书签 分享 收藏 举报 版权申诉 / 19
立即下载 加入VIP,免费下载
当前位置： 首页 >  > 一类基于阳离子螺旋多肽的非病毒基因转染载体材料.pdf

一类基于阳离子螺旋多肽的非病毒基因转染载体材料.pdf

  • 上传人：jo****n
  • 文档编号：9043623
  • 上传时间：2021-02-01
  • 格式：PDF
  • 页数：19
  • 大小：1.05MB
    • 摘要
    申请专利号：

    CN201611136867.5

    		 申请日：

    20161212
    公开号：

    CN106589355A

    		 公开日：

    20170426
    当前法律状态：

    		有效性：

    有效
    法律详情：

    IPC分类号：

    C08G69/48,C07K7/06,A61K47/64,A61K47/69,A61K31/713,A61P35/00,A61P37/02

    		 主分类号：

    C08G69/48,C07K7/06,A61K47/64,A61K47/69,A61K31/713,A61P35/00,A61P37/02
    申请人：

    广州医科大学
    发明人：

    黄玉刚,易玲,叶国东,黄珺珺
    地址：

    511436 广东省广州市番禺区新造镇广州医科大学药学院
    优先权：

    CN201611136867A
    专利代理机构：

    广州市华学知识产权代理有限公司

    		 代理人：

    杨燕瑞;黄磊
    PDF完整版下载： PDF下载
    内容摘要

    本发明属于生物医用高分子材料领域，公开了一类基于阳离子螺旋多肽的非病毒基因转染载体材料及其制备方法和应用。本发明载体材料结构如通式(1)～(6)：相同或不同的，R1为C1～6的烷基、苄基、聚乙二醇单甲醚、聚乙二醇或聚环氧丙烷；R2为C1～3的烷基、苄基或苯乙基；R3为甲基或乙基；R4为羟基；A为H、C1～3的烷基、烷氧基、卤素或硝基；通式(1)～(4)中，x表示多肽的聚合度，x的值不少于5；通式(5)～(6)中，x表示侧链重复单元所占的比例，0<x<1。本发明阳离子螺旋多肽主链呈α‑螺旋构象，有效与DNA和siRNA形成复合胶束，转染效率好，细胞毒性低，可应用于递送pDNA和siRNA。

    权利要求书

    1.一种基于阳离子螺旋多肽的非病毒基因转染载体材料，其特征在于其结构如通式(1)～(6)所示：其中R相同或不同的分别为C1～6的烷基、苄基、聚乙二醇单甲醚、聚乙二醇或聚环氧丙烷；R相同或不同的分别为C1～3的烷基、苄基或苯乙基；R相同或不同的分别为甲基或乙基；R为羟基；A相同或不同的分别为H、C1～3的烷基、烷氧基、卤素或硝基；通式(1)～(4)中，x表示多肽的聚合度，x的值不少于5；通式(5)～(6)中，x表示侧链重复单元所占的比例，0

    说明书

    技术领域

    本发明属于生物医用高分子材料领域，特别涉及一类基于阳离子螺旋多肽的非病毒基因转染载体材料及其制备方法和应用。

    背景技术

    基因疗法是当今兴起的一种治疗肿瘤和多种免疫疾病的最有前景的技术之一。它将基因当做一种“药物”来治疗疾病，是一种先进的治疗方式。这种疗法可以治疗多种严重疾病，包括各种先天遗传性疾病和后天获得性疾病，例如肿瘤、获得性免疫缺陷综合征、心血管疾病、囊泡性纤维症等，其中针对肿瘤的治疗是目前研究的热点。基因治疗有两种方式，一种是用外源基因代替细胞内发生紊乱的基因，或者用外源基因修正问题基因，属于DNA疗法；另一种是以精确和特异性的方式使问题基因表达沉默，属于小干扰RNA(siRNA)疗法。从治疗的基本原理看，无论采用那种方法，都需要将治疗基因无降解地穿过目标细胞膜并最终投送到细胞内。因此，选用合适的载体来保护外源基因，从而将基因高效地投递到目标细胞内是基因治疗法成败的关键。“完美”的基因载体材料要满足以下基本标准：其一，载体不能与血管内皮细胞和血液成分发生相互作用；其二，能够避免被网状内皮组织系统吸收；其三，尺度足够小从而能顺利穿过目标细胞膜并到达细胞核。

