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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610177383.9 (22)申请日 2016.03.25 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/32(2006.01) (71)申请人 苏州达麦迪生物医学科技有限公司 地址 215163 江苏省苏州市高新区锦峰路 8 号医疗器械产业园 1 号楼 501 (72)发明人 方国伟 洪冉 (74)专利代理机构 广州三环专利代理有限公司 44202 代理人 郝传鑫 (54) 发明名称 一种快速检测利福平耐药结核分枝杆菌的分 子信标探针和试剂盒 (。
2、57) 摘要 本发明提供了一种快速检测利福平耐药结核 分枝杆菌的分子信标探针， 所述分子信标探针包 括Beacon ROPB1、 Beacon ROPB2和Beacon ROPB3。 本发明通过三条分子信标探针信号协同作用， 分 别以结核分枝杆菌的 ropB 基因为靶点， 从而检测 利福平耐药结核分枝杆菌。本发明中的探针荧光 强度高， 特异性强， 可以有效、 快速地检测利福平 耐药结核分枝杆菌。本发明还公开了一种快速 检测利福平耐药结核分枝杆菌的试剂盒及检测方 法。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 CN。
3、 105695599 A 2016.06.22 CN 105695599 A 1.一种快速检测利福平耐药结核分枝杆菌的分子信标探针， 其特征在于， 所述分子信 标探针包括BeaconROPB1、 BeaconROPB2和BeaconROPB3， 所述BeaconROPB1的碱基序列 如SEQIDNO.1所示， 所述BeaconROPB2的碱基序列如SEQIDNO.2所示， 所述Beacon ROPB3的碱基序列如SEQIDNO.3所示。 2.根据权利要求1所述的分子信标探针， 其特征在于， 所述BeaconROPB1、 Beacon ROPB2和BeaconROPB3的5 端用相同的荧光基团标。
4、记， 所述BeaconROPB1、 BeaconROPB2 和BeaconROPB3的3 端用相同的荧光淬灭基团标记。 3.根据权利要求2所述的分子信标探针， 其特征在于， 所述荧光基团为FITC、 FAM和Cy3 中的一种， 所述荧光淬灭基团为DABCYL、 BDH、 BHQ1和TANRA中的一种。 4.根据权利要求3所述的分子信标探针， 其特征在于， 所述荧光基团为Cy3， 所述荧光淬 灭基团为BHQ1。 5.一种快速检测利福平耐药结核分枝杆菌的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括重 悬液， 杂交液， 洗涤液和如权利要求1-4任一所述的分子信标探针。 6.根据权利要求5所述的试剂盒， 其。
5、特征在于， 所述分子信标探针中BeaconROPB1、 BeaconROPB2和BeaconROPB3的使用浓度均为10nM。 7.根据权利要求5所述的试剂盒， 其特征在于， 所述重悬液包括： 0.1-0.5M乙酸铵和5 50mMTris-HCl， pH值为47； 所述杂交液包括： 520(w/v)硫酸葡聚糖， 1001000mM焦磷酸钠， 0.010.5聚 蔗糖， 0.010.5聚乙烯吡咯烷酮， 0.010.5聚乙二醇， 1040(v/v)去离子甲 酰胺， 5mMNa2EDTA， 0.011(v/v)TritonX-100和5200mMpH7.5的Tris-HCl； 所述洗涤液包括： 550。
6、mMTris， 10100mMNaCl， 0.010.2(v/v)TritonX-100和 0.010.2(v/v)SDS， pH值为610。 8.一种快速检测利福平耐药结核分枝杆菌的方法， 其特征在于， 所述方法是采用如权 利要求1-4任一所述的分子信标探针进行检测的。 9.一种快速检测利福平耐药结核分枝杆菌的方法， 其特征在于， 所述方法是采用如权 利要求5-7任一所述的试剂盒进行检测的。 10.根据权利要求9所述的方法， 其特征在于， 所述方法包括以下步骤： (1)吸取1mL待测样本， 12000rpm离心1分钟， 弃上清， 50 L重悬液重悬沉淀； (2)吸取10 L重悬后的样本滴在载。
