 是从丙酮丁醇梭菌获得的。在一些实施方案中，所述phaA基因的序列以 GenBank登录号P14611表示(Peoples and Sinskey，1989)，所述phaB 基因的序列以GenBank登录号P14697表示(Peoples and Sinskey，1989)， 所述tesB基因的序列以GenBank登录号P23911或ABC97996表示 (Naggert等，1991)，以及所述pct基因的序列以SEQ ID NO：9所述的 序列表示(Taguchi等，2008)。在一些实施方案中，所述ptb基因的序列 以GenBank登录号AAK81016表示。在一些实施方案中，所述buk基因 的序列以GenBank登录号AAK81015表示。应当理解的是，可对本文所 述的任意核酸和/或多肽进行密码子优化，并且以密码子优化的形式重组表 达。
本领域普通技术人员会了解，这些酶的同源基因可从其它物种获得并 可通过同源性检索来识别，例如，通过蛋白质BLAST检索，可在国家生 物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI) 互联网网站(ncbi.nlm.nih.gov)上获得。可由来自包含给定基因的任何 DNA来源的DNA对与发明相关的基因进行PCR扩增。在一些实施方案 中，与本发明相关的基因是合成的。获得编码与本发明相关的酶的基因的 任何方法均与本发明相容。
因此，本发明涉及编码上文所述酶的基因的重组表达、前述功能修 饰和变体，以及与之相关的用途。与本发明相关的核酸的同源性和等位 基因可通过常规技术鉴定。本发明还包括在严格条件下与本文所述核酸 杂交的核酸。本文所用的术语“严格条件”指本领域熟悉的参数。核酸 杂交参数可见于汇编这些方法的参考书，例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，J.Sambrook等编，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989)，或者Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等编，John Wiley & Sons， Inc.，New York。更具体而言，本文所用的严格条件指例如在65℃于杂 交缓冲液(3.5×SSC、0.02％Ficoll、0.02％聚乙烯吡咯烷酮、0.02％牛血 清白蛋白、2.5mM NaH2PO4(pH7)、0.5％SDS、2mM EDTA)中杂交。 SSC是0.15M氯化钠/0.015M柠檬酸钠(PH7)；SDS是十二烷基硫酸 钠，EDTA是乙二胺四乙酸。杂交后，清洗转移DNA所用的膜，例如 在室温下在2×SSC中清洗，然后在高至68℃的温度下清洗 0.1-0.5×SSC/0.1×SDS。
可使用达到相似程度严格性的其它条件、试剂等。本领域技术人员 熟悉这样的条件，因此没有在此给出这些条件。然而，应该理解的是， 本领域技术人员将能够以允许明确鉴定本发明核酸的同源性和等位基 因(例如通过使用较不严格的条件)的方式操纵所述条件。技术人员也 熟悉筛选用于表达这些分子的细胞和文库的方法，随后将所述分子进行 常规分离，然后分离出相关的核酸分子并测序。
一般而言，同源性和等位基因通常与核酸和多肽序列分别具有至少 75％核苷酸同一性和/或至少90％氨基酸同一性，在一些情形下，将具 有至少90％核苷酸同一性和/或至少95％氨基酸同一性，在另一些实施 方案中，将具有至少95％核苷酸同一性和/或至少99％氨基酸同一性。 同源性可利用NCBI(Bethesda，Maryland)开发的多种公众可获得的 软件工具(其可从NCBI互联网网站上获得)来计算。示例性的工具包 括BLAST软件，其也可从NCBI互联网网站(www.ncbi.nlm.nih.gov) 获得。成对(pairwise)比对和ClustalW比对(BLOSUM30矩阵设置) 以及Kyte-Doolittle假设分析可利用MacVector序列分析软件(Oxford Molecular Group)获得。前述核酸的Watson-Crick互补序列也包括在 本发明内。
本发明还包括简并核酸，其包括存在于天然物质中的那些密码子的 替代密码子。例如，丝氨酸残基由密码子TCA、AGT、TCC、TCG、 TCT和AGC所编码。就编码丝氨酸残基的目的而言，所述六个密码子 中每一个都是等同的。因此，对于本领域普通技术人员而言显而易见的 是，任何编码丝氨酸的核苷酸三联体均可用于在体外或体内指导蛋白质 合成体系将丝氨酸残基引入到正在延长的多肽中。同样，编码其它氨基 酸残基的核苷酸序列三联体包括但不仅限于：CCA、CCC、CCG和CCT (脯氨酸密码子)；CGA、CGC、CGG、CGT、AGA和AGG(精氨酸 密码子)；ACA、ACC、ACG和ACT(苏氨酸密码子)；AAC和AAT (天冬酰胺密码子)；以及ATA、ATC和ATT(异亮氨酸密码子)。其 它氨基酸残基可同样由多个核苷酸序列编码。因此，本发明包括其密码 子序列由于遗传密码的简并性而与生物分离的核酸不同的简并核酸。本 发明还包括密码子优化，以适应宿主细胞的最佳密码子使用。
本发明还提供了经修饰的核酸分子，其包括添加、替换和缺失一个 或更多个核苷酸。在一些优选的实施方案中，这些经修饰的核酸分子和 /或它们编码的多肽保留了未修饰核酸分子和/或多肽的至少一种活性或 功能，例如酶活性。在某些实施方案中，经修饰的核酸分子编码经修饰 的多肽，优选具有如本文其它地方所述保守氨基酸替换的多肽。经修饰 的核酸分子的结构与未经修饰的核酸分子相关，并且在一些优选的实施 方案中，其与未经修饰核酸分子的结构相关性足以使所述经修饰和未经 修饰的核酸分子在本领域技术人员已知的严格条件下杂交。
例如，可制备编码具有单个氨基酸改变的多肽的经修饰核酸分子。 这些核酸分子中的每一个均可具有一个、两个或三个核苷酸替换，但它 们不是对应于本文所述的遗传密码简并性的核苷酸改变。同样，可制备 编码具有两个氨基酸改变(具有例如2-6个核苷酸改变)的多肽的经修 饰核酸分子。本领域技术人员将容易想到多种经修饰的核酸分子(例如 这些核酸分子)，包括例如编码2位和3位、2位和4位、2位和5位、 2位和6位等的密码子中的核苷酸替换。在前文所述的实例中，每种两 氨基酸组合均色括在经修饰核酸分子的组中以及编码氨基酸替换的所 有核苷酸替换中。还可制备编码具有其它替换(即3各或更多个)、添 加或缺失(例如通过引入终止密码或剪接位点)的多肽的其它核酸分子， 并且其包括在本发明中，因为本领域普通技术人员容易想到。可通过常 规实验测试前述任何核酸或多肽对与本文所述核酸和/或多肽的结构关 系或活性的保留。
本发明包括多肽的变体。本文所用的多肽“变体”是包含对所述多 肽原始氨基酸序列进行的一个或更多个修饰的多肽。可对多肽进行产生 变体的修饰，以1)降低或消除多肽的活性；2)增强多肽的特性；3) 为多肽提供新的活性或特性，例如添加抗原表位或添加可检测部分；或 者4)提供相等或更好的分子(例如酶底物)间结合。对多肽的修饰通 常是对编码所述多肽的核酸进行的，并且可包括缺失、点突变、截短， 氨基酸替换和添加氨基酸或非氨基酸部分。或者，修饰可直接对多肽进 行，例如通过切割、添加连接分子、添加可检测部分(如生物素)、添 加脂肪酸等来进行。修饰还包括包含全部或部分氨基酸序列的融合蛋 白。本领域技术人员将熟悉用于预测蛋白质序列变化对蛋白质构象的影 响的方法，并因此可根据已知方法“设计”多肽变体。Dahiyat和Mayo 在Science 278：82-87，1997中描述了这种方法的一个实例，从而可从头 进行蛋白质设计。所述方法可应用于已知的蛋白质，以改变多肽序列的 仅仅一部分。通过应用Dahiyat和Mayo的计算方法，可提出多肽的特 定变体并进行测试，以确定所述变体是否保留了所期望的构象。