    病毒可以满足以上标准，是第一种被用于传递基因的载体，但是缺点太过明显：能引发免疫响应(可能致命)、不能大批量制备、成本高、制备困难、所运载的基因尺寸与病毒通常不匹配。因此，目前的研究目标集中于非病毒类基因载体材料。生理状态下基因带负电荷，因此载体材料通常要求带正电荷，这样静电引力可以自动促成“基因-载体”聚电解质复合胶束的形成，从而达到保护基因的目的。常用的非病毒类载体有阳离子脂质体(例如Lipofectamine)、聚赖氨酸(PLLs)、聚乙烯亚胺(PEI)、树状聚酰胺-胺(PAMAM)，还有磷酸钙颗粒等无机物。除了以上对载体的基本要求外，好的非病毒类载体还要具备二个基本性能：转染效率高和细胞毒性低。阳离子脂质体优点是细胞毒性小，但其分子量小，带正电荷少，负载基因的能力差，保护基因的能力也差，因此稳定性差；PLLs是第一个用于基因转染的聚合物类非病毒载体，缺点是细胞毒性大，另外对DNA的转染能力差；PEI是目前比较流行的高效率转染载体，主要的缺点是分子量大时细胞毒性大、不可生物降解，而分子量小时转染效率又低，这个矛盾是其目前应用的最大障碍；PAMAM和PEI的特点类似，而且制备麻烦，成本高。总体而言，聚合物类非病毒载体材料的分子结构设计灵活，可具备其它载体材料所不能拥有的综合优势，故而是未来发展的目标。因此，设计分子结构合理、采用高效的化学制备技术获得转染效率高、低毒、并有别于传统的PLLs、PEI和PAMAM等聚合物的新型基因转染载体材料无疑是具有创新性的工作。

    N-羧基环内酸酐(NCAs)开环聚合(ROP)法是制备多肽的一种重要方法，和经典的固相肽合成法相比，可以一次性大批量地制备多肽，但得到的多肽主链只含有一种氨基酸单元，因此是均聚多肽。基于NCAs的开环聚合反应将均聚多肽的侧链改性，可以得到结构和功能多样的多肽材料，它们可以作为天然多肽和蛋白质、甚至糖肽的生物仿生体，在组织工程、药物和基因递送领域应用广泛，具有其它合成聚合物所不能拥有的优点(M.A.Quadir,M.Martin,P.T.Hammond,Chemistry of Materials,2014,26,461-476；T.J.Deming,Chemical Reviews,2016,116,786-808)。若将均聚多肽侧链接枝上小分子胺类化合物，便可得到阳离子多肽。PLLs是一类典型的阳离子多肽，但是其侧链质子化的氨基距离主链太近，侧链带正电的氨基之间的静电斥力导致PLLs主链的α-螺旋构象解体，因此，PLLs大分子链通常在酸性条件和生理pH下呈无规线团状，但在碱性条件下又变的疏水。J.Cheng等人(H.Lu,J.Wang,Y.Bai,J.W.Lang,S.Liu,Y.Lin,J.Cheng,Nature Communications,2011,2,1-9)增加侧链质子化氨基与主链的距离，发现侧链的正电荷密度下降，从而不会影响主链构象，这使得多肽继续维持螺旋构象。这种侧链既可以带正电荷，又可以维持非常稳定的螺旋构象的多肽称之为阳离子螺旋多肽(CHPs)。J.Cheng等人(N.P Gabrielson,H.Lu,L.Yin,K.H.Kim,J.Cheng,Molecular Therapy,2012,20,1599-1609)进一步研究发现，CHPs不仅可以模拟天然细胞穿透肽(CPPs)的物理化学性质，还可以模拟CPPs的生物活性。和CPPs一样，CHPs也可以不经过细胞内吞作用携带siRNA进入目标细胞，从而避免了siRNA被溶酶体内的核酸酶降解，既提高了转染效率，又克服了CPPs类基因载体的缺陷。J.Cheng等人(N.P Gabrielson,H.Lu,L.Yin,D.Li,F.Wang,J.Cheng,Angewandte Chemie,2012,124,1169-1173)制备CHPs的基本过程包括四个步骤：首先，合成侧链含苯乙烯结构的L-谷氨酸酯和相应的NCA单体；其次，使NCA单体开环聚合制备侧链含苯乙烯结构的均聚多肽；第三，将侧链苯乙烯的C＝C用臭氧氧化成醛；第四，使侧链醛基和胺类小分子发生还原胺反应，得到CHPs。此制备过程步骤较多，而且使用了连续两次的官能团偶合反应进行侧链改性，效率较低。第三步的侧链氧化和第四步的侧链还原胺反应的时间较长、温度较高、酸度变化大，这些可变因素都有可能导致多肽主链降解。由此鉴之，若在第二步获得多肽后，在温和条件下只使用一步、高效的侧链化学接枝技术制备CHPs，无疑比上述J.Cheng等人的制备方法更有优势。因此，通过这种新的制备方法来获得一类新型的阳离子螺旋多肽类基因转染载体材料，无疑在基因治疗载体领域具有极好的创新性和商业应用潜能。