7、玻片上， 50以上温度烘干， 使样本中细菌固定在载 玻片上； (3)将载玻片浸入无水乙醇中， 浸泡5分钟； (4)在样本上加入20 L杂交液， 以及BeaconROPB1、 BeaconROPB2和BeaconROPB3， 所 述BeaconROPB1、 BeaconROPB2和BeaconROPB3的终浓度均为10nM， 置于杂交仪上4258 杂交10分钟； (5)在4258下用洗涤液洗涤样本1分钟； (6)将样本烤干后滴加封片剂后， 用荧光显微镜镜检， 用10物镜扫视和计数， 用40 或100物镜观察细菌形态。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105695599 A 2 一种快速检测利福。
8、平耐药结核分枝杆菌的分子信标探针和试 剂盒 技术领域 0001 本发明涉及一种分子信标探针， 具体涉及一种快速检测利福平耐药结核分枝杆菌 的分子信标探针和试剂盒。 背景技术 0002 根据中国卫生部组织的第四次全国结核病流行病抽样调查(2000年)得出的结果， 我国有4亿人感染过结核菌， 现有的传染性结核病人达200万人， 结核病的人数位居世界第 二， 仅次于印度。 耐药结核病的发生和流行是当今及今后一段时间内结核病防治工作的难 题和最大挑战。 随着分子生物学技术的发展和结核菌对抗结核药物耐药机制在基因水平的 逐渐阐明， 建立分子生物学的检测耐药方法可提高检测的速度。 尽快初筛耐药结核病人和 。
9、制定最佳治疗方案， 防止耐药菌株在人群中的扩散， 降低原发性耐药， 是临床上迫切需要解 决的问题。 0003 利福平是主要的抗结核一线药物， 利福平通过与结核分枝杆菌RNA聚合酶亚单位 相结合， 干扰结核分枝杆菌RNA的合成， 从而达到抗菌的效果。 结核分枝杆菌RNA聚合酶亚单 位由ropB基因编码， 95以上利福平耐药结核分枝杆菌都与ropB基因的突变有关。 0004 当前临床上检测利福平耐药结核分枝杆菌常用的方法有细菌培养法和PCR法。 其 中细菌培养法是检测利福平耐药结核分枝杆菌的金标准， 但该方法需要进行药敏实验， 通 常需要15-20天才能看到最终的检测结果， 检测成本高、 检测周期。
10、长； 利用PCR方法可在短时 间内使特定的核酸序列拷贝数几何级数增加， 有很高的灵敏度和特异性， 但缺点是假阳性 率高， 另一方面， 样本中有往往含有抑制PCR反应的成分， 这又会导致假阴性的出现， 这两方 面的缺点限制了PCR检测的临床应用。 由此可见， 利福平耐药结核分枝杆菌感染的临床诊 断， 急需更简洁、 灵敏的检测方法。 0005 分子信标探针(Molecularbeaconprobe)， 具有灵敏度高、 特异性强、 只有和靶序 列杂交上了才会发出荧光等优点， 被应用于荧光原位杂交。 本发明通过对大量利福平耐药 结核分枝杆菌和非耐药菌株的基因序列进行比对， 挑选利福平耐药结核分枝杆菌特。
11、有的基 因ropB基因作为检测靶点， 并针对该靶位点设计、 合成三条分子信标探针(BeaconROPB1, BeaconROPB2和BeaconROPB3)， 通过这三条探针的联合作用， 提高检测的荧光信号强度， 达到检测利福平耐药结核分枝杆菌的效果。 本发明还建立了稳定的分子信标原位杂交检测 利福平耐药结核分枝杆菌的反应体系， 克服了利福平耐药结核分枝杆菌当前临床检测的诸 多问题， 为利福平耐药结核分枝杆菌感染的诊断、 预防和控制提供新的检测方法。 发明内容 0006 本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了一种快速检测利福平 耐药结核分枝杆菌的分子信标探针、 试剂盒和方法。 00。
12、07 为实现上述目的， 所采取的技术方案： 一种快速检测利福平耐药结核分枝杆菌的 说明书 1/5 页 3 CN 105695599 A 3 分子信标探针， 所述分子信标探针包括BeaconROPB1、 BeaconROPB2和BeaconROPB3， 所 述BeaconROPB1的碱基序列如SEQIDNO.1所示， 所述BeaconROPB2的碱基序列如SEQ IDNO.2所示， 所述BeaconROPB3的碱基序列如SEQIDNO.3所示。 0008 本发明的 技术要点或原理 ： 荧光原位杂交( Flourescenceinsitu Hybridization， FISH)是一种应用标记有荧。