通常，变体包括这样的多肽，其被特定修饰以改变与其所期望生理 活性无关的多肽特征。例如，半胱氨酸残基可被替换或缺失，以防止不 想要的二硫键连接。同样，可通过消除表达系统中蛋白酶引起的蛋白质 水解来改变某些氨基酸以增强多肽表达(例如存在KEX2蛋白酶活性的 酵母表达系统中的二碱基的氨基酸残基)。
编码多肽的核酸的突变优选保留所述编码序列的氨基酸读码框，并 且优选不在核酸中产生可能杂交形成二级结构的区域，例如可影响变体 多肽表达的发夹或环。
可通过选择氨基酸替换或者通过在编码多肽的核酸位点上进行随 机诱变来进行突变。然后表达变体多肽并测定一种或更多种活性，以确 定哪个突变为变体多肽提供所期望的特性。可对变体(或非变体多肽) 进行进一步的突变，其对多肽的氨基酸序列是沉默的，但是为在特定宿 主中的翻译提供优选的密码子。用于例如在大肠杆菌中翻译核酸的优选 密码子是本领域普通技术人员众所周知的。还可对基因或cDNA克隆的 非编码序列进行其它突变，以增强多肽的表达。可通过以下步骤测定变 体多肽的活性：将编码变体多肽的基因克隆到细菌或哺乳动物表达载体 中，将所述载体引入合适的宿主细胞中，表达所述变体多肽，以及检测 本文所公开多肽的功能。
技术人员还将认识到，可在多肽中进行保守氨基酸替换来提供上述 多肽的功能等同变体，即保留了所述多肽功能的变体。本文所用的“保 守氨基酸替换”指不改变其中进行了氨基酸替换的蛋白质的相对电荷或 大小特征的氨基酸替换。可根据本领域普通技术人员已知的用于改变多 肽序列的方法来制备变体，例如见于汇编这些方法的参考书中的方法， 例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，J.Sambrook等编，第二 版，Cold Spring Harbor Lab oratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989)，或者Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel 等编，John Wiley & Sons，Inc.，New York。多肽的示例性功能等同变体 包括本文所公开蛋白质的氨基酸序列中的保守氨基酸替换。氨基酸的保 守替换包括在下述组内的氨基酸间进行的替换：(a)M、I、L、V；(b) F、Y、W；(c)K、R、H；(d)A、G；(e)S、T；(f)Q、N；以及 (g)E、D。
通常，当制备变体多肽时，优选少于所有的氨基酸发生改变。当已 知特定氨基酸残基能赋予功能时，这样的氨基酸将不被替换，或者，这 样的氨基酸将被保守氨基酸替换所替代。优选地，当制备变体多肽时， 可改变1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20个残基。进行最少数量的替换通常是优选的。因此，产 生变体多肽的一种方法是用特定的单个氨基酸替换所有其它氨基酸，然 后分析变体的活性，然后用一种或更多种具有所述最佳活性的多肽重复 所述过程。
为了产生功能等同的多肽变体，通常通过改变编码所述多肽的核酸 来对多肽的氨基酸序列进行保守氨基酸替换。这样的替换可通过本领域 普通技术人员已知的多种方法来进行。例如，氨基酸替换可根据Kunkel 的方法通过PCR定向突变、定点诱变(Kunkel，Proc.Nat.Acad.Sci. U.S.A.82：488-492，1985)或者通过化学合成编码多肽的基因来进行。
本发明包括重组表达与发明相关的基因的任何类型细胞，包括原核 和真核细胞。在一些实施方案中，所述细胞是细菌细胞，例如埃希氏菌 属(Escherichia spp.)、链霉菌属(Streptomyces spp.)、发酵单胞菌属 (Zymonas spp.)、醋酸杆菌属(Acetobacter spp.)、枸橼酸杆菌属 (Citrobacter spp.)、集胞蓝细菌属(Synechocystis spp.)、根瘤菌属 (Rhizobium spp.)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium spp.)、棒状杆菌属 (Corynebacterium spp.)、链球菌属(Streptococcus spp.)、黄单胞菌属 (Xanthomonas spp.)、乳酸杆菌属(Lactobacillus spp.)、乳球菌属 (Lactococcus spp.)、芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、产碱菌属(Alcaligenes spp.)、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、气单孢菌属(Aeromonas spp.)、 固氮菌属(Azotobacter spp.)、丛毛单胞菌属(Comamonas spp.)、分枝 杆菌属(Mycobacterium spp.)、红球菌属(Rhodococcus spp.)、葡萄杆 菌属(Gluconobacter spp.)、罗尔斯通菌属(Ralstonia spp.)、嗜酸硫杆 菌属(Acidithiobacillus spp.)、小月菌属(Microlunatus spp.)、地杆菌 属(Geobacter spp.)、地芽孢杆菌属(Geobacillus spp.)、节杆菌属 (Arthrobacter spp.)、黄杆菌属(Flavobacterium spp.)、沙雷菌属 (Serratia spp.)、糖多孢菌属(Saccharopolyspora spp.)、栖热菌属 (Thermus spp.)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas spp.)、色杆菌属 (Chromobacterium spp.)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium spp.)、糖多 孢菌属(Saccharopolyspora spp.)、农杆菌属(Agrobacterium spp.)和 泛菌属(Pantoea spp)。所述细菌细胞可以是革兰氏阴性细胞，例如大 肠埃希氏菌(大肠杆菌)细胞，或者是革兰氏阳性细胞，例如芽孢杆菌 属菌株的细胞。在其它实施方案中，所述细胞是真菌细胞，例如酵母细 胞，例如酵母菌属(Saccharomyces spp.)、裂殖酵母菌属 (Schizosaccharomyces spp.)、毕赤酵母属(Pichia spp.)、法夫酵母属 (Paffia spp.)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces spp.)、念珠菌属 (Candida spp.)、蓝状菌属(Talaromyces spp.)、酒香酵母菌属 (Brettanomyces spp.)、管囊酵母菌属(Pachysolen spp.)、德巴利氏酵 母菌属(Debaryomyces spp.)、耶氏酵母菌属(Yarrowia spp.)和工业多 倍体酵母菌株。优选地，所述酵母菌株是酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株。 真菌的其它实例包括曲霉属(Aspergillus spp.)、青霉属(Pennicilium spp.)、镰刀菌属(Fusarium spp.)、根霉属(Rhizopus spp.)、顶孢霉属 (Acremonium spp.)、脉孢菌属(Neurospora spp.)、类壳属(Sordaria spp.)、巨座壳属(Magnaporthe spp.)、异水霉属(Allomyces spp.)、黑 粉菌属(Ustilago spp.)、灰霉病菌属(Botrytis spp.)和木霉属 (Trichoderma spp.)。在另一些实施方案中，所述细胞是藻类细胞、植 物细胞或哺乳动物细胞。应当理解，与本发明相容的一些细胞可表达与 本发明相关的一个或更多个基因的内源性拷贝以及重组拷贝。在一些实 施方案中，如果细胞具有与本发明相关的一个或更多个基因的内源性拷 贝时，那么所述方法将不必需要添加内源性表达的所述基因的重组拷 贝。在一些实施方案中，所述细胞可内源性表达来自本文所述途径的一 种或更多种酶，并且可重组表达来自本文所述途径的一种或更多种其它 酶，用于高效生产DHBA和/或3-HBL。