    发明内容

    为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一类基于阳离子螺旋多肽的非病毒基因转染载体材料。

    本发明另一目的在于提供一种上述基于阳离子螺旋多肽的非病毒基因转染载体材料的制备方法。

    本发明再一目的在于提供上述基于阳离子螺旋多肽的非病毒基因转染载体材料在递送pDNA和siRNA中的应用。

    本发明的载体材料为侧链同时含叔胺和仲胺阳离子结构、并具备α-螺旋构象的水溶性阳离子螺旋多肽(CHPs)。其可有效地与质粒DNA和/或小干扰RNA(siRNA)形成聚电解质纳米复合胶束，可向目标肿瘤细胞内传递外源治疗性基因，转染效率好，而且细胞毒性比聚乙烯亚胺(PEI)载体低。

    本发明的目的通过下述方案实现：

    一种基于阳离子螺旋多肽的非病毒基因转染载体材料，其结构如通式(1)～(6)所示：

    其中R1相同或不同的分别为C1～6的烷基、苄基、聚乙二醇单甲醚、聚乙二醇或聚环氧丙烷；R2相同或不同的分别为C1～3的烷基、苄基或苯乙基；R3相同或不同的分别为甲基或乙基；R4为羟基；A相同或不同的分别为H、C1～3的烷基、烷氧基、卤素或硝基。

    通式(1)～(4)中，x表示多肽的聚合度，x的值不少于5；

    通式(5)～(6)中，x表示侧链重复单元所占的比例，0<x<1。

    本发明的基于阳离子螺旋多肽的非病毒基因转染载体材料，其侧链同时含仲胺和叔胺阳离子，且多肽在生理pH和弱酸性条件下，主链仍呈α-螺旋构象。

    本发明还提供上述基于阳离子螺旋多肽的非病毒基因转染载体材料的制备，包括五步合成反应：(1)合成L-谷氨酸在γ-位的酯化产物；(2)制备N-羧基环内酸酐单体；(3)引发N-羧基环内酸酐单体开环聚合；(4)制备分子结构上同时含仲胺和叔胺的硫醇类小分子铵盐，或分别含仲胺和叔胺的硫醇类小分子铵盐；(5)通过光化学点击技术制备阳离子螺旋多肽。