13、光物质的探针， 通过杂交的方法来检测细胞或 组织内特异性DNA或RNA的方法； 分子信标探针是一种具有独特 “发夹” 空间结构的探针， 在 未与靶序列结合时， 分子信标呈 “发夹” 结构， 有一环序列(loop)和一茎序列(stem)， 其中环 序列是与靶位点互补的碱基序列， 而茎序列是与靶位点无关的互补序列； 在探针的两端分 别标记有荧光基团和荧光猝灭基团， 当探针处于发卡结构时， 荧光基团和猝灭基团相邻， 产 生能量共振转移效应， 使得荧光基团被猝灭， 不能产生荧光信号， 而当探针与靶位点结合 时， 发夹结构被打开， 荧光基团和猝灭基团分开， 产生荧光信号， 通过荧光显微镜可以检测 到该荧。
14、光信号。 0009 本发明通过对大量利福平耐药结核分枝杆菌和非耐药结核菌株的基因序列进行 比对， 挑选利福平耐药结核分枝杆菌最常见的ropB突变基因作为检测靶点， 并针对该靶位 点设计、 合成三条分子信标探针(BeaconROPB1,BeaconROPB2和BeaconROPB3)。 0010 优选地， 所述BeaconROPB1、 BeaconROPB2和BeaconROPB3的5 端用相同的荧光 基团标记， 所述BeaconROPB1、 BeaconROPB2和BeaconROPB3的3 端用相同的荧光淬灭基 团标记。 0011 优选地， 所述荧光基团为FITC、 FAM和Cy3中的一种，。
15、 所述荧光淬灭基团为DABCYL、 BDH、 BHQ1和TANRA中的一种。 ， 荧光基团或荧光猝灭基团可以根据现有技术进行添加。 0012 优选地， 所述荧光基团为Cy3， 所述荧光淬灭基团为BHQ1。 在这里BeaconROPB1： 5 -CY3-CACTGCCACTCCTACCAACGTTCCAGTG-BHQ1-3 ； BeaconROPB2： 5 -CY3- CACTGG CTCCG AAG AG AAAG CCCAG TG - BHQ1 -3 ； Bea conRO PB3 ： 5 -CY3- CACTGCTAACATGTGTTAATTACTCCAGTG-BHQ1-3 ； 所述CY3。
16、荧光基团激发波长为552nm， 检测波 长为570nm。 0013 本发明提供了一种快速检测利福平耐药结核分枝杆菌的试剂盒， 所述试剂盒包括 重悬液， 杂交液， 洗涤液和上述所述的分子信标探针。 0014 优选地， 所述分子信标探针中BeaconROPB1、 BeaconROPB2和BeaconROPB3的使 用浓度均为10nM。 0015 优选地， 所述重悬液包括： 0.10.5M乙酸铵和550mMTris-HCl， pH值为47； 0016 所述杂交液包括： 520(w/v)硫酸葡聚糖， 1001000mM焦磷酸钠， 0.01 0.5聚蔗糖， 0.010.5聚乙烯吡咯烷酮， 0.010.5。
17、聚乙二醇， 1040(v/v)去 离子甲酰胺， 5mMNa2EDTA， 0.011(v/v)TritonX-100和5200mMpH7.5的Tris-HCl； 0017 所述洗涤液包括： 550mMTris， 10100mMNaCl， 0.010.2(v/v)TritonX- 100和0.010.2(v/v)SDS， pH值为610。 0018 本发明提供了一种快速检测利福平耐药结核分枝杆菌的方法， 所述方法是采用上 述所述的分子信标探针进行检测的。 0019 本发明提供了一种快速检测利福平耐药结核分枝杆菌的方法， 所述方法是采用上 述所述的试剂盒进行检测的。 说明书 2/5 页 4 CN 1。
18、05695599 A 4 0020 优选地， 所述方法包括以下步骤： 0021 (1)吸取1mL待测样本， 12000rpm离心1分钟， 弃上清， 50 L重悬液重悬沉淀； 0022 (2)吸取10 L重悬后的样本滴在载玻片上， 50以上温度烘干， 使样本中细菌固定 在载玻片上； 0023 (3)将载玻片浸入无水乙醇中， 浸泡5分钟； 0024 (4)在样本上加入20 L杂交液， 以及BeaconROPB1、 BeaconROPB2和Beacon ROPB3， 所述BeaconROPB1、 BeaconROPB2和BeaconROPB3的终浓度均为10nM， 置于杂交仪 上4258杂交10分钟。