在一些实施方案中，与发明相关的一种或多种基因在重组表达载体 中表达。本文所用的“载体”可以是多种核酸中的任何一种：可通过限 制性处理和连接向其中插入所期望的一个或更多个序列，用于在不同遗 传环境中传送或用于在宿主细胞中表达。载体通常由DNA组成，尽管 也可以使用RNA载体。载体包括但不限于质粒、粘粒、噬菌粒、病毒 基因组和人工染色体。
克隆载体是能够自主复制或被整合到宿主细胞基因组中的载体，并 且其特征还在于一个或更多个内切核酸酶限制性位点，所述载体可在此 处以确定的方式切割并且可将所期望的DNA序列连接到其中，从而新 的重组载体保留其在宿主细胞中复制的能力。在质粒的情形下，在宿主 通过有丝分裂进行复制之前，随着质粒拷贝数的增加，所期望的序列可 在宿主细胞(例如宿主细菌)中进行多次复制，或者在每个宿主中在宿 主通过有丝分裂增殖之前仅复制一次。在噬菌体的情形下，可在溶胞期 间进行主动复制，或者在溶源期间进行被动复制。
表达载体是这样的载体，可通过限制性处理和连接向其中插入所期 望的DNA序列，使得其可操作地与调控序列相连并且可表达为RNA 转录产物。载体可还包含一个或更多个标记序列，所述标记序列适于鉴 定已被或未被所述载体转化或转染的细胞。标记包括例如编码增强或降 低对抗生素或其它化合物的抗性或敏感性的蛋白质的基因、编码其活性 可通过本领域中已知的标准方法进行检测的酶(例如β-半乳糖苷酶、 萤光素酶或碱性磷酸酶)的基因以及以可见方式影响所转化或转染细 胞、宿主、集落或噬菌斑的表型的基因(例如绿色荧光蛋白)。优选的 载体是能自主复制和表达与其可操作地连接的DNA片段中的结构基因 产物的那些载体。
当本文所用的编码序列与调控序列以在所述调控序列的影响或控 制下进行所述编码序列的表达或转录的方式通过共价键相连时，它们被 认为是“可操作地”相连。如果期望将所述编码序列翻译成为功能蛋白， 并且如果诱导所述5’调控序列中的启动子导致所述编码序列的转录，并 且如果所述两个DNA序列间连接的性质(1)不导致引入移码突变，(2) 不干扰所述启动子区指导所述编码序列进行转录的能力，并且(3)不 干扰相应RNA转录产物被翻译成蛋白质的能力，则两个DNA序列被认 为是可操作地相连。因此，如果启动子区能实现所述DNA序列的转录 而使所得转录产物可被翻译成所期望的蛋白质或多肽时，则所述启动子 区域将可操作地与编码序列相连。
当编码要求保护的本发明的任何酶的核酸分子在细胞中表达时，多 种转录调控序列(例如启动子/增强子序列)可用于指导其表达。所述 启动子可以是天然启动子，即内源性环境中基因的启动子，其提供正常 的基因表达调控。在一些实施方案中，所述启动子可以是组成型的，即 所述启动子是不受调控的，从而允许其相关基因持续转录。也可使用多 种条件型启动子，例如通过存在或不存在分子来控制的启动子。
基因表达所需的调控序列的精确性质可因种属或细胞类型而不同， 但是必要时通常应包括分别涉及转录和翻译的起始的5’非转录和5’非 翻译序列，例如TATA框、加帽序列、CAAT序列等。特别地，这样的 5’非转录调控序列将包括启动子区，其包括用于所述可操作连接的基因 的转录调控的启动子序列。必要时，调控序列还可包括增强子序列或上 游激活子序列。本发明的载体可任选地包括5’前导序列或信号序列。对 合适载体的选择和设计在本领域普通技术人员的能力和判断力的范围 内。
包含所有表达必需要素的表达载体可商购得到并且是本领域技术 人员公知的。参见例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。通过将 异源DNA(RNA)引入到细胞中而对所述细胞进行基因工程操作。该 异源DNA(RNA)被置于转录元件的可操作控制下，以允许所述异源 DNA在宿主细胞中表达。为了生产DHBA和3-HBL，在实施例部分中 利用大肠杆菌证明了与本发明相关的基因的异源表达。用于生产DHBA 和3-HBL的新方法也可在其它细菌细胞、古细菌细胞、真菌(包括酵 母细胞)、哺乳动物细胞、植物细胞等中表达。
可利用本领域中标准的方法和技术将编码要求保护的本发明之酶 的核酸分子引入到一种或更多种细胞中。例如，可通过标准方案例如转 化(包括化学转化)和电穿孔、转导、粒子轰击等引入核酸分子。也可 通过将所述核酸分子整合到基因组中来表达编码要求保护的本发明之 酶的核酸分子。
在一些实施方案中，与本发明相关的一个或更多个基因在细菌细胞 中重组表达。可以在任何类型(丰富或基本)和任何组成的培养基中培 养本发明的细菌细胞。本领域普通技术人员会理解，常规优化将允许使 用多种类型的培养基。所选培养基可以补充有多种其它组分。补充成分 的一些非限制性实例包括葡萄糖、抗生素、用于基因诱导的IPTG、ATCC 微量矿物质补充剂、葡萄糖、乙醇酸和丙酸。同样，可通过常规实验对 本发明细胞的培养基和生长条件的其他方面进行优化。例如，pH和温 度是可被优化的因素的非限制性实例。在一些实施方案中，因素例如培 养基、培养基补充剂和温度的选择可影响3-羟基酸(例如DHBA和/或 3-HBL)的生产水平。在一些实施方案中，可优化补充组分的浓度和量。 在一些实施方案中，对在收获DHBA和/或3-HBL之前按何种频率给培 养基补充一种或更多种补充组分以及培养基的培养时间进行了优化。
在一些实施方案中，与发明相关的用于生产DHBA和3-HBL的方 法可通过引入乙醇酸还原酶基因来修饰，以便仅仅利用葡萄糖而不是葡 萄糖和乙醇酸。该基因(存在于多种生物体例如假单孢菌(Pseudomonas) 和酵母菌(Saccharomyces)中)还原乙醇酸，乙醇酸可通过柠檬酸循 环将葡萄糖变为乙醇酸来产生，用于合成DHBA和3-HBL。
根据本发明的一些方面，高滴度的3HV、DHBA和/或3-HBL是通 过在细胞中重组表达与发明相关的基因而产生的。本文所用的“高滴度” 指毫克/升(mg L-1)级别的滴度。给定产物所产生的滴度将受到多个因 素(包括对培养基的选择)的影响。
在一些实施方案中，3HV的滴度为至少100mg L-1。例如，所述滴 度可以为至少约100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、 600、650、700、750、800、850mg L-1或850mg L-1以上。如实施例部 分所证明的，在一些实施方案中，在表达bktB-phaB的培养物中，3HV 滴度为约537mg L-1，在表达phaA-phaB的培养物中，3HV的滴度为约 142mg L-1，以及在表达bktB-hbd的培养物中，3HV的滴度为约522mg L-1。不希望被任何理论约束，含有bktB的途径产生高3HV滴度这一观 察结果与bktB对C3底物与C2缩合形成C5产物具有高活性的报告一致 (Slater等，1998)。在一些实施方案中，表达phaB的3-羟基链烷酸途 径产生的3HV的立体异构体与表达hbd的途径不同。在一些实施方案 中，所述phaB途径产生(R)-3HV，所述hbd途径产生(S)-3HV。