    具体地，上述制备方法包括以下步骤：

    (1)α,ω-烯醇或α,ω-炔醇、与L-谷氨酸的γ-位羧基发生酯化反应，生成含C＝C键或C≡C键的L-谷氨酸酯；

    (2)所得L-谷氨酸酯和三光气发生闭环反应，生成N-羧基环内酸酐单体；

    (3)利用端伯氨基的分子引发N-羧基环内酸酐单体开环聚合，得到侧链含C＝C键或C≡C键的多肽；

    (4)利用半胱胺盐酸盐，与含叔胺的醛和/或酮的还原胺反应，合成分子结构上同时含仲胺和叔胺的硫醇类小分子铵盐，或分别含仲胺和叔胺的硫醇类小分子铵盐；

    (5)利用“巯基-烯”和“巯基-炔”光化学点击技术，将所得硫醇类小分子铵盐接枝到所述多肽的侧链，得到阳离子螺旋多肽。

    所得的阳离子螺旋多肽可用做非病毒基因转染载体。

    步骤(1)所述的酯化反应在室温下进行即可，或可在20～70℃下进行。

    步骤(2)所述的闭环反应优选在加热回流条件下进行。

    所得的N-羧基环内酸酐单体，其侧链的链端含C＝C键或C≡C键。

    所述的α,ω-烯醇优选为碳链含3～6个碳原子，优选为烯丙醇、3-丁烯-1-醇、4-戊烯-1-醇和5-己烯-1-醇中的至少一种；所述的α,ω-炔醇优选为丙炔醇。

    所用L-谷氨酸和α,ω-烯醇或α,ω-炔醇的摩尔比为1:4～1:7。

    所述的酯化反应采用本领域常规方法即可，也可采用如下方法实现：以强酸做催化剂，将强酸滴加到L-谷氨酸和α,ω-烯醇或α,ω-炔醇的混合物中，反应时间24～72h。所用强酸可为浓硫酸、对甲苯磺酸等，所用强酸的量为氨基酸的1～1.5摩尔当量，优选为1.2摩尔当量。上述制备酯化反应结束后，可用弱碱，包括有机弱碱和无机弱碱中和酸，出现的沉淀物用异丙醇/水混合溶剂重结晶。

    所述的闭环反应可采用四氢呋喃或乙酸乙酯为溶剂，将酯化产物和三光气加入其中加热反应即可。所述闭环反应的温度优选为50～80℃，其中当采用四氢呋喃为溶剂时，加热温度优选为50～55℃。当采用乙酸乙酯为溶剂时，加热温度优选为回流温度。所述闭环反应的时间优选为1～6h。

    所述三光气与酯化产物的摩尔比优选为3:1～3.5:1，更优选为3:1。其中，所述三光气的用量对得到的单体的提纯难易和产率有一定的影响，酯化产物的纯度对于产率也有一定的影响。

    所述闭环反应的产物常温下一般为油状物，反应结束后可采用0.5wt％的碳酸氢钠溶液洗涤，有机相利用干燥剂干燥后，减压除去溶剂得到纯化后的单体，直接用于下一步的聚合反应。

    本发明制备方法中，步骤(1)和(2)的反应过程可如式(一)所示：

    本发明制备方法中，步骤(3)的反应过程可如式(二)所示：

    步骤(3)中所述开环聚合使用的引发剂优选采用端基为伯氨基的引发剂R1-NH2，可为大分子或小分子，利用其引发N-羧基环内酸酐单体开环聚合。所述的聚合反应采用本领域常规方法及条件等即可，如在常温下进行即可，或可在0～30℃下进行，常采用无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂，所述反应的时间常为2天或2天以上，优选为48～120h。所述反应过程中可通入干燥的N2除去副产物CO2。步骤(3)的聚合反应具备活性聚合的特征，其多肽的分子量可通过单体及引发剂的摩尔比控制，优选为10:1～200:1。所述聚合反应结束后反应溶液可利用甲醇或乙醚沉淀，过滤即可得到多肽产物。

    所述的引发剂R1-NH2可为下列化合物中的至少一种：

    所述的引发剂可为正丙胺、正丁胺、正戊胺、正己胺、苄胺、端氨基聚乙二醇单甲醚(mPEG-NH2)、双端氨基聚乙二醇(NH2-PEG-NH2)和聚醚胺(NH2-PPO-NH2)中的至少一种。

    本发明制备方法中，步骤(4)中所述合成得到的分子结构上同时含仲胺和叔胺的硫醇类小分子铵盐的反应过程如式(三)所示：

    所述反应中，所用半胱胺盐酸盐与含叔胺结构的醛和/或酮的摩尔比为1:1～1.5:1。根据式(三)可见，所述反应可采用氰基硼氢化钠为还原剂，其用量与醛和酮的摩尔比为1:1～3:1。所述反应可采用甲醇为溶剂。所述反应可在室温下进行。所述反应的时间优选为12～72h，更优选为24～72h。所述反应过程中可滴加乙酸为催化剂，使反应体系pH维持在6～8。所述反应可通过利用红外光谱监测反应进行的程度，以羰基在1700cm-1左右的特征吸收峰消失为反应完成的标志。结束后用浓盐酸淬灭，过滤掉无机盐，粗产物在甲醇或异丙醇中重结晶。