19、； 0025 (5)在4258下用洗涤液洗涤样本1分钟； 0026 (6)将样本烤干后滴加封片剂后， 用荧光显微镜镜检， 用10物镜扫视和计数， 用 40或100物镜观察细菌形态。 0027 本发明通过大量实验， 确定荧光原位杂交的最佳温度为42-58， 甲酰胺最佳浓度 为10-40， 分子信标最佳浓度为10nM。 0028 本发明的分子信标探针能够用于检测的样本范围广泛， 包括但不限于： 血液、 体 液、 脓液、 尿液、 组织切片、 食物样本、 来自土壤、 空气和水的样本， 以及它们的培养物。 这些 样本经相应处理后， 原则上是只要保持细胞形态完整并且靶核酸未被破坏， 均可使用本发 明的分子。
20、信标探针检测。 这些样本的处理方法是本领域技术人员所掌握的。 0029 本发明的有益效果在于： 本发明提供了一种快速检测利福平耐药结核分枝杆菌的 分子信标探针， 本发明的通过三条分子信标探针信号协同作用， 分别以结核分枝杆菌的 ropB基因为靶点， 从而检测利福平耐药结核分枝杆菌。 当本发明所述的BeaconROPB1、 BeaconROPB2和BeaconROPB3联合使用时， 可以达到较好的荧光信号强度， 并且特异性高， 可以有效、 快速地检测利福平耐药结核分枝杆菌。 具体实施方式 0030 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述， 但下列实施例仅用于说明 本发明， 而不应视为限定。
21、本发明的范围。 实施例中未注明具体条件者， 按照常规条件或制造 商建议的条件进行。 所用试剂或仪器未注明生产厂商者， 均为可以通过市购获得的常规产 品。 0031 实施例1： 分子信标探针及寡聚核苷酸序列的设计与合成 0032 选择出能特异性地检测利福平耐药结核分枝杆菌的ropBABC操纵子基因序列， 在 这些基因序列上根据热力学特征和高级结构， 设计与其完全互补的分子信标探针： 0033 BeaconROPB1： 0034 5 -CY3-CACTGCCACTCCTACCAACGTTCCAGTG-BHQ1-3 ； 0035 BeaconROPB2： 0036 5 -CY3-CACTGGCTCC。
22、GAAGAGAAAGCCCAGTG-BHQ1-3 ； 0037 BeaconROPB3： 0038 5 -CY3-CACTGCTAACATGTGTTAATTACTCCAGTG-BHQ1-3 。 0039 所述探针的5 端用CY3标记， 3 端用BHQ1标记， 荧光基团激发波长552nm。 0040 探针最末端的十个碱基互补(上述粗体中位于同一条链上的十个碱基)， 使得探针 说明书 3/5 页 5 CN 105695599 A 5 可以形成颈环结构， 且不会与探针本身形成高级结构。 0041 实施例2： 三种方法检测痰样本的对比试验 0042 1、 罗氏培养法 0043 选用改良的Lowenst。
23、ein-Jensen培养基,将处理过的痰液进行培养。 具体为取痰标 本ImL加入4氢氧化钠2mL， 涡旋震荡30秒混匀， 室温静置20min， 其间振荡23次， 促痰液 化。 以灭菌刻度毛细吸管取0.1mL消化后痰液， 平行地接种无抗和利福平抗性的培养基斜面 上， 放37培养箱内培养。 接种后第3天和第7天观察培养的情况， 之后每周观察1次， 直到第 8周末。 若出现培养阳性则随时报告， 培养至8周未见细菌生长， 报告为培养阴性。 0044 2、 PCR法检测 0045 用细菌基因组DNA提取试剂盒(HYQ)提取样本中的细菌DNA， 利福平耐药结核分枝 杆菌特异性引物， 荧光定量PCR检测。 。
24、以无菌水为阴性对照， CT值比阴性对照小10及以上的 视为阳性。 0046 3、 分子信标探针FISH检测 0047 检测试剂盒包括： 0048 (1)杂交液： 110(w/v)硫酸葡聚糖， 1001000mMNaCl， 1040(v/v)去离子 甲酰胺， 5mMNa2EDTA， 0.011(v/v)TritonX-100， 5200mMpH7.5的Tris-HCl； 0049 (2)BeaconROPB1、 BeaconROPB2和BeaconROPB3各10nM， 所述分子信标探针的碱 基序列为： 0050 BeaconROPB1： 0051 5 -CY3-CACTGCCACTCCTACC。