在一些实施方案中，基本培养基中DHBA的滴度为至少25mg L-1。 例如，所述滴度可以为至少约25、50、75、100、125、150、175、200、 225、250、275、300mg L-1或300mg L-1以上。在一些实施方案中，丰 富培养基中产生的DHBA滴度为至少200mg L-1。例如，所述滴度可以 为至少约200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、 475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、750、775、800mg L-1或900mg L-1或者1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5g L-1或5g L-1以上。在一些实施方案中，基本培养基中产生的3-HBL滴度为至少1mg L-1。例如，所述滴度可以为至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 15、20、25、30、35、40、45、50mg L-1或50mg L-1以上。在一些实施 方案中，丰富培养基产生的3-HBL滴度为至少10mg L-1。例如，所述 滴度可以为至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、 120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、 250、260、270、280、290、300、350、400、450、500、550、600、650、 700、750、800、850或900mg L-1，或者1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、 4.5、5g L-1或5g L-1以上。
如实施例部分所证明的，表达bktB-phaB的培养物所产生的DHBA 和3-HBL的滴度分别为约573±30mg L-1和178±4mg L-1，表达 phaA-phaB的培养物所产生的DHBA和3-HBL的滴度分别为约492± 19mg L-1和107±3mg L-1，以及表达thil-phaB的培养物所产生的DHBA 和3-HBL的滴度分别为约247±57mg L-1和96±14mg L-1。在一些实施 方案中，表达hbd的培养物只产生DHBA。在某些实施方案中，在表达 bktB-hbd的培养物中，DHBA滴度为约47±10mgL-1。
可通过存在或不存在硫酯酶TesB来调节所述3-羟基链烷酸途径以 产生更多的DHBA或3-HBL。如实施例部分所证明的，tesB的重组表 达导致产生的DHBA(对于bktB-phaB途径组合而言，为约573mg L-1) 比3-HBL(约178mg L-1)显著更多。在一些实施方案中，没有tesB表 达时，产生的3-HBL(对于bktB-phaB而言，为约270mg L-1)比DHBA (约21mg L-1)多。在某些实施方案中，bktB-phaB-pct的表达产生的 3-HBL滴度为约270±3mg L-1。不希望被任何理论约束，在不存在重组 tesB的情形下形成的少量的DHBA可能是由于基因组tesB的表达造成 的，因为该基因是大肠杆菌本身具有的(Huisman等，1991)。
内酯化可用于提高3-HBL的滴度。本文所用的内酯化指通过羟基对 活化羰基的分子内进攻而形成内酯。来自产生DHBA比3-HBL多的培 养物的上清液可被酸化(例如通过加入盐酸)来降低pH值。孵育这些 上清液(例如在37℃过夜)使得可进行酸催化内酯化，导致3-HBL滴 度提高。图12描述用于生产DHBA和3-HBL的3-羟基链烷酸途径方 案，在DHBA-CoA处标出分支点。在不存在tesB的情形下产生更多的 3-HBL而几乎不产生DHBA这一观察结果表明DHBA-CoA可在体内自 身内酯化为3-HBL。
在一些实施方案中，酸处理后培养物上清液的3-HBL滴度提高10％ 以上。在另一些实施方案中，酸处理后培养物上清液的3-HBL滴度提 高100％以上。例如，3-HBL滴度可提高约10％、20％、30％、40％、 50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、 150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、 240％、250％或250％以上，包括任何中间值。在一些实施方案中，酸 处理后的培养物上清液导致DHBA滴度降低10％以上。例如，DHBA 滴度可降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、 90％、95％或95％以上，包括任何中间值。
用于培养与本发明有关的细胞的液体培养基可盛放在本领域中已 知和使用的任何培养容器中。在一些实施方案中，可使用在曝气反应器 (例如搅拌罐反应器)中的大规模生产来产生大量的DHBA和/或 3-HBL。
本发明的一些方面包括优化细胞DHBA和/或3-HBL产生的策略。 优化DHBA和/或3-HBL产生指进行优化策略之后DHBA和/或3-HBL 的量比不实施此策略的高。优化策略之一是通过选择合适的启动子和核 糖体结合位点来提高与发明相关的一个或更多个基因的表达水平。在一 些实施方案中，这可包括对高拷贝数质粒或者低或中拷贝数质粒进行选 择。在一些实施方案中，所述质粒是中拷贝数质粒，例如pETDuet。转 录终止步骤也可通过引进或消除例如茎环的结构来进行靶向，以调控基 因表达。
在一些实施方案中，使用已优化DHBA和/或3-HBL生产的细胞可 能是有利的。在一些实施方案中，对导致DHBA和/或3-HBL产量提高 的突变的筛选可通过随机诱变筛选或通过已知筛选突变来进行。在某些 实施方案中，基因组片段的鸟枪法克隆可用于鉴定导致DHBA和/或 3-HBL产量提高的基因组区域，所述鉴定通过对具有导致DHBA和/或 3-HBL产量提高的这些片段的细胞或生物体进行筛选来进行。在某些情 形下，一个或更多个突变可组合在同一细胞或有机体中。
对生产DHBA和/或3-HBL的优化可包括优化对用于本文所述重组 途径之表达的菌株的选择。在一些实施方案中，使用与野生型接近的菌 株(意思是基本上未进行基因修饰的菌株)可导致DHBA和/或3-HBL 的滴度提高。例如，在一些实施方案中，使用表达recA和/或endA基 因的菌株(例如大肠杆菌株MG1655(DE3))导致DHBA和/或3-HBL 的滴度提高(图10)。如实施例部分所证明的，在一些实施方案中，使 用大肠杆菌MG1655(DE3)可导致DHBA和3-HBL的滴度分别为1.99 ±0.36g L-1和0.16±0.04g L-1，代表着相对MG1655(DE3)recA-end A-而言DHBA的产量提高约3倍。在某些实施方案中，约3.20g L-1DHBA 和约0.23g L-1 3-HBL的滴度可利用大肠杆菌MG1655(DE3)获得。酸 催化内酯化之后，DHBA的滴度可降低至约0.42g L-1，而3-HBL的滴 度可提高至约2.17g L-1。