    所述含叔胺结构的醛或酮可为下列化合物中的至少一种：

    所述含叔胺结构的醛和酮可以为N-甲基-4-哌啶酮、N-乙基-4-哌啶酮、N-丙基-4-哌啶酮、N-异丙基-4-哌啶酮、N-环丙基-4-哌啶酮、N-苯甲基-4-哌啶酮、N-苯乙基-4-哌啶酮、1-苄基-3-哌啶酮、4-二甲氨基苯甲醛、4-二乙氨基苯甲醛、对-N,N-二甲氨基水杨醛或对-N,N-二乙氨基水杨醛。

    本发明对所得到的目标阳离子螺旋多肽的结构要求是其侧链同时含仲胺和叔胺结构。基于此，用于多肽侧链光化学接枝反应的硫醇类小分子铵盐也可以是一种混合物，即步骤(4)所述的合成分别含仲胺和叔胺的硫醇类小分子铵盐，该混合物可由如下所示的两种小分子胺的盐酸盐组成：

    其中，叔胺固定为2-二甲氨基乙硫醇盐酸盐；仲胺分子可根据反应式(三)，由苯甲醛及其衍生物与半胱胺盐酸盐之间的还原胺反应制备。

    步骤(5)中所述的接枝反应为温和、高效的“巯基-炔”或“巯基-烯”(Thiol-Ene和Thiol-Yne)光化学点击反应。步骤(5)中所述的光化学点击反应的过程如式(四)所示。

    所述光化学点击反应具体为：将硫醇类小分子铵盐及步骤(3)的多肽分别溶于DMF或二甲基亚砜(DMSO)中，混合后加入光引发剂，紫外光照射下发生反应。所用光引发剂的量为不包括溶剂在内的所有反应物总质量的5％。所述紫外光的最大吸收波长为365nm。所述照射的时间优选为30～120min。所述反应体系中，所述巯基(-SH)与不饱和C＝C键和C≡C键的摩尔比为1:1～1:4。其中，-SH与C＝C键的摩尔比优选为1:1～1:2，-SH与C≡C键的摩尔比优选为1:2～1:4。所述光照结束后将混合溶液透析至少3天，冻干后得到阳离子螺旋肽，其螺旋构象用圆二色谱(CD)确认。

    步骤(5)中所制备的用于合成阳离子螺旋多肽的前体多肽可以是聚(γ-烯丙基-L-谷氨酸酯)(PALG)、聚(γ-炔丙基-L-谷氨酸酯)(PPLG)、聚(γ-烯丁基-L-谷氨酸酯)(PBLG)、聚(γ-烯戊基-L-谷氨酸酯)(PPELG)、聚(γ-烯己基-L-谷氨酸酯)(PHLG)。它们的特点是在侧链的链端含不饱和的C＝C键或C≡C键。

    所述光引发剂可为安息香双甲醚(Irgacure 651)、1-羟环己基苯酮(Irgacure 184)、2-羟基-2-甲基苯丙酮(Darocur1173)和2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(Irgacure 2959)。

    如上所述，当接枝的硫醇类小分子铵盐是由2-二甲氨基乙硫醇盐酸盐与另外一种硫醇类仲胺盐酸盐所组成的混合物时，则反应得到的阳离子螺旋多肽的结构式如式(五)所示。其中，x表示侧链含2-二甲氨基乙硫醇盐酸盐的重复单元所占的比例，不代表聚合度，0<x<1；其值可由核磁共振氢谱(1H NMR)测得。其中，所用两种胺的比例可根据需要进行调整。

    所述紫外光的光源可为便携式、低功率紫外灯，例如手电筒式LED伍德氏灯、LED紫外固化灯、LED紫外点光源、甚至紫外验钞灯，能量消耗极小，反应条件温和，制备时间大大缩短。

    本发明的基于阳离子螺旋多肽的非病毒基因转染载体材料可应用于递送pDNA和siRNA中，具体为：

    (1)基因/阳离子螺旋多肽纳米复合胶束的制备：分别将基因和本发明载体材料分别溶于水中，配制成水溶液。将两种物质的水溶液混合均匀后用漩涡振荡器振荡10s，在室温条件下放置30min复合，两种物质依靠静电引力作用自动组装成纳米复合物胶束。