25、AACGTTCCAGTG-BHQ1-3 ； 0052 BeaconROPB2： 0053 5 -CY3-CACTGGCTCCGAAGAGAAAGCCCAGTG-BHQ1-3 ； 0054 BeaconROPB3： 0055 5 -CY3-CACTGCTAACATGTGTTAATTACTCCAGTG-BHQ1-3 ； 0056 (3)洗涤液： 550mMTris， 10100mMNaCl， 0.010.2(v/v)TritonX-100， 0.010.2(v/v)SDS， pH值为610。 0057 使用上述试剂盒快速检测利福平耐药结核分枝杆菌的方法， 包括如下步骤： 0058 (1)吸取10 。
26、L样品滴在载玻片上， 50及以上温度烘干， 使样品中细菌固定在玻片 上； 0059 (2)将载玻片浸入无水乙醇中， 浸泡5分钟； 0060 (3)在样本上加入20 L杂交液， 以及BeaconROPB1、 BeaconROPB2和Beacon ROPB3， 所述BeaconROPB1、 BeaconROPB2和BeaconROPB3的终浓度均为10nM， 置于杂交仪 上4258杂交10分钟； 0061 (4)在4258下用洗涤液洗涤样本1分钟； 0062 (5)将样本烤干后滴加封片剂后， 用荧光显微镜镜检， 用10物镜扫视和计数， 用 40或100物镜观察细菌形态。 0063 在荧光显微镜下，。
27、 利福平耐药结核分枝杆菌发红色荧光。 0064 按照下列标准报告镜检结果： 0065 耐药结核分枝杆菌阴性(-)： 连续观察50个视野， 未发现分枝杆菌。 说明书 4/5 页 6 CN 105695599 A 6 0066 耐药结核分枝杆菌阳性(报告杆菌数)： 1-9条/50视野。 0067 耐药结核分枝杆菌阳性(1+)： 10-99条/50视野。 0068 耐药结核分枝杆菌阳性(2+)： 1-9条每视野。 0069 耐药结核分枝杆菌阳性(3+)： 10-99条每视野。 0070 耐药结核分枝杆菌阳性(4+)： 100条每视野。 0071 4、 三种检测方法的结果及分析 0072 采用培养法、。
28、 PCR法、 本发明方法三种方法对97份临床样本的进行检测(将97份临 床样本的检测结果分为8种情形)， 检测结果如表1所示： 0073 表1三种方法检测的结果 0074 0075 0076 以培养法为金标准， PCR法的阳性检出率为(67+4)/(67+11+4+2)100 84.5， 本发明方法的阳性检出率为(67+11)/(67+11+4+2)10092.8； PCR的假阳性 率为(10+14)/(10+14+5+79)10022.2， 本发明方法的假阳性率为(10+5)/(10+14+5 +79)10013.9。 0077 本发明所述的分子信标探针FISH检测利福平耐药结核分枝杆菌， 。
29、与PCR法相比， 阳 性检测率达到了培养法的92.8， 高于后者(84.5)； 同时假阳性率为13.9， 也低于后者 的22.2。 与培养法相比， 不论阳性检测率和假阳性率都很接近， 而操作上远远比培养法简 便快捷， 大大提高了检测效率。 0078 最后所应当说明的是， 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保 护范围的限制， 尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明， 本领域的普通技术人员应当 理解， 可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质 和范围。 说明书 5/5 页 7 CN 105695599 A 7 苏州达麦迪生物医学科技有限公司 一种快速检测利福平耐药结核分枝杆菌的分子信标探针和试剂盒 3 PatentInversion3.3 1 28 DNA 人工序列 1 cactgccactcctaccaacgttccagtg28 2 27 DNA 人工序列 2 cactggctccgaagagaaagcccagtg27 3 30 DNA 人工序列 3 cactgctaacatgtgttaattactccagtg30 序列表 1/1 页 8 CN 105695599 A 8 。