通过本文所述重组途径产生的分子的立体化学可通过对3-羟基丁酰 CoA还原酶进行选择来控制。在某些实施方案中，使用PhaB得到(R)-3- 羟基酸，而使用Hbd则得到(S)-立体异构体。在一些实施方案中，产生 (S)-DHBA和/或(S)-3-HBL，而在另一些实施方案中，产生(R)-DHBA和 /或(R)-3-HBL。本发明所述的方法和组合物也可用于筛选这样的酶：其 与hbd相似、具有相似立体化学偏好但是用于生产(R)-DHBA和 (R)-3-HBL的底物范围增加。
在一些实施方案中，对蛋白质表达进行优化可能还需要在引入到细 胞中之前对编码酶的基因进行修饰，例如通过对在细菌细胞中的表达进 行密码子优化。不同生物体的密码子使用可见于密码子使用数据库 (Codon Usage Database)(kazusa.or.jp/codon/)。
在一些实施方案中，蛋白质工程可用于优化与本发明相关的一种或 更多种酶的表达或活性。在某些实施方案中，蛋白质工程方法可包括确 定酶的3D结构或者基于相关蛋白质的结构构建所述酶的3D同源模型。 基于3D模型，可构建酶中的突变并将其引入到细胞或生物体中，然后 可筛选产量提高的DHBA和/或3-HBL。在一些实施方案中，可通过操 纵以与本发明相关酶相同途径起作用的酶来提高细胞中DHBA和/或 3-HBL的产量。例如，在一些实施方案中，增加酶或作用于靶酶(例如 与本发明相关的酶)上游的其它因子的表达可能是有利的。这可利用任 何标准方法通过过表达上游因子来实现。
本文所述的用于由糖及糖衍生底物生产3-羟基酸(例如3-HBL和 DHBA)的方法和组合物具有广泛的应用。例如，3-HBL在制药工业中 用来作为以下药物的构建块：降胆固醇的他汀类，例如和 抗生素，例如抗高血脂药物(Lee 等，2008；Lee和Park，2009)；HIV抑制剂(Kim等，1995)和营养 补充剂肉碱(Wang和Hollingsworth，1999b)。
实施例
实施例1：在大肠杆菌中生产羟基酸
本文中，使用所述3HB途径来生产复杂的3-羟基酸，尤其是3HV、 DHBA和3-HBL。此外，详细研究了DHBA向3-HBL的内酯化转化。 这些产物是通过将非天然底物丙酸(用于生产3HV)或乙醇酸(用于生 产DHBA和3-HBL)提供给所述3HB途径而制得的。这些非天然底物 被丙酰CoA转移酶(pct)硫醇化而形成CoA硫酯，该CoA硫酯能够 与乙酰CoA缩合而最终形成新的羟基酸产物。对于生产3HV而言，实 现了537mg L-1的(R)-3HB和522mg L-1的(S)-3HV的滴度。对于生产 DHBA而言，生产了3.2g L-1的DHBA以及230mg L-1的3-HBL。所 述DHBA/3-HBL产物谱可以通过下述两个途径之一向3-HBL偏移：通 过除去所述tesB基因并使DHBA-CoA自身内酯化，或者通过用酸处理富 集DHBA的培养物上清液而使DHBA化学性地内酯化为3-HBL。除去所 述tesB基因使3-HBL的产量平均提高52％。后一种方法即用酸使培养 物上清液化学性地内酯化的方法产生420mg L-1的DHBA和2.17g L-1的3-HBL，将3-HBL的滴度提高了9倍。
羟基酸是多用途的手性化合物，其同时含有羧基和羟基部分，这允 许它们容易地被修饰成几种有用的衍生物(Lee等，2002；Chen和Wu， 2005)，并使其适用于合成抗生素(Chiba和Nakai，1985)，β-和γ-氨基 酸和多肽(Park等，2001；Seebach等，2001)的应用中，以及用作手 性合成构建块(Lee等，2002)。已成功地证实了用羟基酸单体直接生 物生产3HB，并且已报道摇瓶和分批补料规模的滴度为3g L-1和12g L -1(Gao等，2002)。在这些报道中，3HB是通过利用乙酰CoA乙酰转 移酶(phbA)、3-羟基丁酰CoA脱氢酶(phbB)、磷酸丁酰转移酶(ptb) 和丁酰激酶(buk)由乙酰CoA制得的(Liu和Steinbüchel，2000a；Liu 和Steinbüchel，2000b；Gao等，2002)。选用这些酶中的最后两种酶以除 去3-羟基丁酰CoA的CoA部分，得到游离3HB，所述两种酶来自丙酮丁 醇梭菌，它们在该菌中参与由丁酰CoA生产丁酸(Liu和Steinbüchel， 2000b)。最近，将来自大肠杆菌K12的硫酯酶II(tesB)(Naggert等， 1991)成功地用于直接水解3HB-CoA的酰基-硫酯(Liu等，2007；Tseng 等，2009)。
由两个乙酰CoA部分缩合而直接生产3HB的成功打开了通过将该途 径推广用于利用酰基CoA分子与乙酰CoA缩合来生产结构更多样的羟基 酸的可能性(图1)。在广义的3HB途径(称为3-羟基链烷酸途径)中， 三种乙酰乙酰CoA硫解酶(thil、bktB或phaA)之一用于进行缩合反应 得到3-酮脂酰CoA中间体，其随后被phaB或hbd还原得到3-羟基酰基 CoA化合物。最后，使用tesB来将CoA部分从3-羟基酰基CoA上水解下 来，释放出游离3-羟基酸。这些步骤与本文所述的用于3HB生物合成的 那些步骤相同。3-羟基链烷酸途径中另一个难点在于，与乙酰CoA不同， 可用作该途径候选底物的短链酰基CoA是大肠杆菌中不易获得的代谢物。 为避开这一点，使用了来自埃氏巨球形菌的广泛底物特异性酶(即丙酰 CoA转移酶(pct))(Schweiger和Buckel，1984；Taguchi等，2008)，其在 短链有机酸间交换CoA部分。在所述3-羟基链烷酸途径中，使用pct将 CoA由乙酰CoA转移到向提供给所述细胞的酸(例如丙酸)上，形成该 途径所需的酰基CoA。表1总结了图1所示的3-羟基链烷酸途径中使用的 每种酶的特征和来源。
表1：图1所示3-羟基链烷酸途径中所用酶的一般特征和来源
表2(来自Schweiger和Buckel，1984)总结了羧酸抑制CoA转移酶的比 活性和相对活性。
表2
本文所述工作的目的是利用3-羟基链烷酸途径由糖及糖衍生的底物合 成3-羟基丁内酯(3-HBL)和/或其水解形式3，4-二羟基丁酸(DHBA)。 3-HBL在制药工业中广泛用作以下药物类别的构建块：称为他汀类药物的 降胆固醇药物(例如和)以及抗生素抗高脂血症药物(Lee等，2008；Lee和Park，2009)。来 源于3-HBL的其它药物包括HIV抑制剂(Kim等，1995)和营养补充剂 肉碱(Wang和Hollingsworth，1999b)。美国能源部已将3-HBL列入十 大增值化学品之一(Werpy和Petersen，2004)。3-HBL可容易地转化成 多种三碳构建快(Wang和Hollingsworth，1999a)。在本文中，首先检验 了由葡萄糖和丙酸生产3-羟基戊酸(3HV)，以测试所述羟基链烷酸途径 吸收游离酸并将它们转化为CoA硫酯的能力。其次，研究了由葡萄糖和乙 醇酸生物合成DHBA和3-HBL，并考察了控制这两种产物的滴度和比例 的因素。
结果
由葡萄糖和丙酸生产3HV
首先利用丙酸作为底物测试了3-羟基链烷酸途径。将中和的丙酸盐与 葡萄糖一起供应给表达三种乙酰乙酰CoA硫解酶(thil、bktB或phaA) 之一、两种3-羟基丁酰CoA还原酶(phaB或hbd)之一、tesB、和pct 的重组大肠杆菌细胞。将这些培养物在30℃孵育48小时，并通过HPLC 测定所得3HV滴度(图3)。检测了表达bktB-phaB(537mg L-1)、phaA-phaB (142mg L-1)和bktB-hbd(522mg L-1)的培养物中的3HV。其它三个途径基 因组合中未检测出3HV。利用bktB产生最高3HV滴度这一结果与bktB 对C3底物与C2缩合形成C5产物具有高活性这一报道(Slater等，1998) 是一致的。除了在phaA情形下(其中仅在phaA-phaB基因组合中检测到 3HV)以外，对3-羟基链烷酸途径中还原酶的选择并未显著影响3HV产 量。