    (2)基因/阳离子螺旋多肽纳米复合胶束向Hela细胞中递送基因：向Hela细胞液中加入纳米复合物胶束溶液培养，然后加入由绿色荧光分子标记的siRNA或pDNA。用荧光显微镜观察转染4h后的荧光信号强度。

    本发明方法制备得到的阳离子螺旋多肽其侧链同时含仲胺和伯胺结构，且主链呈稳定的α-螺旋构象，可用于基因转染，有效地与质粒DNA和小干扰RNA(siRNA)形成聚电解质纳米复合胶束，可向目标肿瘤细胞内传递外源治疗性基因，转染效率好，而且细胞毒性比目前流行的聚乙烯亚胺(PEI)载体低。且通过本发明方法可低成本、大批量地制备一类转染效率高、细胞毒性低的非病毒类基因载体，在肿瘤和多种免疫疾病的基因治疗方面有广阔的应用前景。

    附图说明

    图1为实施例1中的聚合物PALG的1H NMR图。

    图2为实施例2中的产物PPAETH的1H NMR图。

    图3为实施例3中的产物PPALG的1H NMR图。

    图4为实施例3中产物PPALG的CD谱(pH＝7.4)。

    图5为实施例4中的PPALG/siRNA复合物胶束的琼脂糖凝胶电泳照片。

    图6为实施例4中的由动态光散射测得的PPALG/siRNA复合物胶束的粒径分布曲线。

    图7为实施例5中的经FAM-siRNA转染4h后的Hela细胞荧光照片。

    图8为实施例6中的PEI(2.5K)和PPALG对Hela的细胞毒性。

    具体实施方式

    下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下列实施例中使用的试剂均可从商业渠道获得。

    实施例1：PALG的合成

    称取L-谷氨酸5g(0.034mol)和丙烯醇8.90g(0.153mol)，混合均匀于烧瓶中，冰浴条件下缓慢滴加4.0g(0.041mol)浓硫酸，30min内滴加完毕。冷却1h后，撤去冰浴升温至室温，继续反应48h。反应结束后向体系中加入足量三乙胺中和，再加入足量丙酮搅拌，过滤出沉淀。沉淀物在真空干燥箱内室温干燥过夜，粗产物用异丙醇/水重结晶，过滤后用足量冷丙酮洗涤，真空干燥。产物γ-烯丙基-L-谷氨酸酯为白色片状结晶，产率47％。

    将1.87g(0.01mol)γ-烯丙基-L-谷氨酸酯悬浮于30mL无水THF中，升温至50℃，此时向反应体系中加入1.0g(0.0033mol)三光气，同时通入氮气，溶液立刻变澄清，继续反应1～1.5h。待冷却后将反应溶液倒入100mL正己烷中，-20℃过夜。倾出上层有机溶液，下层油状物用50mL乙酸乙酯溶解，用50mL质量分数为0.5％的碳酸氢钠冷溶液萃取一次、50mL冷水萃取一次，整个过程温度不得高于5℃，并避免剧烈摇晃。分出有机相，无水硫酸镁干燥过夜，旋蒸除去溶剂后立刻用于下一步聚合，产物为油状单体，产率40％。

    室温条件下，将1.07g(0.005mol)上述油状单体用10mL无水DMF溶解，通氮气鼓泡30min。根据所要求的分子量，称取一定量的正丁胺溶于1mL无水DMF中，用注射器将混合液快速打入反应瓶中，持续通氮气反应72h。结束后将聚合物溶液慢慢滴加到30mL无水乙醚或甲醇中沉淀出聚合物。过滤后50℃下真空干燥，得到蜡状的聚(γ-烯丙基-L-谷氨酸酯)(PALG)，产率72％。1H NMR图见图1，其化学结构式如下式所示：

    实施例2：PPAETH的合成

    将1.41g(0.01mol)N-丙基-4-哌啶酮溶于120mL无水甲醇中，再加入1.70g(0.015mol)半胱胺盐酸盐，使其充分溶解。此时再加入0.94g(0.015mol)氰基硼氢化钠，待完全溶解后再滴入1.5～2.0mL醋酸做催化剂，室温条件下反应72h。反应结束后旋蒸除去溶剂，加入4mL浓HCl淬灭并搅拌1h，旋蒸除掉大部分水。向混合物中倒入热的乙醇溶液，趁热过滤掉无机盐，旋蒸除去乙醇，粗产物在甲醇中重结晶。所得到的硫醇类小分子胺的盐酸盐为白色颗粒状，命名为PPAETH，产率34％。1H NMR图见图2，其化学结构式如下式所示：

    实施例3：PPALG的合成

    称取0.1g(0.59mmol C＝C键)实施例1中得到的聚合物PALG溶于3mL DMF中，制成溶液一；再将0.18g(0.65mmol-SH)实施例2中得到的PPAETH溶于最少量的甲醇/水混合溶液中，制成溶液二；向溶液一中加入占所有反应物总质量5％的光引发剂Irgacure 651，待其溶解后开启最大吸收波长为365nm的手电筒式伍德氏灯，然后缓慢滴加溶液二，1h内滴加完毕。继续光照30min，再补加3mL DMF，再继续光照30min后结束反应，将最后的混合溶液用截留分子量为3500的透析袋透析。第1天每隔4h换一次蒸馏水，第2天每隔12h换一次乙醇溶液以除掉光引发剂，之后继续用蒸馏水透析1天，冻干。产物为白色絮状物，命名为PPALG，用1H NMR测定接枝率超过80％，产率为64％。1H NMR图见图3，CD图见图4，其化学结构式如下式所示：

    实施例4：PPALG/siRNA纳米复合物胶束的制备

    将实施例3中得到的PPALG溶解于去离子水中，配成浓度为3.0μg/μL的阳离子螺旋多肽母液一；将siRNA溶于去离子水配成浓度为0.26μg/μL的母液二。分别按照PPALG:siRNA一定的质量比，将适量体积的母液一和5μL母液二混合，漩涡振荡器振荡30s以混合均匀，最后取适量的去离子水将混合液稀释至总体积为20μL，室温孵育30min以使PPALG和基因完全复合，其中siRNA的质量固定。将PPALG/siRNA复合物溶液以溴化乙锭为染色剂、在100V条件下电泳(1％琼脂糖)30min后，用凝胶成像系统观察并拍照，结果见图5。同时按照上述PPALG/siRNA复合物溶液的配制方法，取12μL体积的siRNA的母液，按PPALG:siRNA质量比为8:1配制50μL的复合物溶液。待复合完全后加入去离子水稀释至总体为2.0mL，用粒径分析仪分析复合物胶束的粒径大小，结果见图6。

    实施例5：用PPALG载体向Hela内递送siRNA

    设定PPALG:siRNA质量比为8:1，在24孔板上每孔转40pmol由羧基荧光素FAM标记的siRNA(FAM-siRNA)。将Hela细胞用FAM-siRNA转染4h后，用荧光显微镜观察绿色FAM-siRNA的信号以确定转染效率，阳性细胞发出绿色荧光，而阴性细胞则无，荧光显微镜照片见图7。

    实施例6：PPALG和PEI(2.5k)的细胞毒性评估

    将Hela细胞种于96孔板，每孔约9000个(浓度90000个/mL)。24h后，当融合率达到70～80％时，吸出96孔板的培养基，分别将PPALG、PEI和阳性对照按照不同的浓度梯度给药，每孔100mL。24h后，向每孔加20μL的MTS，约2h以后用酶标仪测定在490nm处的OD值，平行测定五次，结果见图8。

    上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

    举报
    举报     版权申诉
    版权申诉     PDF格式文档无特别注明外均可编辑修改；预览文档经过压缩，下载后原文更清晰！ 立即下载
    关 键  词：
    一类 基于 阳离子 螺旋 多肽 病毒 基因 转染 载体 材料
      专利查询网所有文档均是用户自行上传分享，仅供网友学习交流，未经上传用户书面授权，请勿作他用。
    0条评论

    还可以输入200字符

    暂无评论，赶快抢占沙发吧。

    关于本文
    本文标题：一类基于阳离子螺旋多肽的非病毒基因转染载体材料.pdf
    链接地址：https://www.zhuanlichaxun.net/p-9043623.html
    关于我们 - 网站声明 - 网站地图 - 资源地图 - 友情链接 - 网站客服 - 联系我们

    copyright@ 2017-2018 zhuanlichaxun.net网站版权所有
    经营许可证编号:粤ICP备2021068784号-1