微生物生产的3HV的手性分析
使表达bktB以及phaB或hbd作为3-羟基丁酰CoA还原酶的3-羟基 链烷酸途径中的重组大肠杆菌在30℃下在补充有20g L-1葡萄糖和20mM 丙酸的50mL LB中培养48小时。通过以下方法来测定从这些培养物的培 养基中得到的3HV的立体化学：先对3HV进行甲酯化，然后进行手性 HPLC分析，如材料与方法部分中所述。将这些光谱与外消旋3HV标准 品相比较。结果证实，表达phaB的3-羟基链烷酸途径产生的3HV立体异 构体与利用hbd的途径的不同(图4)。缺少对映体纯的3HV标准品阻碍 了对每个样品绝对立体化学的确定，尽管很明显所述phaB和hbd培养物 产生不同的立体异构体。然而，基于之前关于phaB和hbd的产物立体化 学的报道(Lee等，2008；Liu等，2007)以及(R)-3HB相比于(S)-3HB具 有更短的保留时间这一观察结果，在本文中，极有可能所述phaB途径样 品产生(R)-3HV而所述hbd途径样品产生(S)-3HV。
由葡萄糖和乙醇酸生产DHBA和3-HBL
为生产DHBA和3-HBL，将中和的乙醇酸盐与葡萄糖一起供应给表达 三种乙酰乙酰CoA硫解酶(thil、bktB或phaA)之一、两种3-羟基丁酰 CoA还原酶(phaB或hbd)之一、tesB和pct的重组大肠杆菌MG1655(DE3) recA-endA-细胞。将这些培养物在30℃孵育96小时，并通过HPLC测定 所得DHBA和3-HBL的滴度(图5)。通过LC/MS分析确认了DHBA 的身份(图5)。在所有3-羟基链烷酸途径基因组合中均检测到了DHBA， 但是仅在表达phaB的途径中检测到了3-HBL。所述bktB-phaB组合产生 的DHBA和3-HBL滴度最高，分别为573±30mg L-1和178±4mg L-1。所 述phaB-phaB组合表现的行为几乎相同，产生的DHBA和3-HBL的滴度 分别为492±19mg L-1和107±3mg L-1。所述thil-phaB组合的效果比其它 phaB组合的差，仅产生247±57mg L-1的DHBA和96±14mg L-1的 3-HBL。使用hbd的途径组合只产生DHBA，bktB-hbd的最大DHBA滴 度为47±10mg L-1。
TesB表达对DHBA和3-HBL产量的影响
利用或不利用tesB来测试共表达phaB、三种乙酰乙酰-CoA硫解酶 (thil、bktB或phaA)之一和pct的3-羟基链烷酸途径中DHBA和3-HBL 的产量。本实验与上文的一个实验相似，但是目的是了解3-HBL是怎样在 3-羟基链烷酸途径中产生的。所得DHBA和3-HBL滴度如图8所示。由 该图可见，不含tesB的途径产生的3-HBL平均多57％，而产生的DHBA 则少95％。所述bktB-phaB-pct组合产生的3-HBL滴度最高，为270±3mg L-1。利用不同乙酰乙酰CoA硫解酶的途径的性能如图5所示，其中bktB 获得的产物滴度最高，而thil获得的产物滴度最低。
酸后处理对DHBA和3-HBL滴度的影响
在有机化学中，大量文件证明内酯化是酸催化的(Carey，2000)。由于 图5中所示的phaB培养物产生大量的DHBA，但产生相对很少的3-HBL， 因此用50mM盐酸对来自这些培养物的96小时上清液进行酸化，使pH 值降低至小于1.0。然后将这些培养物上清液在37℃孵育过夜以允许发生 酸催化内酯化。过夜孵育后，对这些样品进行HPLC分析，所得DHBA 和3-HBL滴度如图9所示。就bktB-phaB途径组合而言，培养物上清液 的酸后处理使3-HBL滴度平均提高了171％，并且所获得的最高3-HBL 滴度为497±25mg L-1。由于DHBA内酯化成3-HBL，在此过程中DHBA 滴度平均下降了85％。约80-85摩尔％的DHBA转化为3-HBL，剩余 15-20mol％可能由于DHBA多聚化而损失。
菌株对DHBA和3-HBL产量的影响
在大肠杆菌MG1655(DE3)中用完整recA和endA基因进一步测试 了3-羟基链烷酸途径，以了解是否可进一步提高野生型程度更高的大肠杆 菌株中DHBA和3-HBL的滴度。本实验的结果显示在图10和11中。在 图10中，显示了11种独立培养物的葡萄糖和乙醇酸总消耗量以及醋酸、 3HB、DHBA和3-HBL的产量。相对大的样本量有助于抵消存在于recA+菌株中的基因表达的天然变异性。在本实验中，产生1.99±0.36g L-1的 DHBA和0.16±0.04g L-1的3-HBL。这表明DHBA的产量比MG1655 (DE3)recA-endA-提高了3倍多(图5)。DHBA产量最高的培养物产生 3.20g L-1的DHBA和0.23g L-1的3-HBL(图11)。使该培养物进行过夜酸 催化内酯化，得到2.17g L-1的3-HBL和0.42g L-1的DHBA。不希望受任 何理论约束，MG1655(DE3)与MG1655(DE3)recA-endA-相比是更 好的DHBA生产者的原因可能是因为后者菌株经历的更多的基因工程对 其生长和代谢有消极影响。
讨论
通过选择途径酶来控制产物谱
所述3-羟基链烷酸途径的优点在于它和其组成酶相对于其底物是灵活 的，即所述途径是多种多样的。具体而言，已知TesB、PhaB、BktB和Pct 均与至少三种不同底物起作用(Huisman等，1991；Schubert等，1988； Slater等，1998；Schweiger和Buckel，1984)。底物灵活性对实现由此途 径生产3HV、DHBA和3-HBL是至关重要的。实验发现，四种最具灵活 性的蛋白质(TesB、PhaB、BktB和Pct)的组合产生最高滴度的新3-羟基 链烷酸途径产物(图4、5、8和9)。
此外，通过所述3-羟基链烷酸途径获得的产物可通过提供给所述途径 的底物和基因来精确控制。例如，3HV仅在丙酸存在下产生，而DHBA 和3-HBL仅在添加乙醇酸时产生。也可通过存在或不存在硫酯酶TesB来 调节所述途径，以产生更多的DHBA或3-HBL。利用重组TesB产生的 DHBA(对于bktB-phaB途径组合而言为573mg L-1)显著比3-HBL(178mg L-1)多。不利用TesB，产生的3-HBL(对于bktB-phaB而言为270mg L-1) 比DHBA(21mg L-1)多。不存在重组TesB的情形下形成的少量DHBA 可能是由于基因组TesB的表达造成的，因为该基因是大肠杆菌固有的 (Huisman等，1991)。尽管如此，这一结果表明没有硫酯酶水解DHBA 的CoA硫酯(DHBA-COA)时，DHBA-CoA可在体内自我内酯化为3-HBL (图12)。虽然不知道大肠杆菌中是否有酶催化此反应或者该反应是否在 体内自发地发生，但是很明显3-HBL是由葡萄糖和乙醇酸产生的并且tesB 在决定DHBA-CoA中间体的命运中起重要作用(图8)。
在MG1655(DE3)recA-endA-中进行的所有3HV、DHBA和3-HBL 生产实验中，均检测到极少的3HB(＜100mg L-1)。甚至在MG1655(DE3) 中，产生的DHBA也是3HB的两倍(图11)，即便3HB是所述3-羟基链 烷酸途径中所用酶的天然产物。3HB是由两个乙酰CoA部分缩合产生的， 理论上应是该工作中产生其它3-羟基酸中的主要副产物，因为3HB是乙 酰乙酰CoA硫解酶与3-羟基丁酰CoA还原酶相作用的天然产物，并且利 用这些酶已产生2-3g L-1的3HB(Tseng等，2009)。3HB和3-羟基链烷酸 途径之间的唯一区别是后一途径中存在pct。pct是CoA转移酶，其在短链 有机酸(色括乙酸和乙酰CoA)之间交换CoA部分(Schweiger和Buckel， 1984)。在重组pct存在下产生非常少的3HB表明，Pct蛋白可将CoA从 细胞中乙酰CoA中除去并将其转移到其它酸上，包括用于3HV生产的丙 酸和用于DHBA和3-HBL生产的乙醇酸。该CoA转移可显著降低细胞内 乙酰CoA浓度，使得两个乙酰CoA分子的二级缩合比乙酰CoA与另一个 酰基-CoA的缩合(相对于乙酰CoA而言为一级反应)更不可能发生。对 比含有和不含有pct的3-羟基链烷酸途径，除去乙酰CoA中的CoA产生 的副产物将是增加的醋酸产量，该效果被HPLC所证实(图13)。乙酸产 量的显著增加证实了pct从乙酰CoA获得CoA用于使细胞内其它短链酸 硫醇化这一假说。该作用很可能将乙酰CoA水平降低至3HB生物合成被 显著抑制的程度上。
通过选择3-羟基丁酰Co A还原酶来控制立体化学
所述3-羟基链烷酸途径的灵活性还延伸到其最终产物的立体化学上， 即通过将phaB或hbd用作该途径的3-羟基丁酰CoA还原酶，可实现不同 的立体化学结果。文献中大量报道，phaB导致产生(R)-3-羟基酸而hbd导 致产生(S)-立体异构体(Lee等，2008；Liu等，2007)。这种现象在生产 3HB(Tseng等，2009)和3HV(图4)的途径中得到了实验验证。用于 分析3HB和3HV的立体化学的甲酯化手性分析方法不适用于DHBA，这 是因为在分析过程中DHBA内酯化的能力以及3-HBL内酯立体异构体不 能彼此拆分造成的。然而，基于phaB和hbd产生不同的并且完全对映体 纯的3HB和3HV产物这一观察结果，没有理由期望它们将不会对DHBA 和3-HBL也如此。有趣的是，因为DHBA在δ位有羟基，其改变了分子 不同部位对其立体中心的立体化学偏好性，所以PhaB形成的DHBA立体 化学应是(S)-DHBA，而Hbd形成的应是(R)-DHBA。该立体化学的指定是 根据DHBA中γ-羟基基团相对于羰基基团的绝对位置进行的。由于phaB 在3-羟基链烷酸途径中生产DHBA和3-HBL方面比Hbd更高效(图5)， 所以该途径更适于生产(S)-DHBA和(S)-3-HBL而不是(R)-立体异构体。幸 运的是，(S)-立体异构体主要用于生产药品和高价值化合物(Lee和Park， 2009)。筛选hbd同源物可鉴定出具有相同立体化学偏好但是用于生产 (R)-DHBA和(R)-3-HBL的底物范围增大的3-羟基丁酰CoA还原酶。
结论
在这项工作中，利用3-羟基链烷酸途径(图1)在大肠杆菌中生产了 3HV(0.54g L-1)、DHBA(3.2g L-1)和3-HBL(2.2g L-1)。这些化合物的 应用范围从手性构建块到高分子材料到高价值的药品。这项工作代表了在 大肠杆菌中生物合成3HV的首次报道之一，并且是由廉价糖和糖衍生底物 完全生物生产DHBA和3-HBL的首次报道。进一步筛选其它的3-羟基链 烷酸途径同源物将为由甲酰CoA和乙酰CoA生产其它高价值3-羟基酸(例 如3-羟基丙酸)提供丰富的途径组合来源。还可利用所述3-羟基链烷酸途 径制备DHBA和3-HBL的分子类似物，例如由乳酰CoA和乙酰CoA的 缩合制备3，4-二羟基戊酸和4-甲基-3-HBL，可能得到用于更有效药品的新 的中间体。
可通过对培养条件和宿主菌株进行其它优化来进一步提高3-羟基链烷 酸途径的产物滴度。除了扩大所述途径的底物范围外，对同源途径酶的筛 选还可提高滴度。用于提高生产力的一个具有前景的途径是对大肠杆菌进 行改造以“内部”产生途径底物。例如，乙醇酸可在细胞内由乙醛酸通过 ycdW乙醛酸还原酶基因的作用来制备(等，2001)。途径底物的细 胞内生产将消除对跨细胞被膜转运底物的需求，从而加速生产。底物的细 胞内生产也将允许仅将葡萄糖供给大肠杆菌用于产物形成，这简化了生物 过程同时降低了材料成本。
材料与方法
菌株和化学品
使用大肠杆菌DH10B(Invitrogen，Carlsbad，CA)和ElectroTen-Blue (Stratagene，La Jolla，CA)进行克隆反应的转化和所有质粒的增殖。大 肠杆菌MG1655(DE3)是利用λDE3溶源化试剂盒(Novagen，Darmstadt， Germany)由大肠杆菌MG1655构建的。然后通过Datsenko和Wanner (2000)的方法敲除大肠杆菌MG1655(DE3)中的recA和endA基因，得 到大肠杆菌MG1655(DE3)recA-endA-(Tseng等，2009)。大肠杆菌 MG1655(DE3)和大肠杆菌MG1655(DE3)recA-endA-都用于生产3HV、 DHBA和3-HBL。Luria-Bertani(LB)培养基、D-葡萄糖、丙酸和乙醇 酸分别购自BD Biosciences(Sparks，MD)、Mallinckrodt Chemicals (Phillipsburg，NJ)、Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)和MP Biomedicals (Solon，OH)。除非另外指明，否则所有化学品均为可购得的最高级别。
质粒和引物
来源于丙酮丁醇梭菌ATCC 824(thil和hbd)、真养雷氏菌H16(phaA、 bktB和phaB)、大肠杆菌K-12(tesB)和埃氏巨球形菌(pct)的基因是通 过聚合酶链反应(PCR)利用基因组DNA(gDNA)模板获得的。所有gDNA 均是利用Wizard Genomic DNA纯化试剂盒(Promega，Madison，W1) 制得的。购买用于所有PCR扩增的常用寡核苷酸(引物)(Sigma-Genosys， St.Louis，MO)示于表3中。在所有情形下，均使用HotStar高保真聚合 酶(Qiagen，Valencia，CA)进行DNA扩增。限制性酶和T4DNA连接 酶购自New England Biolabs(Ipswich，MA)。DNA消化、连接和转化是 根据标准方法(Sambrook和Russell，2001)进行的。
使用两种可共复制载体pETDuet-1和pCDFDuet-1(Novagen， Darmstadt，Germany)来构建3-羟基链烷酸途径。两种Duet载体均含有 两个多克隆位点(MCS)，每个位点的上游是T7lac启动子和核糖体结合 位点(RBS)，能高水平表达每个单独基因。为了将所述途径基因克隆到这 些载体中，利用其中引入有所期望的限制性位点的5’和3’引物制备了PCR 产物。用于克隆所述基因的这些位点在表3中以下划线表示。用限制性酶 将这些PCR产物在对应于通过其各自引物被引入的限制性位点上消化， 并将其直接连接到被同样消化的Duet载体上。将利用pETDuet-1的连接 反应物作为载体转化到DH10B大肠杆菌中，同时将利用pCDFDuet-1的 连接反应物转化到ElectroTen-Blue大肠杆菌中。将三种乙酰乙酰CoA硫 解酶(thil、bktB和phaA)之一和两种3-羟基丁酰CoA还原酶(phaB和 hbd)之一克隆到pETDuet-1中，得到六种基于pETDuet的质粒。所述基 于pCDFDuet的质粒含有pct和tesB或者只含有pct。一旦构建了所有质 粒，就将一种基于pETDuet的质粒和一种基于pCDFDuet的质粒共转化 到大肠杆菌MG1655(DE3)recA-endA-或大肠杆菌MG1655(DE3)中， 以构建表达究整的3-羟基链烷酸途径的生产菌株。
表3：用于克隆3-羟基链烷酸项目所用基因对使用的DNA寡核苷酸引物的 列表。用于克隆的限制性位点以下划线表示。引物名称对应于所述引物扩 增的基因的名称(不论所述引物是该基因的正向引物(FP)还是反向引物 (RP))，并且限制性位点被引入到引物序列中用于克隆。
培养条件
除非在本文中另外指明，否则将含有pETDuet-1载体上的乙酰乙酰 CoA硫解酶(thil、bktB或phaA)之一和两种3-羟基丁酰CoA还原酶(phaB 或hbd)之一以及pCDFDuet-1载体上的tesB和/或pct的重组大肠杆菌在 30℃下培养在250mL摇瓶中的50mL补充有1％葡萄糖的LB中。加入氨 苄西林(50mg L-1)和链霉素(50mg L-1)以为质粒维持提供选择性压力。 向本申请中提及的来自2.0M储备溶液的培养物中添加其它补充化合物， 例如中和的丙酸盐或乙醇酸。将培养物接种至600nm处初始光密度 (OD600)为0.05。一旦所述细胞到达指数生长中期(OD600为～0.5)，就 向培养物中添加50μL 1.0M IPTG和1mL 2.0M的中和丙酸盐或乙醇酸， 用于诱导基因表达并提供所述3-羟基链烷酸途径所需的底物。每日抽取 1mL培养物用于HPLC分析。
3HV的甲酯化
将50mL含3HV的LB微生物培养物以6000×g离心10分钟，并 将上清液转移到50℃烘箱的蒸发皿中并过夜蒸发，得到褐色残余物。向该 残余物中添加2mL酸性甲醇(4∶1甲醇∶浓HCl)，并将蒸发皿摇动2分钟 以除去残余物中的3HV。将所述甲醇溶液转移到试管中，密封并在100℃ 加热3小时。加热后，将所述溶液冷却至室温。冷却后，将200μL所述 甲醇溶液与1mL纯异丙醇混合在1.7mL管中，振荡并静置5分钟。于13200 ×g离心10分钟除去样品中的沉淀。取上清液用于手性HPLC分析。
HPLC分析
非手性HPLC分析是在购自Bio-Rad Laboratories(Hercules，CA) 的配有Aminex HPX-87H柱(0.7cm×30cm)的Agilent 1100系列仪器上 进行的。对于所有非手性分析，流动相为5mM硫酸，注射5μL培养物上 清液用于分析，并使用折光检测器对产物定量。对于3HV的非手性分析， 柱操作温度为35.0℃。流速开始为0.55mL/分钟，最初12分钟线性增加到 高达0.8mL/分钟，并在0.8mL/分钟再保持8分钟。将购自Epsilon Chimie (Brest，France)的3HV用作标准品，其保留时间为约14.5分钟。对于 DHBA和3-HBL的分析，柱操作温度为40.0℃，流速恒定为0.75mL/分钟。 将购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)的3-HBL用作标准品，并用10N 氢氧化钠对3-HBL皂化来制备DHBA并将其用作标准品。DHBA和3-HBL 的保留时间分别为大约8.9分钟和13.7分钟。
手性HPLC分析是在购自Daicel Chemical Industries(West Chester，PA)的配有Chiralcel OD-H柱(0.46cm×25cm)的Agilent 1100 系列仪器上进行的。柱温维持在40℃。甲基-3HV是在二极管阵列检测器 上于210nm处检测的。流动相为9∶1正己烷∶异丙醇，通过柱的流速为 0.7mL/分钟。如上文所述，将购自Epsilon Chimie(Brest，France)的外 消旋3HV在酸性甲醇中煮沸形成外消旋甲基-3HV，其用作标准品。两种 对映体的保留时间分别为6.86和9.24分钟。之前利用3HB进行的手性 HPLC分析表明，保留时间较短的是(R)-3HV，而较长的是(S)-3HV。
质谱(MS)分析是利用Agilent 6120四极杆LC/MS单元进行的， 操作模式为阳离子电喷雾。LC流动相为25mM甲酸铵(pH 2)，流速为 0.6mL/分钟。所述单元是在上文所述的液相色谱柱的下游并在相同色谱条 件下操作。在150℃下使样品汽化，将300℃的5.0mL/分钟的氮气(60psig) 用作MS分析的载气。对离子检测器进行校正使扫描的阳离子m/z为138 (代表DHBA的铵加合物)和120(代表3-HBL的铵加合物)。
埃氏巨球形菌pct基因序列(SEQ ID NO：9)：
atgagaaaagtagaaatcattacagctgaacaagcagctcagctcgtaaaagacaacgacacgattacgtctatcggctttgtcagcag
cgcccatccggaagcactgaccaaagctttggaaaaacggttcctggacacgaacaccccgcagaacttgacctacatctatgcagg
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tgctcctgaaggcgctaccgatgcagctctccccatgagcgctaagaaaatcatcggccgccgcggcgctttggaattgactgaaaac
gctgtcgtcaacctcggcgtcggtgctccggaatacgttgcttctgttgccggtgaagaaggtatcgccgataccattaccctgaccgtc
gaaggtggcgccatcggtggcgtaccgcagggcggtgcccgcttcggttcgtcccgcaatgccgatgccatcatcgaccacacctat
cagttcgacttctacgatggcggcggtctggacatcgcttacctcggcctggcccagtgcgatggctcgggcaacatcaacgtcagca
agttcggtactaacgttgccggctgcggcggtttccccaacatttcccagcagacaccgaatgtttacttctgcggcaccttcacggctg
gcggcttgaaaatcgctgtcgaagacggcaaagtcaagatcctccaggaaggcaaagccaagaagttcatcaaagctgtcgaccag
atcactttcaacggttcctatgcagcccgcaacggcaaacacgttctctacatcacagaacgctgcgtatttgaactgaccaaagaagg
cttgaaactcatcgaagtcgcaccgggcatcgatattgaaaaagatatcctcgctcacatggacttcaagccgatcattgataatccgaa
actcatggatgcccgcctcttccaggacggtcccatgggactgaaaaaat
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已经如此描述了本发明至少一个实施方案的几个方面，应当理解， 对本领域技术人员而言，可容易地进行各种改动、修改和改进。所述改 动、修改和改进旨在作为本发明公开内容的一部分，并旨在落入本发明 的精神和范围内。因此，前述描述以及附图仅以示例的方式提供。
等同技术方案
仅利用常规实验，本领域技术人员将公认或能够确定本文中所描 述的本发明具体实施方案的许多等同技术方案。这些等同技术方案旨在 包括在下文的权利要求中。
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